Modelo Spinotrapezius murino para avaliar o impacto da ligadura arteriolar em função microvascular e Remodelação

A doença vascular periférica afeta aproximadamente 12 a 14% da população e é especialmente comum entre usuários de tabaco e indivíduos com diabetes, obesidade, hipertensão, estágio avançado ou aterosclerose. O objetivo desta cirurgia é produzir um modelo para isquemia do músculo esquelético ligando uma das três artérias alimentadoras à metade do músculo espinotrapézio espelhado. Esta animação mostra a localização generalizada dessas artérias e indica o local de ligadura pretendido em resposta à isquemia.

O tecido vascular sofrerá alterações características da agenesia arterio, dependendo da cepa do camundongo. Isso inclui a formação de colaterais em ponte ou o aumento da tortuosidade da embarcação. Também mostraremos como realizar um procedimento de vasodilatação funcional no trapézio espinhal usando microscopia intravital.

Isso envolve expor o músculo com cuidado, colocar os eletrodos estimulantes com sua fonte de energia e controlador e, em seguida, configurar o dispositivo de imagem. Por último, mostraremos como extirpar o músculo e descreveremos um processo de fixação adequado para coloração imunoquímica e imagem. Olá, meu nome é Shane Pierce Kotler e sou professor associado do Departamento de Engenharia Biomédica da Universidade da Virgínia em Charlottesville.

Olá, sou Kyle Martin. Eu sou um estudante de pós-graduação no laboratório de Shane e estarei atuando no modelo de ligadura do trapézio espinhal. Nosso laboratório estuda o crescimento e a remodelação microvascular, particularmente nos cenários de doenças isquêmicas, como doenças cardíacas, doenças arteriais periféricas e derrames.

Desenvolvemos este modelo de ligadura do trapézio espinhal espelhado para estudar como a obstrução localizada do fluxo sanguíneo arterial gera adaptações estruturais nas redes microvasculares a jusante. Vemos este modelo como sendo complementar ao modelo de isquemia de membros posteriores bem estabelecido e amplamente utilizado, pois oferece uma visão de toda a rede de FFAs de arter, neurogênese e angiogênese em um músculo muito fino que não requer secção histológica para análise. Como esse músculo é tão fino e como a ligadura cria uma redução reprodutível no fluxo sanguíneo, podemos visualizar os efeitos da ligadura arterial em todo o leito microvascular e com um único nível de resolução celular.

Depois que Kyle nos guiar pelo procedimento passo a passo para realizar o modelo de ligadura do trapézio espino, nossos colaboradores da Cal Poly nos mostrarão como eles usam esse modelo para estudar a vasodilatação funcional. Assim que virmos isso, vamos trazê-lo de volta à Universidade da Virgínia e colher o trapézio da coluna, o que precisa ser feito antes da imagem e coloração. Olá, meu nome é Trevor Cardinal.

Sou professor assistente no Departamento de Engenharia Biomédica da Cal Poly State University em San Luis Obispo, Califórnia, e meu nome é Josh Cutz. Sou estudante de mestrado em engenharia biomédica na Cal Poly em San Luis Obispo. O principal interesse de nosso laboratório de pesquisa é entender o impacto da isquemia crônica, como ocorre com a doença periférica dos AVs, nas capacidades funcionais da vasculatura de resistência.

Assim, após a cirurgia de ligadura da artéria de alimentação do trapézio espinhal ser realizada, Josh demonstrará o procedimento de vasodilatação funcional usado em nosso laboratório. Em nosso laboratório, usamos o procedimento de vasodilatação funcional para examinar o efeito da oclusão arterial na reatividade vascular e nos instrumentos de controle do fluxo sanguíneo. Para preparar de antemão, inclua sutura de localização de 10 nós, uma sutura de fechamento, um porta-agulha, tesoura de íris, pinça padrão, tesoura de mola e uma micro sonda dobrada.

