Name: Modelo Spinotrapezius murino para avaliar o impacto da ligadura arteriolar em função microvascular e Remodelação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 43 s
Description: Aprenda a criar um modelo de ligadura arterial no músculo espinotrapezio murino para estudar isquemia e remodelação microvascular. Este método permite visualizar adaptações vasculares com microscopia intravital e confocal.

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Reconhecemos Kevin Macleod para o uso de sua música Creative Commons licenciado no vídeo associado, incluindo (em ordem de aparição) sua &quot;Sala de Embarque&quot;, faixas de &quot;Wallpaper&quot; e &quot;Melodrama da noite.&quot; Gostaríamos também de agradecer Ndubisi Okeke e Frederick Torstrick por sua assistência com o vídeo da cirurgia.

1. Alimentação Spinotrapezius cirurgia de ligadura da artéria <ol><li> Anestesiar rato por injecção intraperitoneal. Em uma seringa de 0,5 ml, formular: 0,06 ml de 100 mg / ml Ketamine 0,03 ml de 20,0 mg / ml Xilazina 0,01 ml de 0,4 mg / ml de atropina 0,30 ml de solução salina a 0,9%. Dose: 0,01 * ml por grama de peso corporal, ip </li></ol> * Dose variável sobre tensão mouse e estoque, ajuste de acordo para recuperação do mouse está dentro de uma hora de indução. <ol start="2"><li> Aplicar pomada oftálmica padrão para evitar a dessecação da córnea. </li><li> Remover o cabelo da parte de trás usando cortadores de corte, seguido pela aplicação breve creme depilatório. </li><li> Desinfectar o campo cirúrgico com clorexidina ou iodo povidona. Alternate povidona-iodo com etanol três vezes, terminando com povidona-iodo. </li><li> Transferir o mouse para a superfície de trabalho previamente preparado cirúrgico, com almofada de aquecimento e bata estérilno lugar. </li><li> Criar uma incisão linear (3-5 mm), através da pele dorsal de aproximadamente 5 mm caudal para a proeminência óssea da omoplata utilizando tesouras e pinças íris padrão padrão (por exemplo, FST, 11271-30) por tenting o tecido e corte paralelo ao coluna. O local de incisão alvo pode ser identificado através da visualização transdérmica da almofada de gordura dorsal que permite pigmentação da pele; cortado na borda caudal da camada de gordura. Expandir a incisão, se necessário, e estender através de camadas secundárias da pele, usando uma tesoura de mola. <ol><li> Nota anatómica - O músculo spinotrapezius reside dorsalmente e estende-se a partir de T4 para L3 ao longo de cada lado da coluna vertebral. A borda anterior estende-se lateralmente para aproximadamente a omoplata. O músculo afunila na direcção caudal, de modo que a borda mais posterior medial está à borda anterior, e pode fixar nivelada com a coluna vertebral. Duas almofadas de gordura são também importante notar, colocando diretamente dorsal e ventral aos spinotrapeziusmúsculo para a metade do crânio. </li><li> Inflamação devido à incisão tem sido demonstrado que não têm qualquer efeito sobre a resposta de remodelação vascular, tal como a cirurgia sham ligadura não mostraram alteração na remodelação da vasculatura spinotrapezius. Dois fatores espaciais contribuem para este resultado. Primeiro, a incisão é removido por 5 mm na direcção craniana da região de interesse, onde a resposta vascular no músculo é normalmente examinado. Além disso, o local de incisão na pele dorsal é separada do local de ligação vaso por uma almofada de gordura abdominal, que se situa na parte superior do terceiro par craniano do músculo spinotrapezius. </li></ol></li><li> Irrigar a incisão com solução de Ringer aquecido para evitar a dessecação do músculo. Aplicação de vasodilatadores tais como papaverina irá ajudar a visualização da artéria alvo para ligação. </li><li> Sob um microscópio de dissecação, utilize uma pinça para neutralizar dissecar e separar (mas não remova) o almofada branca de gordura dorsal do musc subjacenteular tecido, a fim de visualizar o sistema vascular, uma vez que entra e sai da spinotrapezius no seu bordo lateral. </li><li> Localizar o alvo da artéria, a qual, juntamente com um ou dois pares de nervuras, passa através da almofada de gordura que é ventral com as spinotrapezius sobre o seu caminho para a borda lateral do músculo. Esta artéria alimenta uma porção substancial da metade caudal do músculo, o que pode ser confirmado pela reflexão e substituindo o músculo para observar o trajecto da artéria dentro do músculo. O local alvo para a ligadura é o segmento da artéria que sai do bloco ventral gordura e entrarem no músculo, e é bastante acessível nesta região. A par da artéria venosa pode precisar de ser ligeiramente separada da almofada ventral gordura nesta região. Note-se que o spinotrapezius é alimentado por vários pares de artéria veia, incluindo os recipientes que transversais tanto as almofadas de gordura dorsal e ventral. Tome cuidado para não perturbar estas embarcações. <ol><li> Múltiplos indicadores podem ser utilizados para distinguir artériaa partir da veia. Um dos melhores métodos é gentilmente obstruir o fluxo de sangue com a microssonda e mover a montante longe do músculo, o fluxo não será retomada na artéria até que a obstrução é liberado. A cor pode também ser utilizada, como as paredes das veias conter uma bainha esbranquiçada do tecido conjuntivo que as artérias não possuem. Além disso, pode-se considerar o diâmetro antes da aplicação do vasodilatador como veias são tipicamente maiores em tamanho. </li></ol></li><li> A artéria é, tipicamente, na proximidade de sua veia emparelhado; usar dissecção romba com uma microssonda e # 5 fórceps para isolar um segmento de cerca de 5 milímetros, passando a microssonda atrás da artéria, e usando a ponta para fazer uma grande diferença no natural fenda entre a artéria e veia. Esta é a distância através da qual a sutura vai ser enfiada. </li><li> Usando fio de sutura 10-0 único lugar o suporte de agulha e uma ligadura em torno da artéria de alimentação (~ 70 um de diâmetro) para a extremidade proximal do segmento dissecadas de nó de um cirurgião. Place uma ligação adicional para a extremidade distal do segmento da artéria dissecada, com uma separação suficiente entre as ligaduras para permitir a transecção da artéria. <ol><li> A escala pequena associada com a alimentação de artéria spinotrapezius conduz a uma maior dificuldade cirúrgica, em comparação com a ligação de um grande vaso, como a artéria femoral. Cirurgiões inexperientes particularmente terá altas taxas de avulsão, hemorragia inadvertido, e outras complicações cirúrgicas. De preocupação particular é a dificuldade de identificar e cortar a artéria incolor após o fluxo tem sido impedida, pouco antes do corte. Por estas razões, colocando duas ligaduras é recomendado para aqueles acostumados ao processo, como o cirurgião tem uma guia visual na localização onde a transecção da artéria, bem como uma confirmação do corte com a separação facilmente observáveis ​​das duas ligaduras. No entanto, um cirurgião mais experiente pode localizar uma ligadura única suficiente, desde que eles sejam capazes de claramenteidentificar e cortar as artérias jusante da ligadura. Embora esta técnica reduza o risco de inadvertidamente nicking um vaso próximo com a sutura de ligação acentuada, não é isenta de inconvenientes, incluindo o aumento da dificuldade em confirmar a artéria foi seccionada. </li></ol></li><li> Verificar a ligação ao observar diminuição do fluxo de sangue (RBC obstruído coluna) a jusante do local de ligação (isto é, no sentido do músculo). </li><li> Usando tesouras de dissecação da artéria transect