Name: Purificação de Transcrições e metabolitos de Drosophila Cabeças (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Aprenda a purificar mRNA e metabolitos de cabeças de Drosophila para estudos de neurodegeneração. Este método de extração de alta qualidade permite análises de alto rendimento em biologia molecular.

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Somos gratos a Janice Santiago, Figueroa Gabriel, e Herrera José para assistência técnica e Bloomington Drosophila Banco Central da Universidade de Indiana para as ações da mosca. DH e CW foram apoiados por fundos do NSF-IOS-1051890. PF-F e LMM foram apoiados por um fundo de Sementes Opportunity, da Universidade da Flórida.

1. Gerando um Replicar e congelamento das Moscas (Nitrogênio CUIDADO, líquido) Objectivos: Recolher pelo menos 200 fêmeas por genótipo / hora ponto e flash-congelamento. <ol><li> Genótipos: Gal80 ts; da-Gal4, estirpe para a expressão ubíqua de Gal4 sob o controlo da região reguladora daughterless e sensível à temperatura. Gal80 Como uma linha de controlo, utilizou-se UAS-LacZ, o qual tem sido mostrado previamente para induzir quaisquer efeitos deletérios. UAS-Atxn3-27Q e UAS-Atxn3-78Q, não patogénico e construções patogénicos experimentais, respectivamente. (A Y, construção hs-Hid tenha sido usado antes para uma cobrança mais eficiente de fêmeas virgens, mas decidimos contra por causa do tempo extra necessário para introduzir Y, hs-Hid com Gal80 ts; Gal4 da-nos cromossomos II e III.) </li><li> Expandir todas as ações através da combinação de 10 mulheres e 5 homens em garrafas para evitar a superlotação. Todos os experimentos foram realizados em Jazz Mix mosca mídia, o que é fácil de preparar e promove o crescimento Drosophila rápido e baixa infestação com ácaros. </li><li> Recolher 50 Gal80 ts; Da-Gal4 machos, e 100 UAS-Atxn3-78Q virgens (apenas uma linha UAS será utilizado como um exemplo), para cada ponto de tempo. </li><li> Faça dez cruzamentos por genótipo / hora ponto. Anestesiar os machos e fêmeas sobre o dióxido de carbono (CO 2) dorminhoco / pad. Coloque 10 UEA-Atxn3-78Q virgens moscas (não mais de cinco dias) e cinco do sexo masculino Gal80 TS; da-Gal4 em cada garrafa grande cravado com pasta de levedura (fermento seco reidratado). Rotular os frascos com genótipos, pontos de tempo, e identificadores de garrafa (letras AJ), e colocá-los a 25 ° C. </li><li> Após 2 dias, limpar os adultos das garrafas, adicione uma pitada de fermento seco e um esguicho de água para incentivar o crescimento larval ideal, e colocar as garrafas a 18 ° C (Gal80 ativa,Gal4 reprimido). Não copie os cruzamentos, pois isso pode gerar variabilidade experimental em descendência de fertilizado contra fêmeas virgens. Além disso, a descendência de cada garrafa representa biológico independente repetições (cada garrafa produz progênie único), mas cruzes transferidos (cópias) seria técnico repetições (progênie adicional com a mesma constituição genética). </li><li> Quando a descendência ecloses a 18 ° C, anestesiar a cama 2 CO / almofada, recolher virgens dos genótipos desejáveis, e colocá-los em pequenos frascos com o (2-12 moscas por frasco). Frascos de etiqueta com o identificador de garrafa. Não piscina voa a partir de garrafas diferentes. Colocar os frascos de volta a 18 ° C durante 24 h. Para maximizar a descendência, continuar a recolher nas manhãs e noites consecutivos. </li><li> Quando cada frasco completa 24 hr a 18 ° C, deslocá-las a 29 ° C (Gal80 inactivo, Gal4 activo). Este é o dia 0, o ponto de partida da experiência, quando tele transgenes iniciar a sua expressão. </li><li> Transferir as moscas para limpar os frascos a cada 2 dias até se atingir dias 10 e 20. </li><li> Quando as moscas atingirem a idade desejada (1, 10, 20 dias), a contagem e transferi-las a partir dos frascos de alimentos para pré-rotulados criotubos usando um pequeno funil. Não anestesiar as moscas. Inverta os frascos no banco. </li><li> Aguarde 30 minutos para permitir que as moscas se recuperar da transferência (stress), depois flash-congelar os frascos por imersão em nitrogênio líquido e armazenar em um pré-rotulados, caixa congelador pré-refrigerados Lembre-se:. Congelar as moscas na mesma ordem eles foram