Depois de preparar os instrumentos cirúrgicos anestesiar o mouse, aqui usamos a fórmula de exibição e a dosagem. Confirme a anestesia com o dedo do pé, teste de reflexo de pinça e, em seguida, aplique IGEL protetor usando uma forma de barbeador elétrico, uma grande mancha de pelo nas costas do animal. Embora a ligadura do trapézio espinhal exija apenas uma pequena área a ser limpa perto da omoplata, a coleta de tecido do trapézio espinhal a ser realizada dentro de alguns dias exigirá uma superfície limpa muito maior.

Afaste o excesso de pelos e aplique o creme depilatório seguindo as instruções do fabricante. Lave as costas com uma esponja molhada. Em seguida, aplique três conjuntos de lenços umedecidos com álcool alternado terminando com Betadine odina.

Em boas condições de iluminação, o melhor local de incisão pode ser encontrado pela identificação transdérmica do coxim adiposo dorsal. Uma vez que a artéria alimentadora atravessa eventualmente o músculo trapézio espinhal abruptamente, a borda da almofada de gordura do mimo cobre a pele neste local e traz uma tesoura de íris diretamente de cima perpendicular ao dorsal do animal e corta para fazer uma incisão linear de três a cinco milímetros. Se a iluminação ou a pigmentação da pele não permitirem a identificação transdérmica.

Coloque a incisão cinco milímetros na proeminência óssea da omoplata, estenda a incisão através das camadas da pele e expanda lateralmente conforme necessário para encontrar o trapézio espinhal. Disseque a fáscia sobrejacente para acessar o local da ligadura. Se um vaso de superfície estiver danificado e houver hemorragias como neste caso, deixe o sangramento parar e aplique pressão, se necessário, use solução salina para evitar a dessecação.

A artéria indicada fica ao longo do aspecto dorsal do trapézio espinhal e, em seguida, atravessa o músculo e entra na almofada de gordura ventral. Encontre a borda lateral do trapézio espinhal e reflita-a, levantando-a de modo a quase invertê-la. Isso revela seu aspecto ventral e o local transversal da artéria disseca o coxim adiposo ventral que obscurece o vaso.

Tenha cuidado com a pressão da pinça para evitar ferimentos por esmagamento. Aqui o cirurgião indica a artéria trapézio espinhal a ser ligada. Observe a presença de pares de veias vasodilatadores, como adenosina de ação mais curta ou papina de ação mais longa, pode ser aplicada.

Nesse caso, a artéria fica entre dois outros vasos, conforme indicado pelas setas. Um é semelhante em tamanho à artéria e seria visto mais lateralmente se o músculo não fosse refletido, enquanto o outro é muito maior e ficaria mais imediatamente. Os dois locais de ligação são marcados por ai.

A primeira ligadura é colocada na direção a jusante em relação à segunda. Isso garante que o vaso ainda esteja cheio de sangue e visível durante a colocação da segunda ligadura. A indica a região a ser seccionada.

Observe o local B, onde a artéria e sua veia emparelhada entraram na almofada de gordura ventral delineada por C. Isso nos permite saber que o segundo vaso menor é uma veia. Observe também o próprio músculo trapézio da arte espinhal delineado por D. Algumas dicas para discriminar a artéria da veia são fornecidas no protocolo de texto que acompanha. Mas, resumidamente, nosso método preferido é obstruir o fluxo sanguíneo aplicando pressão com uma microssonda.

Se o vaso for uma artéria, o fluxo será obstruído na direção a jusante em direção à aplicação do músculo refletido. A técnica aqui exclui o vaso maior. Se necessário, use a microssonda dobrada de 80 graus para separar a artéria dos outros vasos.

Isso é feito perfurando o tecido conjuntivo embaixo do vaso e fazendo movimentos laterais curtos para expandir uma lacuna. Até que a sonda possa ser facilmente passada pela agulha de sutura, agora pode ser mais facilmente enfiada sob a artéria. Nesse caso, uma pequena veia foi cortada, causando um pequeno sangramento.