ligado, entre as duas ligaduras. Se apenas uma ligadura foi colocada (11), cortado com extremo cuidado no sentido de jusante. </li><li> Droga carregada película lisa (1 mm), pode ser colocado a jusante (caudalmente) como parte do procedimento experimental. </li><li> Reposicionar a fáscia deslocados e tecido adiposo para sua orientação original. </li><li> Feche a incisão na pele usando 8-0 não-reabsorvíveis suturas. Em seguida, coloque o rato em uma gaiola de recuperação preparado aquecida sob observação e administrar um appriado analgésica tais como a bupivacaína, 0,02-0,05 ml de 0,25% de infiltração local. </li></ol> 2. Spinotrapezius microscopia intravital, in situ <ol><li> Anestesiar o rato numa câmara de indução com 3-4% de isoflurano vaporizado em 100% de oxigénio a um caudal de 3-4 L · min -1. <ol><li> O uso de anestesia por inalação é preferível para medidas funcionais, porque há menos depressão cardiovascular do que os anestésicos injectáveis. Se a anestesia por inalação, em que não estão disponíveis, de acção prolongada anestésicos injectáveis, tais como pentobarbital de sódio são preferidos para evitar injecções repetidas uma vez que o animal tenha sido posicionada. </li></ol></li><li> Uma vez anestesiados, continuamente entregar isoflurano através de uma máscara de anestesia (cone do nariz aka) em concentrações de manutenção (geralmente ~ 2%) e taxa de fluxo de 0,5-1 L · min -1. <ol><li> Ratos predominantemente ventilar através das suas vias nasais, por isso, é apenas necessário para cobrir o nariz com o diafragma máscara de anestesia. </li></ol></li><li> Se necessário, remover o cabelo da parte de trás usando cortadores de corte e creme depilatório. </li><li> Transporte do animal para o bloco de calor. <ol><li> É importante manter a ratos em estado euthermic para prevenir a vasoconstrição induzida pela fria, o que pode ser conseguido através de lâmpadas, almofadas de água de circulação de calor, microondas aquece almofadas, etc </li></ol></li><li> Insira a sonda de temperatura retal e definir termo-controlador para 35 ° C. </li><li> Faça uma incisão na pele na extremidade caudal dos spinotrapezius usando tesouras e pinças íris padrão standard. </li><li> Estender a incisão cranialmente para a almofada de gordura, criando uma incisão de ferradura, e cobrir o retalho de pele com filme plástico para evitar a dessecação. </li><li> Blunt dissecar o tecido conjuntivo subcutâneo com uma pinça e tesouras de mola para maximizar a visibilidade. </li><li> Coloque eletrodos estimulantes como toge pertother quanto possível, para minimizar o tamanho do campo de corrente, e posicioná-los na extremidade caudal do músculo exposta imediatamente lateral à coluna vertebral. </li><li> Realize uma estimulação de teste para confirmar a colocação do eletrodo usando um eletrodo sistema de aquisição de dados, isolador de estímulo eletrodo, e controlador de computador, com ondas quadradas de duração mseg 200, 2 mA amplitude, entregue a 1 Hz. </li><li> Coloque filme plástico sobre o músculo exposto de evitar a dessecação. </li><li> Inicie o tempo de um período de 30 minutos, durante o qual os vasos do vai equilibrar. </li><li> Posicione o microscópio intravital sobre o músculo spinotrapezius para ver a arquitetura vascular. <ol><li> Se estiver usando uma lente de imersão, coloque uma gota de PBS entre o objetivo eo plástico. </li></ol></li><li> Começando por cima da arteríola principal (o maior vaso visível), a fase de manipular no plano XY para localizar o vaso de interesse. <ol><li> Visualizando arteriol pequenaes com microscopia de luz refletida requer um maior contraste do que o previsto pela coluna de hemácias. Utilizamos principalmente um lado de fluxo de imagem de microscópio de campo escuro para melhorar o contraste microvascular, mas de contraste pode também ser melhorada através de um microscópio de luz refletida fluorescente após a injecção intravenosa de um elevado peso molecular fluorescente dextrano. </li></ol></li><li> Após o equilíbrio de 30 min, a captura de uma imagem / vídeo do vaso de interesse. </li><li> Estimular o músculo com ondas quadradas de 200 mseg de duração, amplitude de 2 mA, entregue em 8 Hz, durante 90 segundos, tal como descrito acima. </li><li> Capturar outro estímulo imagem / vídeo imediatamente pós e continuar a capturar cada minuto até navio voltou para o diâmetro de descanso, ~ 10 min. </li><li> Repetir os passos 6-18 utilizando o músculo contralateral. </li><li> A análise dos dados pode ser realizada em tempo real, com compassos de calibre de vídeo ou off-line com o software de análise de imagem. </li><li> Euthanize o mouse seguiring IACUC protocolo. </li></ol> 3. Colheita de Tecidos Spinotrapezius e Fixação <ol><li> Anestesiar ratos por injecção intraperitoneal da formulação, tal como no passo Spinotrapezius Ligadura Artéria alimentação 1. </li><li> Faça uma incisão milímetros vários cranianos para a proeminência óssea da lâmina do rato ombro com uma tesoura de íris e pinças padrão standard. Expandir a incisão lateral e, em seguida, caudalmente em ambos os lados. </li><li> Solte a pele do tronco dorsal suavemente refletindo a pele e corte da fáscia superficial. </li><li> Use dissecção romba para remover o tecido adiposo dorsal utilizando fórceps padrão, e, em seguida, reflecte o músculo e tecido adiposo similarmente dissecar ventral. </li><li> Remover fáscia que cobre o músculo usando fórceps e tesouras de mola. Este passo pode ser difícil e demorada, mas é importante para melhorar a coloração de imunofluorescência e de imagem. Manter o tecido hidratado pode facilitar a remoção da fáscia. </li><li> Localizara borda lateral do músculo, e usar dissecção romba para separar o músculo spinotrapezius da almofada de gordura que se encontra ventral a ele. </li><li> Continue a raspagem em um crânio com a direção caudal. Note-se que os vasos sanguíneos vários entram e saem desta superfície ventral do músculo; se a perfusão é necessária, deve ser realizada antes atravessa em estes navios. Note-se também que na metade caudal do músculo, as suas inserções de borda lateral no músculo deitado ventral a ele. Alguns de corte pode ser necessário ao longo desta fronteira para definir completamente e libertar a borda. </li><li> Músculo do Imposto spinotrapezius. Para fazer isso: <ol><li> Livre da borda lateral do músculo, como descrito acima. </li><li> Cortado transversalmente através extensão mais cranial do músculo. </li><li> Corte ao longo da borda medial (ao longo da coluna vertebral), no plano sagital. </li></ol></li><li> Repita os passos 4-9 procedimento no músculo contralateral, e depois eutanásia do mouse por um método aprovado IACUC. </li><li> Fixar os tecidos em lâminas de vidro revestidas com gelatina e por imersão em metanol arrefecido (4 ° C) ou num paraformaldeído a 4% / solução de água desionizada à temperatura ambiente durante 20 min. <ol><li> Em alternativa, a fixação de perfusão pode ser empregado. Antes do passo 2, realizar uma toracotomia, fazer uma incisão no átrio direito e na vasculatura perfundir com 5 ml de 1 × solução salina tamponada com Tris-com 0,1 mM de CaCl 2 e 2% de heparina, através do ventrículo esquerdo, seguida de 5 ml de 4 % de paraformaldeído para fixação do navio, e, finalmente, 5 ml de 1 × solução salina tamponada com Tris-com 0,1 mM de CaCl 2 7. </li></ol></li><li> Imediatamente a seguir a fixação, lavar espécime quatro vezes durante 20 minutos cada. Usando 0,01 M de solução salina tamponada com fosfato (PBS) com 0,1% de saponina </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.