transferidos para o criotubo, tornando o tempo gasto no criotubo uniforme em toda amostra. </li></ol> 2. Recolha e liofilização de Chefes Fly (Executar na câmara fria, Pré-chill todos os equipamentos, CUIDADO, nitrogênio líquido e gelo seco) Objetivo: a rápida separação, coleta e liofilização de tecido. <ol><li> Assemdro da peneira (malha maior na câmara superior para recolher os corpos, o segundo maior na câmara inferior para recolher as cabeças, a tampa sobre a parte inferior para recolher as peças pequenas) e pré-gelado a -80 ° C durante pelo menos 30 min. </li><li> Colete 200 moscas de criotubos, maximizando a contribuição de moscas provenientes da mesma garrafa. Para compensar as diferenças entre moscas coletadas no período da manhã ou à noite, garantir que cada amostra usa uma relação de manhã / noite idêntica (usamos 47% manhã / noite 53%) Nota:. Os RNA resultantes de dois 100-cabeça amostras podem ser combinadas posteriormente para gerar o equivalente a 200 moscas em uma repetição. </li><li> Relaxar um pedaço de parafilme (~ 9 x 14 cm) em gelo seco durante 5 minutos. </li><li> Esvaziar os criotubos com as moscas completa para o parafilme, um pouco de cada vez, contagem voa usando pincel, e armazenar em outro criotubo em gelo seco até alcançar 100 moscas. </li><li> Mergulhe a peneira no nitrogênio líquido; adicionar os 100 moscas ao Chamb superiorer. Agitar a peneira vigorosamente durante 1 min. Mergulhe-o no nitrogênio líquido novamente, e agitar durante 1 min. </li><li> Abrir a peneira, recolher as cabeças da câmara inferior num microtubo e lugar a -80 ° C. </li><li> Abra os microtubos, enrole os tops em parafilme, e fazer pequenos buracos. </li><li> Colocar as amostras no liofilizador durante pelo menos 2 dias. </li></ol> 3. RNA total de Extração e purificação do mRNA (Trate todas as superfícies com RNaseZap; Luvas mudar frequentemente) Objectivo: Homogeneizar o tecido para maximizar o rendimento, extrair RNA total, e purificar o mRNA. <ol><li> Remover as amostras do liofilizador e adicionar três pequenos estéreis, bolas de moagem aço a cada microtubo. Lugar no Geno / Grinder; executado em 1.500 rotações / min por 1 min. </li><li> Abra os tubos, adicione 1 TRIzol ml, e selar os tubos com parafilme. Moer 1 min; tocar nos tubos de cabeça para baixo para soltar as bolas de aço, se necessário. Moer 1 min. </li><li> Nãocentrifugar o tubo neste ponto (o tubo irá ser quebradiço). Transferir a mistura (com excepção das bolas de aço) em um microtubo RNase novo. Pellet os detritos celulares em uma microcentrífuga tampo a 4 ° C durante 10 min a 12.000 x g. </li><li> Transferir o sobrenadante para um microtubo novo. Adicionar 0,1 volumes de 1-bromo-3-cloropropano (BCP) e agitar vigorosamente durante 15 segundos. Incubar à temperatura ambiente durante 3 min. Rodar numa microcentrífuga a 4 ° C durante 15 minutos a 12.000 x g Nota: Os protocolos de extracção de ARN usar muitas clorofórmio nesta fase; BCP destina-se a maximizar a produção de ARN, aumentando a eficiência de separação de fases.. Manter as amostras a 4 ° C durante o passo de centrifugação, também irá aumentar a eficiência da separação de fases e reduzir a contaminação de proteínas e DNA genómico para a fase aquosa. </li><li> Transferir a camada superior aquosa para um microtubo novo. Precipitar o ARN por adição de 0,5 volumes de isopropanol arrefecido com gelo; invertido seis vezes a mix. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min. Rodar numa microcentrífuga a 4 ° C durante 10 min a 12.000 x g. </li></ol> Nota: Para além da recuperação de RNA, as proteínas podem também ser extraídos a partir da camada orgânica e de interfase TRIzol, então ambos os proteómica e análises transcriptômica pode ser realizada nas mesmas amostras. Apesar de não realizar esta etapa em nossas análises, extração TRIzol produz excelente representação de proteínas solúveis e maior representação da membrana e proteínas nucleares do que a maioria buffer / detergente extrações. Lee e Lo 17 descrevem um procedimento para extrair proteínas utilizando TRIzol apropriado para proteómica análises, incluindo 2-D gel e LC-MS/MS. <ol start="6"><li> Remover o sobrenadante. Lavar o RNA por adição de 1 ml de etanol arrefecido em gelo