Este vaso fica longe o suficiente da zona isquêmica para ter um impacto mínimo. No procedimento, dê um único nó de cirurgião e prepare a próxima sutura. Novamente, passando pela lacuna pré-fabricada e dando o nó de outro cirurgião alguns milímetros a montante da ligadura anterior.

Lembre-se de que o músculo é refletido e a direção do fluxo pode ser oposta à esperada. Depois que ambas as ligaduras forem colocadas, procure evidências de uma coluna de glóbulos vermelhos obstruída. Se o fluxo não tiver sido interrompido, outra ligadura é necessária.

Caso contrário, faça o transeccionamento do vaso entre as ligaduras, observando se ocorrer algum sangramento, neste caso a ligadura foi bem-sucedida e nenhuma hemorragia arterial é observada. Um método alternativo emprega uma única ligadura e transecção na direção a jusante. Consulte a literatura que acompanha o documento para saber quando esse método é preferido.

Restaure o músculo à sua orientação original, reposicione o tecido adiposo deslocado e a fáscia e feche com uma sutura não reabsorvível. Finalmente, coloque o camundongo em uma gaiola de recuperação aquecida sob observação e analgésico para microscopia intravital do espino trapézio. O camundongo é primeiro anestesiado com flúor em uma câmara de indução e, em seguida, conectado ao fluxo contínuo de flúor através de um cone nasal.

Insira a sonda de temperatura retal e ajuste o controlador térmico para 35 graus C Os instrumentos a serem preparados com antecedência incluem tesoura de íris, pinça padrão, tesoura de mola e um cotonete PBS umedecido. Faça uma incisão na pele na extremidade do trapézio espinhal usando uma tesoura de íris e uma pinça patente padrão. Estenda a incisão cranial até a almofada de gordura, criando uma incisão em ferradura e cubra a aba de pele com invólucro plástico para evitar a dessecação contundente, disseque o tecido conjuntivo subcutâneo com pinças finas para maximizar a visibilidade.

Coloque eletrodos estimulantes, mantendo-os o mais próximo possível para minimizar o tamanho do campo de corrente, posicione-os na extremidade do músculo exposto apenas lateralmente à coluna. Ancore com argila. Realize um teste de estimulação para confirmar a colocação do eletrodo usando um sistema de aquisição de dados de laboratório de potência, estímulo, isolador e software de gráfico de laboratório configurado para ondas quadradas de 200 microssegundos de duração, amplitude de dois miliamperes e entregue a um hertz.

Cubra o músculo exposto com filme plástico novamente. Para evitar a dessecação, aguarde 30 minutos por diâmetro de vaso para equilibrar e, em seguida, capture sua imagem ou vídeo. Posicione o microscópio intravital sobre o músculo trapézio espinhal para visualizar a arquitetura da vasculatura.

Se estiver usando uma lente de imersão, coloque uma gota de PBS entre a objetiva e o filme plástico começando acima da artéria principal, que é o maior vaso visível. Manipule o estágio no plano XY para localizar a embarcação de interesse. Estimule o músculo com ondas quadradas da duração e amplitude anteriores, mas entregues a oito hertz e por 90 segundos imediatamente após a estimulação.

Faça uma imagem do vaso e continue a fazê-lo a cada minuto até que ele retorne ao diâmetro de repouso. A análise de dados pode ser realizada em tempo real com paquímetros de vídeo ou offline com software de análise de imagem. Repita o procedimento desde a incisão inicial até a imagem usando o músculo contralateral.

Quando terminar. Eutanasiar o camundongo seguindo o protocolo padrão A CUC para a coleta de tecido trapézio espinhal. Precisaremos de tesoura de íris, pinça padrão e tesoura de mola.