O modelo de ligação de murino spinotrapezius aqui apresentada é eficaz num modelo animal pequeno para estudar as adaptações funcionais e estruturais que resultam de uma oclusão arterial. Este modelo é complementar para o modelo de isquemia dos membros posteriores amplamente utilizado 4, na medida em que proporciona uma vista de músculo inteiro de redes microvasculares intactas com uma elevada resolução espacial. Além disso, porque este músculo está localizado logo abaixo da pele dorsal, é acessível a imagens em série com microscopia intravital, e para a entrega da droga local através superfusão ou implantação de película fina 2. Estas características tornam um modelo animal atraente pequeno para se estudar os efeitos de novos alvos terapêuticos no remodelamento vascular e vasodilatação funcional após oclusão arterial. Note-se que o cuidado deve ser usado quando se comparam os dados adquiridos no modelo de ligadura spinotrapezius de dados adquiridos no modelo de ligadura dos membros posteriores devido a vários chave differences. Primeiro, os músculos estão se estabilizando spinotrapezius músculos, e eles diferem dos músculos das pernas em termos de função e distribuição do tipo de fibra. O nosso grupo demonstrou anteriormente que a ligadura arteriolar no músculo spinotrapezius cria hipóxia ou menos insignificante em estirpes com redes bem desenvolvidas arteriolares colaterais, em comparação com a hipóxia observado na pata posterior após a ligação da artéria femoral, no modelo de membro posterior 1,8 - 10. Também mostramos que o modelo de ligadura spinotrapezius produz uma resposta de remodelação diferente em ratinhos Balb / c em comparação com ratinhos C57BL / 6, com murganhos Balb / c mice remodelação redes por colateralização capilar e remodelação de C57BL / 6 por alargamento das actuais ligações arteriolares 3. Há um paralelo interessante entre estas observações e aqueles feitos em modelos de ligação dos membros posteriores, em que ratinhos Balb / c uma experiência de recuperação de perfusão prolongada após a ligadura em comparação com ratinhos C57BL / 6 9,11,12 &lt;/ Sup&gt;. Em outros modelos de isquemia do tecido, da idade do rato 14 e 13 do género na presença de doença 15 também impactar as respostas dos tecidos &#39;para oclusão arteriolar, embora não se tenha ainda testado estes preditores no modelo de ligadura spinotrapezius. Em segundo lugar, o tamanho da artéria que está ligado no modelo spinotrapezius é substancialmente menor do que a artéria femoral, e, portanto, a ligadura impacta um menor volume de tecido que está a jusante, isto é, a um nível inferior do sistema circulatório, no spinotrapezius em comparação com o membro posterior 3. Assim, a diferença anatómica na localização da ligação destes dois modelos, devem ser considerados quando se comparam as respectivas respostas fisiológicas (por exemplo, remodelação vascular) para esta intervenção. Em terceiro lugar, a finura das spinotrapezius oxigénio pode permitir atingir a porção não perfundidada do tecido da vizinhade tecido, em comparação com a isquemia e hipoxia combinado no modelo de membro posterior, como notado acima de 3. Em quarto lugar, a recuperação do fluxo para a parte a jusante spinotrapezius da ligadura é mais rápido do que na ligação dos membros posteriores. O modelo de ligadura spinotrapezius é um modelo único crónica e não devem ser confundidos com os outros modelos de oclusão arterial transitória ou modelos de lesão por isquemia-reperfusão. Consideramos que é possível adaptar este modelo para acomodar estes tipos de condições, mas esta está fora do âmbito de trabalho aqui apresentado. Por fim, advertimos contra directamente relacionados observações pré-clínicas neste modelo para as manifestações clínicas da doença isquêmica em seres humanos, especialmente quando utilizando jovem e saudável ratos e devido aos limites inerentes fisiológicas, como freqüência cardíaca 5. No entanto, consideramos que este novo modelo como uma ferramenta valiosa para descobrir mecanismos básicos de respostas teciduais à ligadura e identificar o potencialrapeutic alvos em um ambiente in vivo. Além das notas cirúrgicos fornecidos no procedimento de ligação de alimentação spinotrapezius artéria (nota anatómica (6a), distinguindo-se da artéria da veia (9a), e a utilização de uma ligadura única (11a)), alguns outros aspectos do processo de benefício discussão. Primeiro, a incisão inicial feito ao longo da fronteira almofada dorsal de gordura (ou vários mm caudal ao ombro, se visualização transdérmico não é possível) é idealmente feito tão pequeno quanto o cirurgião é confortável, e expandiu-se durante o procedimento, se necessário. Esta prática minimiza a sutura necessária para fechar a incisão, o que é conveniente para o cirurgião, reduz o tempo de processo, e também é menos irritante para o animal durante a recuperação. Alternativamente, uma incisão maior da pele pode ser apropriado de acordo com a preferência do cirurgião, uma vez que o músculo pode ser mais fácil de localizar com um campo expandido. Neste caso, a incisão podebeneficiar de uma forma de ferradura com uma face medial aberta para permitir que a dobragem no sentido da coluna. Ao fazer a incisão na pele e que se estendem através das camadas de pele secundárias, se um navio de superfície é danificada e causa hemorragia, aplica uma pressão ligeira com uma gaze estéril e proporcionar tempo para a hemostase. Também de nota, é importante para lidar com o tecido com a força mínima necessária, e sempre que possível segurar com uma pinça mais perto da borda lateral do músculo e para longe da zona pretendida isquémico. Esta prática ajuda a evitar lesão por esmagamento, a qual pode levar a outras respostas inflamatórias mediadas por tecidos que podem confundir a resposta de remodelação vascular provocado pela ligadura arterial. Em conclusão, nós demonstramos a utilização do músculo spinotrapezius murino como modelo cirúrgico para analisar as respostas vasculares e tecido para ligadura arteriolar. Este modelo é adequado para avaliação intravital de alterações vasculares (paravasodilatação exemplo, funcional), e para a avaliação ex vivo de alterações vasculares (por exemplo, a imagem latente imunofluorescente e quantificação de redes vasculares). Ambos os estudos pré-clínicos e clínicos demonstraram que a resposta de um indivíduo a obstrução arteriolar (por exemplo, através de ligação nos ratos ou de placas ateroscleróticas em seres humanos) é dependente da idade na presença ou ausência de doença (por exemplo, diabetes mellitus), o diâmetro da artéria obstruída , a constituição genética do indivíduo, e a exigência metabólica do tecido 11-15. Modelos murinos, como o apresentado aqui, aproveitar o pesquisador de diferenças anatômicas cepa-específica e genética e doenças específicas fenótipos, o que facilita a investigação destas relações complexas.