a 70% (usa água tratada com DEPC), e mistura-se com um vortex curto. Rodar numa microcentrífuga a 4 ° C durante 5 min a 12.000 x g. </li><li> Remover o sobrenadante. Ar seco do sedimento para umapelo menos t 15 min. Adicionar 80 uL de água tratada com DEPC para o sedimento de ARN e colocá-la em 55 ° C durante 10 min. Deixar a 4 ° C durante a noite. </li><li> Determinar a concentração de RNA utilizando o espectrofotómetro NanoDrop. A relação de absorvância a 260 nm/280 nm deve ser entre 1,8 e 2,1, com 2,1 sendo o ideal. </li><li> Tome 30 ug de RNA em massa, adicione 4 U de DNase I, RNasin 60 U, 10 ul de tampão de reacção de 10 vezes, e água tratada com DEPC para levar o volume total até 100 ul. Incubar a 37 ° C durante 20 min. </li><li> Purifica-se o ARN utilizando o kit RNeasy Mini. Seguir as instruções do fabricante, com excepção executar todas as centrifugações para os 30 segundos e incluir todos os &quot;opcionais&quot; etapas. </li><li> Determinar a concentração de RNA utilizando o NanoDrop, e avaliar a qualidade do RNA utilizando o &quot;total do pico de ARN&quot; de ensaio em uma Bioanalyzer. </li><li> Para a purificação de ARNm, transferir 30 ul de Dynabeads com um tubo de microcentrífuga de RNase. </li><li> Coloque o tubo em um ímã para 1-2 min e remover o sobrenadante. Voltar a suspender as pérolas em15 ul de tampão de ligação. Repetir. </li><li> Partindo com 5 ug de ARN total, ajustar o volume a 15 ul com água tratada com DEPC. Aquece-se a 65 ° C durante 2 min, e colocar em gelo. </li><li> Adicionar 15 ul de RNA total para os 15 ul de contas de pré-lavadas. Misturar cuidadosamente, pipetando a cada 5 min durante 30 min para recozer o RNA às esferas. Lugar no magneto durante 1-2 min e remover todo o sobrenadante. </li><li> Adicionar 35 ul de tampão de lavagem Mix B. por pipetagem cuidadosa. Coloque sobre o ímã e remova cuidadosamente o sobrenadante. Repetir a lavagem duas vezes. </li><li> Eluir o mRNA pela adição de 15 ul de frio 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) e aquecimento a 80 ° C durante 2 min. Colocar imediatamente o tubo sobre o íman, transferir o sobrenadante para um tubo de RNase, e congelar a -80 ° C. Quantificar como em 3.8.) Rendimento deve ser ~ 1-5% do RNA total. </li></ol> Para análise metabolômica, executar os protocolos 1 e 2), e prosseguir com 4) abaixo: 4. Metanol-clorofórmio extraction de metabólitos Objectivo: Separe metabolitos polares e não-polares. <ol><li> Adicionar o antioxidante hidroxitolueno butilado (BHT) para o clorofórmio, a uma concentração de 0,1 mg / ml para evitar a auto-oxidação de lípidos durante a extracção. Utilize este BHT-clorofórmio para todas as etapas subseqüentes. </li><li> Transferência de 200 cabeças em refrigerados, pré-pesado tubos cónicos com tampa de rosca de polipropileno, congelar a -80 ° C, e liofilizar. Determinar o peso seco. </li><li> Coloque esferas de zircónia 5-7 nos tubos e homogeneizar num grânulo-batedor para dois ciclos de 20 seg cada a 800 Hz. </li><li> Com base no peso seco do mais pesada da amostra, adicionar água, metanol, clorofórmio e nas proporções seguintes: 11,74 x metanol; água 10,59 x; 11,74 x clorofórmio, em que x é o peso da amostra em gramas mais pesado e o produto é o volume em ml. Adicionar todo o metanol, calculada e 45% do total de água para o tubo de batedor grânulo contendo as cabeças liofilizados. </li><li> Homogeneizaçãoze no bead-beater por mais dois ciclos de 20 seg cada. </li><li> Combinar os volumes de clorofórmio (100%) e o resto da água (55%) num frasco de vidro cónico em gelo. Em seguida, transfere-se a mistura de tecido (com esferas) para o frasco de vidro. Agitar durante 10 min. Incubar durante 10 min em gelo. </li><li> Girar numa centrífuga a 4 ° C durante 5 minutos a 2000 x g. Remover a fase (superior) polar com uma pipeta de Pasteur (evite plásticos) e colocar num tubo de microcentrífuga de segundo. </li><li> Guardar a fase não polar (inferior) num frasco de vidro pequeno e congelar a -80 ° C. Secar sob uma corrente de azoto gasoso, certifique-se de que a tubagem que vai do tanque de azoto é Tygon de elevada pureza para evitar plastificantes presentes no extracto. </li><li> Hidratar a fase não polar com 620 ul de clorofórmio