Anestesie o mouse conforme descrito anteriormente. Comece fazendo a incisão alguns milímetros cranial à omoplata do camundongo. Expanda a incisão lateralmente e, em seguida, cubra em ambos os lados.

O objetivo é expor o músculo trapézio espinhal, que se estende de T três a L quatro após a incisão. A pele pode ser separada das costas puxando suavemente ou cortando cuidadosamente o tecido conjuntivo, mantendo-o no lugar, super fundido com solução salina para evitar a dessecação e ajudar no manuseio do tecido. Use dissecção romba para remover o tecido adiposo dorsal e expor o músculo trapézio espinhal.

Da mesma forma, remova o tecido adiposo ventral. Depois de refletir o músculo, o trapézio t espinhal do lado direito do animal é identificado aqui. Em seguida, remova o máximo possível de fáscia sobreposta.

Esta parte do procedimento pode ser tediosa, mas igualmente importante para evitar artefatos durante a microscopia. Uma vez que o tecido conjuntivo tenha sido removido, excise o tecido conforme mostrado cortando primeiro a borda lateral aproximadamente paralela ao dorso e movendo-se na direção cranial para o mimo. Em seguida, corte transversalmente na extensão mais cranial e, finalmente, ao longo da borda medial, mais próximo da coluna para coletar o músculo contralateral.

Siga o mesmo procedimento. Primeiro removendo o tecido adiposo dorsal, depois o tecido adiposo ventral e, finalmente, a fáscia sobreposta durante o corte. Você pode achar mais fácil mudar os instrumentos para a mão menos dominante.

O tecido excisado pode ser fixado e lavado seguindo o procedimento descrito aqui após a eutanásia do animal. De acordo com um protocolo A CUC aprimorado. Consulte a literatura anexa para obter detalhes sobre um procedimento alternativo de fixação de perfusão.

Aqui mostramos um diagrama rotulado do músculo trapézio espinhal refletido. Depois de expor as letras da artéria de alimentação, indicam regiões como anteriormente. Lembre-se de que cada animal tem uma anatomia única.

Este rato em particular é considerado bastante difícil para este procedimento devido à proximidade dos outros dois vasos. Um animal mais típico é mostrado aqui. Observe a separação relativamente grande da artéria indicada da veia para, logo acima dela, e a ausência de um terceiro vaso.

Aqui vemos uma montagem de microscópio confocal de um músculo trapézio espinhal ligado do lado direito que foi corado para alfa actina do músculo liso. Em condições isquêmicas, houve remodelamento na região indicada a jusante do local de ligação. Essas mudanças podem ser quantificadas com software de análise de imagem, que usamos aqui para medir a tortuosidade como distância do comprimento da artéria para o núcleo

Alguns dados amostrais mostrados aqui indicam um resultado estatisticamente significativo para o aumento da tortuosidade do vaso em comparação com o controle contralateral. Também demonstramos medições funcionais da reatividade do vaso usando o software médico MicroVision a VA em um microscópio de campo escuro off-line. Os diâmetros dos vasos de vídeo são medidos antes e após a estimulação e, em seguida, comparados entre si como uma variação percentual.

Os dados da amostra mostrados aqui indicam um resultado estatisticamente significativo para o aumento do diâmetro do vaso para as artérias terminais após a estimulação. Olá, sou Alexander Ell e sou o aluno de graduação do laboratório Pierce Scholer que editou este vídeo. Juntos, acabamos de mostrar como criar um modelo para isquemia do músculo esquelético no músculo trapézio de espelhamento.

Em seguida, demonstramos um procedimento de vasodilatação funcional adequado para medir a reatividade vascular e o controle do fluxo sanguíneo. Por último, mostramos como extirpar o músculo para se preparar para a fixação adequada para coloração imunoquímica e imagem. Em nome de meus colaboradores em San Luis Obispo e aqui em Charlottesville, gostaria de agradecer por assistir e desejar adeus e boa sorte em seus esforços de pesquisa.