Modelos animais de isquemia crônica são ferramentas valiosas para estudar a fisiopatologia das doenças isquêmicas, como a doença arterial periférica, doença arterial coronariana e doença cerebrovascular. Em roedores, tal como nos seres humanos, a oclusão arterial leva a remodelação estrutural da rede vascular, incluindo a arteriogénese e a angiogénese. Em pacientes saudáveis ​​e mais jovens, esta remodelação pode ser suficiente para salvar o tecido de isquemia induzida por lesão, mas co-morbidades, como a diabetes pode comprometer gravemente a remodelação e recuperação. Compreender os mecanismos subjacentes a eventos de remodelação vascular é essencial para o desenvolvimento de terapias que estimulam esses processos de revascularização endógenos. Actualmente, a ligação da artéria femoral ou ressecção no membro posterior é a técnica padrão de remodelação para o estudo da isquemia induzida vascular crónica em pequenos animais 4,5. Análise do diâmetro, conectividade e reatividade deos microvasos que compõem a jusante da rede vascular da artéria femoral ligado é difícil, contudo, devido à espessura dos músculos. Nós desenvolvemos um modelo de ligadura arteriolar no músculo do rato spinotrapezius: ligadura unilateral da artéria alimentação lateral deste músculo estabilizador dorsal 1. Os spinotrapezius relativamente finas (60-200 mm) é passível de en imunocoloração cara para a avaliação da topologia da rede inteira com uma única célula de resolução, permitindo um exame detalhado de eventos de remodelação vascular em todo o tecido inteiro. O spinotrapezius também é superficial e acessível, e, portanto, seus navios são facilmente observáveis ​​por microscopia intravital, para caracterização eficiente do impacto de remodelação e ligadura arteriolar na reatividade vascular. Neste relatório, nós descrevemos em detalhes e demonstrar o mouse spinotrapezius modelo de ligadura arteriolar. In vivo e ex vivo methods cirurgia de avaliação a seguir são descritos, incluindo a medição da vasodilatação funcional, que tem sido mostrado para ser comprometida sob condições de isquemia 6, e imagiologia por imunofluorescência das redes de músculo inteiro microvasculares. Nós também incluímos resultados de dois estudos separados piloto para demonstrar a utilidade do modelo. Em primeiro lugar, utilizou-se o modelo de ligadura arterial para induzir um aumento estatisticamente significativo da tortuosidade navio em ratinhos C57BL / 6 (Figura 2B). Tortuosidade aumenta durante arteriogênese em garantias das arteríolas. Em outras estirpes de ratinho, que são mais vulneráveis ​​à isquemia, devido à ausência das arteríolas colaterais (por exemplo, ratinhos Balb / c), observa-se arterialização capilar 10. Arterialização capilar é detectada pelo aumento de diâmetros e ao desenvolvimento de α-actina de músculo liso de reactividade. Em segundo lugar, a estimulação eléctrica funcional do músculo leva à vasodilatação em arteríolas terminais da spinotrapezius (Figura 3B).