deuterado. Transferir 600 uL para tubos de RMN etiquetados. Armazene em um -80 ° à prova de explosão congelador C. </li><li> Coloque fase polar no CentriVap e executado até que o tubo está completamente seco, a 30 ° C (~ 7 h). </li><li> Rehydrate a fase polar com 620 ul de 0,1 M de tampão fosfato de sódio (pH 7,3) em óxido de deutério com 1 mM TMSP [3 - (trimetilsilil) propiónico-2 ,2,3,3-d4 ácido] como um padrão interno. Vortex durante 30 segundos. Rodar numa microcentrífuga a 4 ° C durante 5 minutos a 10.000 rpm para precipitar os pigmentos e outras moléculas maiores, que possam interferir com os espectros de RMN. Transferir 600 uL de sobrenadante para tubos de RMN etiquetados. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram não haver interesses conflitantes financeiros.

Com base na nossa experiência anterior em transcriptômica 11, 12, 15 metabolismo e doenças neurodegenerativas 6, 8, apresentamos aqui um novo protocolo para a recolha de milhares de cabeças de voar com adulto expressão específica de genes patogênicos, e mRNA purificação e metabólitos para o RNA- seq e espectroscopia de RMN, respectivamente. A natureza destas experiências necessário a incorporação de diversas inovações antes da recolha de mosca, incluindo a selecção de uma linha de Gal4 ubíqua e a utilização de regulação temporal da expressão do gene. Em relação a expressão, Gal4 ubíqua dos transgenes foi crucial por duas razões. Primeiro, um grande número de genes envolvidos em doenças neurodegenerativas, incluindo a ATXN3, Huntingtin, proteína precursora de amilóide, e superóxido dismutase 1, entre outros, são amplamente expressos em células neuronais e gliais, bem como em outros tipos de células fora do sistema nervoso. Queríamoscorretamente modelar este aspecto da biologia destes genes patogénicos, analisando as consequências da expressão ubíqua, em vez de se concentrar somente na expressão neural. Segundo, não é viável para coletar cérebros da mosca em grande número, mas podemos fazê-lo com a cabeça mosca (mais de 200 em triplicado por condição) 11, 12. Uma vez que a homogeneização de misturas de cabeças inteiras tecidos neurais e não neurais, a expressão do transgene ubíqua torna-se crítica para a obtenção de RNA uniformes e metabolitos a partir de populações de células que expressam os transgenes mesmos. É importante notar que, da-Gal4 foi escolhido pela sua distribuição bastante uniforme, não por causa do seu nível de expressão elevado, embora um recente relatório sugeriu que da-Gal4 pode não ser totalmente ubíqua 25. Nós já anteriormente consideradas outras ubíquos, incluindo linhas Gal4-braço, Tub-e Act-GA4, mas todos eles exibiram padrões de expressão de complexos no sistema nervoso central e músculos adultos, tornando-os menos umdequate para este estudo. Na verdade, a imunofluorescência em cérebros adultos mostraram que da-Gal4 induz a expressão disseminada, mas fraca, o que só acumulado em níveis elevados no cérebro centros constituídos por uns poucos milhares de axónios e em alguns neurônios grandes (Figura 2). Embora os níveis de expressão das construções eram baixas, essas condições dramaticamente reduzida a sobrevivência de uma forma dependente da poliQ. Esta dinâmica de expressão cumprido nossas necessidades, mantendo baixos níveis de expressão, o que foi importante para observar as lentas, progressivas alterações celulares induzidas por proteínas neurotóxicas. A consequência previsível de induzir expressão ubíqua de proteínas neurotóxicas foi que causou letalidade antes de emergência de adultos. Felizmente, esta complicação foi ultrapassado com a utilização de Gal80 ts. Como discutido acima, a expressão do gene atingiram níveis máximos de aproximadamente 48 horas depois da mudança de temperatura, o que se ajusta bem com o tempo frame da experiência. Uma vantagem adicional do uso de Gal80 ts foi que, em contraste com as experiências em que as proteínas neurotóxicas são constitutivamente expressos pan-neuralmente, não houve expressão durante o desenvolvimento do sistema nervoso. Assim, o uso de Gal80 ts criado um fundo de &quot;limpo&quot;, onde o sistema nervoso não foi exposta às actividades tóxicas dessas proteínas neurotóxicas durante sensíveis estágios de