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Iris tesoura </td><td> FST </td><td> 14090-09 </td><td> Tipo: Ferramenta </td></tr><tr><td> Tamanho 7 fórceps </td><td> FST </td><td> 11271-30 </td><td> Tipo: Ferramenta </td></tr><tr><td> Tamanho 5 fórceps </td><td> FST </td><td> 11251-20 </td><td> Tipo: Ferramenta </td></tr><tr><td> Tesoura Primavera </td><td> Roboz </td><td> RS5671 </td><td> Tipo: Ferramenta </td></tr><tr><td> Microssonda </td><td> FST </td><td> 10140-03 </td><td> Tipo: Ferramenta Pode ser substituído com sonda linear </td></tr><tr><td> Suporte da agulha </td><td> FST </td><td> 12500-12 </td><td> Tipo: Ferramenta </td></tr><tr><td> Câmara de indução </td><td> JD Medical Dist. Co., Inc. </td><td> IC-1086 </td><td>Tipo: Equipamento </td></tr><tr><td> Gel Eye </td><td> Dechra </td><td> NDC 17033-211-38 </td><td> Tipo: Reagente </td></tr><tr><td> Calor pad </td><td> FST </td><td> 21060-01 </td><td> Tipo: Equipamento </td></tr><tr><td> Sonda de temperatura retal </td><td> FST </td><td> 21060-01 </td><td> Tipo: Equipamento </td></tr><tr><td> Eletrodos estimuladores </td><td> FHC </td><td> UEWSGCSE0N1M </td><td> Tipo: Equipamento </td></tr><tr><td> Artesão Polymer Clay </td><td> Polyform </td><td> N / A </td><td> Tipo: Equipamento </td></tr><tr><td> PowerLab sistema de aquisição de dados </td><td> ADInstruments </td><td> ML 845 </td><td> Tipo: Equipamento </td></tr><tr><td> Isolador de estímulo </td><td> ADInstruments </td><td> FE 180 </td><td> Tipo: Equipamento </td></tr><tr><td> LabChart </td><td> ADInstruments </td><td> ML S060 / 7 </td><td> Tipo: Software </td></tr&gt; <tr><td> Luz refletida microscópio de fluorescência </td><td> Olimpo </td><td> BFXM </td><td> Tipo: Equipamento </td></tr><tr><td> Alto MW fluorescente dextrano </td><td> Sigma </td><td> FD250S-100mg </td><td> Tipo: Reagente </td></tr><tr><td> Pinças de vídeo </td><td> Colorado vídeo </td><td> 308 </td><td> Tipo: Equipamento </td></tr><tr><td> Análise Vascular automatizado (AVA) </td><td> Microvision Médica </td><td></td><td> Tipo: Software </td></tr><tr><td> Anti-αSMA fluoróforo Conjugated </td><td> Sigma </td><td> 1A4-Cy3 </td><td> Tipo: Reagente Clonal, 1:100 </td></tr><tr><td> Microscópio Fluorescente </td><td> Olimpo </td><td> BFXM </td><td> Tipo: Equipamento </td></tr><tr><td> De elevado peso molecular fluorescente dextrano </td><td> Sigma </td><td> FD250S-100mg </td><td> Tipo: Reagente </td></tr></tbody></table>

modelo spinotrapezius murino para avaliar o impacto da ligadura arteriolar em função microvascular e remodelação

Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling

O spinotrapezius murino é uma fina, músculo esquelético apoio superficial que se estende de T3 a L4, e é facilmente acessível através de incisão na pele dorsal. Sua anatomia singular faz com que os spinotrapezius útil para investigação de lesão isquêmica e remodelação microvascular subseqüente. Aqui, nós demonstramos um modelo de ligadura arteriolar no músculo murino spinotrapezius que foi desenvolvido por nossa equipe de pesquisa e publicado anteriormente 1-3. Para determinadas estirpes de ratinhos vulneráveis, tais como o rato Balb / c, esta cirurgia de ligação fiável cria isquemia do músculo esquelético, e serve como uma plataforma para investigar terapias que estimulam a revascularização. Os métodos de avaliação são também demonstrados, incluindo a utilização de microscopia intravital e confocal. O spinotrapezius é bem adequado para estudos de imagiologia tais, devido à sua acessibilidade (anatomia dorsal superficial) e magreza relativa (60-200 jim). O músculo spinotrapezius pode ser montado en face, facilitandode imagem de todo-musculares redes microvasculares sem cortes histológicos. Descreve-se a utilização de microscopia intravital adquirir métricas na sequência de um procedimento de vasodilatação funcional, mais especificamente, o aumento do diâmetro arterilar como resultado da contracção muscular. Também demonstramos os procedimentos de colheita e fixa os tecidos, um precursor necessário para a imunocoloração estudos e da utilização de microscopia confocal.

Uma vista cirúrgica da artéria principal alimentando o músculo spinotrapezius que sofre de ligação é mostrado na Figura 1, com as etiquetas que indicam áreas de interesse. Uma imagem confocal exemplo da região colhidas e imunocoradas de músculo localizada directamente a jusante a partir da artéria ligado de uma semana após a ligadura é mostrado na Figura 2A. Arteríolas colaterais dilatadas contêm actina de músculo liso alfa-expressando células de músculo liso (vermelho) exibir tortuosidade característica após ligação. Tortuosidade do vaso, relatados como a razão entre o comprimento do navio e à distância via cabo (isto é, a linha que se estende ao longo dos pontos de extremidade do caminho mesmos vasos), no músculo ligado (à direita) é aumentada em relação ao músculo contralateral não ligada (Figura 2B, n = 8) . Figura 3 mostra os resultados de um estudo piloto no qual terminais de vasodilatação arteriolar funcional foi medida utilizando a microscopia intravital. Como esperado, di arteriolar<html> ameter aumenta significativamente após a contração muscular estimulação elétrica induzida. <img src="/files/ftp_upload/50218/50218fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50218/50218fig1highres.jpg"/> Figura 1. Campo cirúrgico do músculo spinotrapezius reflectida e da artéria de alimentação. A artéria de alimentação é ligada nos dois locais indicados por A0. Entre estas ligaduras e após obstrução de fluxo de sangue, a artéria é seccionado no local indicado por A. O segmento alvo das transições da artéria ventral da almofada gorda, descrito por C, no músculo spinotrapezius, descrito por D, no local indicado com seta de direção de fluxo B. é indicado pela seta tracejada E. ghres.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Imagem confocal de spinotrapezius rede microvascular músculo para estudo piloto de tortuosidade. (A) colhida e muscular de todo montado foi reativa para o músculo liso alfa-actina e fotografada usando microscopia confocal. O campo de visão mostra a região do músculo localizado imediatamente a jusante do posto de ligação ligado arteríola 1 semana. Vasos tortuosos são evidentes no músculo, como resultado da ligação de (B) os resultados do estudo piloto mostra um aumento significativo (p = 0,035, 1 Student tailed t-test). Tortuosidade exibida pelos microvasos no músculo ligado medida pelo comprimento do vaso caminho proporção cordão distância para um teste de ratinhos C57BL / 6 (n = 8), em comparação com o controlo contralateral. <img src="/files/ftp_upload/50218/50218fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50218/50218fig3highres.jpg"/> Figure 3. Imagens de microscopia intravital de vasodilatação funcional em arteríolas spinotrapezius, in vivo. (A) fotomicrografias representativas de arteríolas terminais spinotrapezius em repouso (à esquerda) e imediatamente a seguir a cessação de 8 a contração muscular Hz (à direita). (B) Terminal diâmetro arteriolar em repouso ( 8,5 ± 0,5 m, à esquerda) e imediatamente após (11 ± 1 um, meio) 90 seg de contração muscular, o que aumentou significativamente o diâmetro arteriolar (p = 0,032; 1-tailed teste t pareado) em camundongos Balb / C (n = 6). Variação percentual indicado (à direita).

Nós demonstramos um modelo de ligadura arterial novel no músculo spinotrapezius murino, incluindo um procedimento passo-a-passo e uma descrição da instrumentação necessária. Descrevemos a cirurgia e avaliação dos resultados relevantes referentes à remodelação da rede vascular e vasodilatação funcional usando microscopia intravital e confocal.

Modelo Spinotrapezius murino para avaliar o impacto da ligadura arteriolar em função microvascular e Remodelação

The murine spinotrapezius is a thin, superficial skeletal support muscle that extends from T3 to L4, and is easily accessible via dorsal skin incision. ...