desenvolvimento. Em nossa opinião, a ativação da expressão do gene em adultos resultou em um modelo melhor para esta classe de adulto-início patologias. No entanto, Gal80 ts também introduziu algumas complicações associadas às mudanças de temperatura. Uma era que as moscas que crescem a temperaturas baixas (18-20 ° C) após o atraso do ciclo de vida, tornando as experiências significativamente mais longo. Além disso, é sabido que as moscas que crescem a temperaturas elevadas (29-31 ° C) acelera o seu metabolismo, tal como demonstrado pelo tempo de vida reduzido em comparação com as moscas envelhecidos a 25 ° C. Since os estudos de transcrição e metabólica será realizado em moscas com idade a alta temperatura, podemos esperar mudanças importantes em vias de estresse celular e metabolismo energético. É por isso que foi tão importante para a introdução de dois controles para o experimento, um com o não-patogênico Atnx3-27Q e um controle relacionado expressar LacZ. Estes controlos irá proporcionar uma base para a expressão de genes e as alterações metabólicas associadas com a temperatura elevada, de modo que podemos identificar essas alterações directamente relacionadas com a expressão de Atxn3 tóxicos. No geral, nós introduzimos várias modificações para a coleta de moscas que oferecem inúmeras vantagens - e algumas desvantagens (problemas de temperatura e no parágrafo seguinte) - para estudar na idade adulta, doenças progressivas. Embora o regulamento temporal com Gal80 ts foi uma adição útil, ele também introduziu uma complicação inesperada. Enquanto que a produção das moscas que transportam tanto um ts Gal80ND DA-Gal4 construções em um estoque estável, percebemos que voa duplamente homozigotos para ambos os construtos eram viáveis, mas estéreis. Desde homozigoto Gal80 ts e Da-Gal4 cepas eram viáveis ​​e fértil por si só, não é claro por que a combinação exibida baixa fertilidade. Tem sido conhecido durante algum tempo que Gal4 é ligeiramente tóxico para os tecidos de Drosophila 22. É possível, então, que a expressão heteróloga da levedura Gal80 repressor transcricional contribuiu para a toxicidade de Gal4, interferindo, possivelmente, com a maquinaria transcricional endógeno. Esta toxicidade pode ser exacerbada pela distribuição ubíqua de Gal4 sob o controlo de da, um gene que desempenha um papel fundamental no desenvolvimento precoce e determinação sexual. Independentemente das causas subjacentes da esterilidade, ampliamos o ts Gal80; Gal4 da-moscas, mantendo um cromossomo balanceador mais da-Gal4 mantendo o homozygosity para Gal80 t s, o que sugere que Gal4 é um contribuinte mais crítico para a esterilidade. Esta solução foi a chave porque utilizado centenas destes machos a cada duas semanas para cruzar com cada um dos transgenes UAS. No entanto, cruza carregando um balanceador criado trabalho adicional durante a seleção da progênie apropriado. Apenas um quarto (25%) da progenitura foram recolhidos (fêmeas, balanceador não), o que aumentava o tempo de selecção, reduziu o rendimento por garrafa, e aumentou o número de frascos necessários para a obtenção de pelo menos 200 moscas por genótipo / replicar / hora ponto. Em geral, embora o conjunto de moscas tornou demorado devido às grandes conjuntos necessários, temos certeza de que estudar alterações celulares de apenas algumas horas depois de ligar a expressão de genes patogénicos ubiquamente irá identificar novos processos e interessante implicados na perda neuronal progressiva. Uma vez que o projeto genético estava no lugar, demos especial atenção aomanipulações experimentais que podem introduzir variabilidade biológica. Em primeiro lugar, nós apenas recolhidos fêmeas virgens para assegurar a homogeneidade das amostras, embora isto significa desperdiçar machos e verificação de descendência duas vezes por dia. Durante o envelhecimento, não mais de 12 moscas foram mantidas no mesmo frasco a fim de evitar aglomeração e stress. Além disso, antes da congelação, as moscas foram transferidas para criotubos sem anestesia e foram deixados a recuperar da transferência durante 30 minutos. Estes factores aparentemente triviais podem influenciar a expressão genética e metabolismo, introduzindo variabilidade na análise final, que não