A doença vascular periférica afeta aproximadamente 12 a 14% da população e é especialmente comum entre usuários de tabaco e indivíduos com diabetes, obesidade, hipertensão, estágio avançado ou aterosclerose. O objetivo desta cirurgia é produzir um modelo de isquemia muscular esquelética mediante a ligadura de uma das três artérias nutridoras da metade caudal do músculo espinhal trapézio contralateral. Esta animação mostra a localização geral dessas artérias e indica o local pretendido para a ligadura em resposta à isquemia.O tecido vascular sofrerá alterações características da arteriogênese dependendo da linhagem do camundongo. Isso inclui a formação de colaterais de conexão ou aumento da tortuosidade dos vasos. Também mostraremos como realizar um procedimento funcional de vasodilatação no músculo trapezius espinhal utilizando microscopia intravital.Isso envolve expor cuidadosamente o músculo, posicionar os eletrodos estimuladores com sua fonte de energia e controlador, e então configurar o dispositivo de imagem. Por último, mostraremos como excisar o músculo e descreveremos um processo de fixação adequado para coloração imunoquímica e imagem. Olá, meu nome é Shane Pierce Kotler e sou professor associado do Departamento de Engenharia Biomédica na Universidade da Virgínia em Charlottesville.Olá, sou Kyle Martin. Sou aluno de pós-graduação no laboratório de Shane e vou realizar o modelo de ligadura do trapézio espinhal. Nosso laboratório estuda o crescimento e remodelamento microvascular, particularmente em situações de doenças isquêmicas, como doenças cardíacas, doença arterial periférica e acidente vascular cerebral.Desenvolvemos este modelo de ligadura espelhada do trapézio espinhal para estudar como a obstrução localizada do fluxo sanguíneo arterial gera adaptações estruturais nas redes microvasculares a jusante. Consideramos este modelo complementar ao modelo bem estabelecido e amplamente utilizado de isquemia de membro posterior, pois oferece uma visão abrangente em todo o organismo das artérias, neurogênese e angiogênese em um músculo muito fino que não requer seccionamento histológico para análise. Como este músculo é tão fino e como a ligadura provoca uma redução reprodutível no fluxo sanguíneo, podemos visualizar os efeitos da ligadura arterial em toda a cama microvascular e com resolução ao nível de célula única.Depois que Kyle nos guiar pelo procedimento passo a passo para realizar o modelo de ligação do músculo espinho-trapezoidal, nossos colaboradores da Cal Poly nos mostrarão como utilizam esse modelo para estudar a vasodilatação funcional. Após observarmos isso, levaremos vocês de volta à Universidade da Virgínia para colher o músculo espinho-trapezoidal, o que precisa ser feito antes da obtenção de imagens e coloração. Olá, meu nome é Trevor Cardinal.Sou professor assistente no Departamento de Engenharia Biomédica da Cal Poly State University em San Luis Obispo, Califórnia, e meu nome é Josh Cutz. Sou estudante de mestrado em engenharia biomédica na Cal Poly em San Luis Obispo. O principal interesse do nosso laboratório de pesquisa é compreender o impacto da isquemia crônica, como ocorre na doença arterial periférica, sobre as capacidades funcionais da vasculatura de resistência.Após a realização da cirurgia de ligadura da artéria nutridora trapezoidal espinhal, Josh demonstrará o procedimento de vasodilatação funcional utilizado em nosso laboratório. Em nosso laboratório, utilizamos o procedimento de vasodilatação funcional para examinar o efeito da oclusão arterial na reatividade vascular e no controle do fluxo sanguíneo. Os instrumentos para preparação prévia incluem sutura com localização de 10 nós, sutura de fechamento, porta-agulhas, tesoura de íris, pinça padrão, tesoura de mola e uma sonda micro curvada.Após preparar os instrumentos cirúrgicos, anestesie o camundongo; aqui utilizamos a fórmula de apresentação e dosagem. Confirme a anestesia por meio do teste reflexo de pinçamento do dedo do pé, então aplique o protetor IGEL utilizando um barbeador elétrico para raspar uma grande área de pelos do dorso do animal. Embora a ligadura do trapézio espinhal exija apenas uma pequena região desobstruída próxima à escápula, a coleta do tecido do trapézio espinhal, que será realizada em alguns dias, exigirá uma superfície desobstruída muito maior.Remova rapidamente o excesso de pelos, depois aplique o creme depilatório seguindo as instruções do fabricante. Lave as costas com uma esponja úmida. Em seguida, aplique três conjuntos alternados de lenços umedecidos com álcool e Betadine, terminando com Betadine.Sob boas condições de iluminação, o melhor local para a incisão pode ser encontrado pela identificação transdérmica da bolsa de gordura dorsal. Como a artéria nutridora atravessa abruptamente o músculo trapezioidal espinhal, a borda da bolsa de gordura tensiona a pele nesse local; posicione a tesoura de íris diretamente acima, perpendicularmente ao dorso do animal, e corte para fazer uma incisão linear de três a cinco milímetros. Se a iluminação ou a pigmentação da pele não permitirem a identificação transdérmica.Realize o corte a cinco milímetros abaixo da saliência óssea da escápula, estenda a incisão através das camadas da pele e amplie-a lateralmente conforme necessário para localizar o trapézio espinhal. Disseque a fáscia sobrejacente para acessar o local de ligadura. Se um vaso superficial for danificado e houver hemorragia, como neste caso, aguarde o tempo necessário para que o sangramento cesse e aplique pressão se necessário, use soro fisiológico para prevenir a dessecação.A artéria indicada percorre a face dorsal do trapézio espinhal e depois atravessa o músculo e penetra no compartimento adiposo ventral. Localize a borda lateral do trapézio espinhal e reflete-a, levantando-a de modo que fique quase invertida. Isso expõe sua face ventral e o local de travessia da artéria; dissecar o compartimento adiposo ventral que obscurece o vaso.Tenha cuidado com a pressão da pinça para evitar lesão por esmagamento. Aqui, o cirurgião indica a artéria espinal trapezoidal a ser ligada. Observe a presença de pares de veias; vasodilatadores como a adenosina de ação mais curta ou a papaverina de ação mais prolongada podem ser aplicados.Neste caso, a artéria encontra-se entre dois outros vasos, conforme indicado pelas setas. Um deles é semelhante em tamanho à artéria e seria visto mais lateralmente se o músculo não estivesse refletido, enquanto o outro é muito maior e estaria mais imediatamente adjacente. Os dois locais de ligadura são marcados por ai.A primeira ligadura é colocada no sentido a jusante em relação à segunda. Isso garante que o vaso ainda esteja preenchido com sangue e visível durante a colocação da segunda ligadura. A indica a região a ser seccionada.Observe o local B, onde a artéria e sua veia pareada entraram no coxim adiposo ventral delimitado por C. Isso nos permite saber que o segundo vaso menor é uma veia. Observe também o próprio músculo reto espinal trapezoidal delimitado por D. Vários pontos para discriminar a artéria da veia são fornecidos no protocolo de texto acompanhante. Mas brevemente, nosso método preferido é obstruir o fluxo sanguíneo aplicando pressão com uma microsonda.Se o vaso for uma artéria, o fluxo será obstruído na direção a jusante, em direção ao músculo refletido aplicado. Esta técnica exclui o vaso maior. Se necessário, utilize a microsonda curvada em 80 graus para separar a artéria dos outros vasos.Isso é feito perfurando o tecido conjuntivo sob o vaso e realizando movimentos laterais curtos para ampliar uma abertura. Até que a sonda possa passar facilmente, a agulha de sutura agora pode ser enfiada com mais facilidade sob a artéria. Nesse caso, uma pequena veia foi cortada, causando sangramento leve.Este vaso está localizado a uma distância suficiente da zona isquêmica para que seu impacto seja mínimo. No procedimento, dê um único nó cirúrgico e prepare o próximo ponto. Novamente, passe através da abertura pré-fabricada e dê outro nó cirúrgico alguns milímetros a montante da ligadura anterior.Leve em consideração que o músculo está refletido e a direção do fluxo pode ser oposta à esperada. Após ambas as ligaduras terem sido colocadas, procure evidências de uma coluna de glóbulos vermelhos obstruída. Se o fluxo não tiver sido interrompido, será necessária outra ligadura.Caso contrário, seccione o vaso entre as ligaduras, observando se ocorre algum sangramento; nesse caso, a