é relevante para a experiência. Para assegurar a qualidade dos materiais congelados (cabeças, RNA, e metabólitos), demos especial atenção a cada detalhe que possa contribuir para a degradação do tecido. Desde moscas são transferidos para criotubos em pequenas quantidades (até 12 moscas por frasco), tivemos que recuperar muitos frascos para a coleta de 200 cabeças. Estas manipulações foram duma com extremo cuidado em uma sala fria com gelo seco e nitrogênio líquido. A recolha de moscas, a separação das cabeças, e de purificação de moléculas de informação é muito demorado para descobrir que o material foi degradado no final deste processo longo. Para além de assegurar que o material mantém a sua qualidade, este protocolo descreve vários passos que maximizam o rendimento de ARN e metabolitos, incluindo a secagem por congelação e batimento do grânulo. Essas etapas não são de preenchimento obrigatório para extracções de normal para a RT-PCR ou PCR quantitativo a partir de moscas de inteiras, mas eles são crítico para a de purificação de consistente a partir de amostras de pequenos, tais como cabeças de de mosca. Nós determinamos que os outros passos afectar o rendimento de ARN. Para obter de instância, as moscas de mais velhos produzido RNA de forma significativa menos do que moscas de mais jovens, independentemente do genótipo de. Esta observação sugeriu que o envelhecimento a uma temperatura elevada induz mudanças dramáticas. Além disso, a extração de RNA a partir de 100 cabeças foi realmente mais eficiente do que de 200 cabeças, por isso, começou a purificar em dois batches de 100 por amostra de, somente para combiná-las, após verificação da de qualidade com a Bioanalyzer. Além disso, as colunas de purificação de ARNm parecia saturar facilmente, assim que a quantidade de RNA total usado por coluna tem de ser optimizado. Metabolitos são uma mistura de diversas moléculas pequenas, para o controlo de qualidade é muito mais difícil do que com o ADN, ARN ou proteínas. Infelizmente, não há catálogo completo de metabolitos de qualquer modelo animal, neste momento, o que pode estar a mudar nos próximos anos graças à aplicação de diversas inovações tecnológicas, incluindo espectroscopia de RMN e de uma maior utilização da cromatografia líquida - Espectrometria de Massa ( LC-MS). Embora a RMN é menos sensível do que a MS, mostra muitas vantagens promissoras, incluindo nenhuma destruição de amostras, sem procedimentos analíticos que introduzem polarização (LC), e reprodutibilidade elevada que permite a comparação estatística das Repetições e várias condições experimentais 24. Assim, a amostra pode serretestados para verificar observações ou re-analisados ​​por LC-MS para validar os dados de RMN. Aqui, nós mostrou dados de RMN preliminares de moscas que nós estamos usando para compilar um catálogo de de metabolitos em Drosophila. Esta informação será fundamental para determinar como a expressão de genes patogênicos altera o metabolismo normal, abrindo uma nova janela para aprofundar a compreensão dos mecanismos celulares subjacentes doenças neurodegenerativas. Emergentes tecnologias OMIC oferecer a melhor oportunidade para estudar doenças neurodegenerativas em um nível de detalhe não alcançado anteriormente. Talvez o maior obstáculo a ser superado nestes estudos de alto rendimento é a coleta de amostras de fiéis reproduzíveis que podem ser analisados ​​por métodos altamente sensíveis. Os procedimentos apresentados aqui fornecem uma maneira de conseguir essa consistência, e vai levar a resultados que podem ser facilmente comparados entre conjuntos de dados. Embora nossos principais interesses envolvidos mudanças exame dos genes expressaion e metabolitos, as moscas gerados podem também ser submetidos a análise proteómica ou epigenômico. Alterações proteômicas e epigenômico que ocorrem durante a neurodegeneração também são susceptíveis de ser de suma importância para o processo da doença. Quando a comunidade científica, em última análise identifica todo o espectro de alterações moleculares que afetam o processo da doença, um entendimento verdadeiro nível sistemas da doença será possível. A este nível, terapias modificadoras da doença, finalmente, emergir como uma realidade.

No último século, a Drosophila tem provado ser uma ferramenta de valor inestimável para a investigação laboratorial profundas questões biológicas, principalmente no desenvolvimento, biologia celular, genética, neurobiologia e 1. As razões para este sucesso são que as moscas de fruta são fáceis de manipular, têm uma caixa de ferramentas em constante expansão 18, 21, 31, e possuem um genoma relativamente simples, com elevada qualidade de anotação 26. Essas vantagens técnicas, combinadas com engenho e inovação constante dentro da comunidade mosca, levaram a grandes contribuições científicas, como ilustrado pela atribuição de três prémios Nobel (1933, 1995, 2011). Mais recentemente, a Drosophila tem emergido como um modelo relevante para o estudo de doenças humanas, distúrbios principalmente no desenvolvimento, de imunidade inata, cancro, e neurodegeneração 2. Nós são particularmente interessado em descobrindo a base celular e molecular de doenças neurodegenerativas. Estes co complexo de e diversificadanditions estão ligados a assembléias, possivelmente oligômeros solúveis, de proteínas anormalmente dobradas e são, portanto, facilmente modelados em moscas. Todas as principais doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer, de Parkinson e doença de Huntington, esclerose lateral amiotrófica, ataxias vários, tauopatias, doenças priónicas, e outras desordens raras, foram modelados em moscas nos últimos quinze anos 23. Laboratórios mosca têm contribuído para a compreensão destas doenças, principalmente explorando a proeza de Drosophila genética para identificar novos genes implicados na neurotoxicidade das proteínas patogênicas. Uma vez que novos genes relevantes para a cascata neurotóxico são identificados, os seus efeitos são tipicamente analisados ​​por métodos tradicionais, incluindo a histologia para averiguar os padrões de degeneração, imunofluorescência para determinar a distribuição de proteínas e patologia celular, e análises bioquímicas para avaliar a quantidade e tipo de conformações de proteínas anormais . Finalmente, comportaanálise comportamental serve como uma leitura funcional da evolução das doenças. Estas técnicas bem estabelecidas têm sido explorados para examinar a contribuição de um ou mais genes candidatos poucos para o processo da doença, incluindo o stress oxidativo e disfunção mitocondrial 13 de desregulação transcricional 9, 27, 30, o transporte axonal aberrante e actividade sináptica 14, anormal RNA biologia 9, dysregulated célula de de sinalização 29, ER dyshomeostasis 6, dificultado proteostasis celular de 33 anos, e muitos outros 23. No entanto, não está claro como essas proteínas tóxicas pode interferir simultaneamente com múltiplas vias interligadas, o que é a seqüência temporal dessas alterações, e qual é a contribuição relativa de cada caminho para a patogênese. Décadas de pesquisa focada em um único gene, a hipótese de abordagens baseadas em humanos e em modelos animais têm levado a uma imagem incompleta, confusa dos mecanismos celulares que causamneurodegeneração. A compreensão actual dos mecanismos imunológicos exactos pelos quais estes conjuntos de proteínas tóxicas causam neuropatologia é uma limitação fundamental para o desenvolvimento de terapias modificadoras da doença. Nós são agora interessados ​​em a aplicação de novas abordagens para a a compreensão de como estas proteínas patogênicos induzir a globais perturbações celulares. O advento da era omics permite a profunda sondagem de complexos problemas biológicos utilizando sofisticadas tecnologias de alta capacidade, que pode levar a tratamentos de doenças eficazes no futuro próximo. De genes de expressão (transcritômica) estudos foram estabelecido na sequência a conclusão de seqüências do genoma múltiplos desde que de alta-qualidade anotação pode predizer a maioria dos transcrições. A recente aplicação de sequenciamento de última geração para a análise transcrição (RNA-seq) forneceu novas vantagens e oportunidades em comparação com microarrays, incluindo uma abordagem imparcial, melhorou faixa quantitativa, e custo reduzido 32.Queremos explorar as vantagens de RNA-seq para entender melhor a forma mais comum de