ligadura foi bem-sucedida e não se observa hemorragia arterial. Um método alternativo utiliza uma única ligadura e seção no sentido descendente. Consulte a literatura complementar para saber quando este método é preferido.Restaure o músculo à sua orientação original, reposicione o tecido adiposo e a fáscia deslocados e feche com sutura não reabsorvível adot. Por fim, coloque o camundongo em uma gaiola de recuperação aquecida sob observação e analgesia para microscopia intravital do trapézio espinhal. O camundongo é primeiramente anestesiado com isoflurano em uma câmara de indução e então conectado ao fluxo contínuo de isoflurano por meio de um cone nasal.Insira a sonda de temperatura retal e configure o controlador térmico em 35 graus C. Os instrumentos a serem preparados previamente incluem tesoura de íris, pinça padrão, tesoura de mola e um cotonete umedecido com PBS. Faça uma incisão na pele na extremidade caudal do trapézio espinhal utilizando tesoura de íris e pinça padrão. Estenda a incisão em direção cranial ao coxim adiposo, criando uma incisão em forma de ferradura, e cubra o retalho de pele com filme plástico para prevenir a dessecação. Disseque cuidadosamente o tecido conjuntivo subcutâneo com pinça fina para maximizar a visibilidade.Posicione os eletrodos estimuladores, mantendo-os o mais próximos possível para minimizar o tamanho do campo de corrente; coloque-os na extremidade caudal do músculo exposto, logo lateral à coluna vertebral. Fixe-os com argila. Realize uma estimulação de teste para confirmar o posicionamento dos eletrodos, utilizando um sistema de aquisição de dados PowerLab, estimulador, isolador e software LabChart configurados para ondas quadradas com duração de 200 microssegundos, amplitude de dois miliampères e frequência de um hertz.Cubra novamente o músculo exposto com filme plástico. Para evitar a dessecação, aguarde 30 minutos por diâmetro dos vasos para equilibrar e, em seguida, capture sua imagem ou vídeo. Posicione o microscópio intravital sobre o músculo trapézio espinhal para visualizar a arquitetura da vasculatura.Se estiver usando uma lente de imersão, coloque uma gota de PBS entre a objetiva e a película plástica, começando acima da artéria principal, que é o vaso de maior calibre visível. Manipule a platina no plano XY para localizar o vaso de interesse. Estimule o músculo com ondas quadradas da mesma duração e amplitude anteriores, mas aplicadas a oito hertz e por 90 segundos, imediatamente após a estimulação.Imagem o vaso e continue a fazê-lo a cada minuto até que ele retorne ao diâmetro de repouso. A análise dos dados pode ser realizada em tempo real com paquímetros de vídeo ou posteriormente com software de análise de imagens. Repita o procedimento desde a incisão inicial até a aquisição de imagens utilizando o músculo contralateral.Quando terminar, eutanizar o camundongo seguindo o protocolo padrão de A CUC para a coleta do tecido espinhal trapezoidal. Precisaremos de tesoura de íris, pinça padrão e tesoura de mola.Anestesie o camundongo conforme descrito anteriormente. Comece fazendo uma incisão alguns milímetros cranialmente à escápula do camundongo. Alargue a incisão lateralmente e, em seguida, cure nas duas laterais.O objetivo é expor o músculo trapezius espinhal, que se estende de T três a L quatro após a realização da incisão. A pele pode ser separada das costas por meio de leve tração ou corte cuidadoso do tecido conjuntivo, mantendo-o no lugar, superfundido com solução salina para prevenir dessecação e auxiliar na manipulação do tecido. Utilize dissecação romba para remover o tecido adiposo dorsal e expor o músculo trapezius espinhal.Da mesma forma, remova o tecido adiposo ventral. Após refletir o músculo, o trapézio espinhal direito do animal é identificado aqui. Em seguida, remova o máximo possível da fáscia sobrejacente.Esta parte do procedimento pode ser tediosa, mas é importante para prevenir artefatos durante a microscopia. Uma vez que o tecido conjuntivo tenha sido removido, excise o tecido conforme mostrado, primeiro cortando a borda lateral aproximadamente paralela ao dorso e movendo-se em direção cranial até a região caudal. Em seguida, corte transversalmente na extensão mais cranial e, finalmente, ao longo da borda medial, próxima à coluna vertebral, para coletar o músculo contralateral.Siga o mesmo procedimento. Primeiro remova o tecido adiposo dorsal, depois o tecido adiposo ventral e, por fim, a fáscia sobrejacente enquanto realiza os cortes. Pode ser mais fácil alternar os instrumentos para a mão menos dominante.O tecido ressecado pode ser fixado e lavado seguindo o procedimento descrito aqui após a eutanásia do animal. De acordo com um protocolo aprimorado de CUC. Consulte a literatura acompanhante para obter detalhes sobre um procedimento alternativo de fixação por perfusão.Aqui apresentamos um diagrama rotulado do músculo trapézio espinhal refletido. Após expor a artéria de suprimento, as letras indicam regiões como anteriormente. Tenha em mente que cada animal possui uma anatomia única.Este camundongo em particular é considerado bastante difícil para este procedimento devido à proximidade dos outros dois vasos. Um animal mais típico é mostrado aqui. Observe a separação relativamente ampla da artéria indicada em relação à veia para, logo acima dela, e a ausência de um terceiro vaso.Aqui observamos uma montagem de microscopia confocal de um músculo trapezius espinhal direito ligado, corado para alfa-actina de músculo liso. Em condições isquêmicas, houve remodelação na região indicada a jusante do local de ligadura. Essas alterações podem ser quantificadas com software de análise de imagem, que utilizamos aqui para medir a tortuosidade como a razão entre o comprimento do trajeto arterial e a distância até o núcleo.Alguns dados amostrais mostrados aqui indicam um resultado estatisticamente significativo de aumento da tortuosidade vascular em comparação com o controle contralateral. Também demonstramos medições funcionais da reatividade vascular utilizando o software médico MicroVision em um VA em um microscópio de campo escuro offline. Os diâmetros vasculares em vídeo são medidos antes e após a estimulação e depois comparados entre si como uma alteração percentual.Os dados de exemplo mostrados aqui indicam um resultado estatisticamente significativo para o aumento do diâmetro vascular em arteríolas terminais após a estimulação. Olá, sou Alexander Ell e sou o aluno de graduação no laboratório Pierce Scholer que editou este vídeo. Juntos, acabamos de mostrar como criar um modelo de isquemia muscular esquelética no músculo trapézio espelhado.Em seguida, demonstramos um procedimento funcional de vasodilatação adequado para medir a reatividade vascular e o controle do fluxo sanguíneo. Por fim, mostramos como excisar o músculo para preparação antes da fixação adequada para coloração imunoquímica e imagem. Em nome dos meus colaboradores em San Luis Obispo e aqui em Charlottesville, gostaria de agradecer por assistir e desejar-lhe sucesso e boa sorte em seus empreendimentos de pesquisa.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

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Geração e quantificação 3-Dimensional de Arterial lesões em ratos por meio de tomografia óptica de Projeção

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Um modelo murino de isquemia-reperfusão, através da ligadura da artéria Descendente Anterior Esquerda

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Um modelo cirúrgico modificado de isquemia de membros traseiros em ApoE-/- Ratos usando uma incisão em miniatura

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Aqui apresentamos um modelo murino para anastomose da artéria femoral, oferecendo aos pesquisadores um modelo animal valioso para estudar e simular a estenose da anastomose vascular. Esse desenvolvimento é crucial para avançar nossa compreensão da fisiopatologia subjacente a essa condição e facilitar pesquisas mais precisas e eficazes sobre doenças vasculares.

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Aprenda a criar um modelo de ligadura arterial no músculo espinotrapezio murino para estudar isquemia e remodelação microvascular. Este método permite visualizar adaptações vasculares com microscopia intravital e confocal.

Modelo Spinotrapezius murino para avaliar o impacto da ligadura arteriolar em função microvascular e Remodelação

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