ataxia de herança dominante, tipo de ataxia espinocerebelar 3 (SCA3) ou de Machado-Joseph doença. SCA3 é uma doença monogênica dominante com penetrância completa, causado por uma expansão CAG trinucleótido no gene Ataxin3 (ATXN3) 16. Esta mutação resulta na produção de Atxn3 proteína com um comprimento de poliglutamina faixa (poliQ) que o torna propenso a agregar. Desde mutante Atxn3 é o agente neurotóxico em SCA3 responsável por todas as perturbações relacionadas com a doença, isto é uma doença ideal para a aplicação dessas novas abordagens mico. Além disso, SCA3 foi uma das primeiras doenças neurodegenerativas modelados em moscas 34. Enquanto a pôr em prática os procedimentos para a coleta de um grande número de cabeças de voar por RNA-seq, percebemos que poderíamos usar o mesmo material para a realização de estudos globais de outras moléculas de informação. Entre discip de outros países emergenteslinhas, proteômica, Epigenomics, e metabolómica permitir que o exame da patologia celular a uma profundidade não previamente alcançados, embora a não sem desafios. Ao contrário de mRNA, o catálogo de proteínas e metabolitos é bastante incompleta neste momento devido à dificuldade acrescida na previsão de todas as variantes de splicing possíveis ea origem ainda mais enigmático de todos os metabolitos normais e patogénicos. Grandes esforços estão sendo feitos para catalogar proteínas em muitos organismos e em condições de doença. Para isso, queria se concentrar sobre a contribuição dos metabólitos alterados para SCA3 patogênese usando um organismo simples, como a Drosophila. Trata-se de um campo relativamente novo e promissor, particularmente, com a introdução recente de ressonância magnética nuclear (RMN), que proporciona uma elevada reprodutibilidade e não destruir as amostras de 5, 24. Nós propomos que profiling metabólito pode contribuir para a biomarcadores de identificativas e as mecanismos da doença implicados em neurodegeneration. Uma consideração importante com estes projectos OMIC é que eles exigem amostras grandes e uniformes (200 cabeças mosca), bem como técnicas de purificação para minimizar a variação precisos experimental. Começamos a coletar moscas seguindo procedimentos que tinha usado anteriormente para microarrays e também usado recentemente para RNA-seq 12. Mas nós em breve encontrou um número de problemas relacionados com a misexpressing os SCA3 constructos. Primeiro, tivemos que selecionar um driver Gal4 para estes quatro experimentos, onde o tecido alvo para a análise foi o cérebro. A escolha óbvia seria ser um motorista de pan-neural desde SCA3 é uma doença cérebro. No entanto, uma vez que a intenção de coletar mRNA e metabolitos de cabeças inteiras, esta opção produz material misturado a partir de tecidos expressar e não expressar as construções. Para gerar amostras homogêneas, onde todas as células expressam as construções, decidimos usar uma linha de motorista fraco, mas onipresente, daughterless (da)-Gal4. Interestingly, muitos dos genes implicados em doenças neurodegenerativas, incluindo ATXN3 20, tem uma larga distribuição, tornando a escolha da expressão ubíqua apropriado. Em seguida,, nós encontrou um problema segundo: expressão onipresente de patogênico Atxn3-78Q causado letalidade durante o desenvolvimento. Para ignorar essa letalidade, incorporamos Gal80 ts para controlar a activação temporal de Gal4 19. Isto permitiu-nos a recolher as moscas experimentais, a idade deles por até 20 dias, congelá-los, e processar as suas cabeças liofilizadas para qualquer RNA (TRIzol) ou de extracção (metanol-clorofórmio) metabolito (Figura 1). Nós já utilizaram este protocolo de para obtenção de amostras para análises transcriptomic e metabolômica, mas há são outros aplicações óbvias para esta técnica (por exemplo, proteômica ou neuro-peptidomic análises). Visão geral experimental: O objetivo geral destes protocolos é o de apoiar a coleta de consiamostras de stent de cabeças de mosca para a extracção de transcrições e metabolitos. A meta específica da estes procedimentos de é o de adquirir moscas de que expressam Atxn3-27Q e Atxn3-78Q (-patogênicas non e patogênico construtos experimentais), bem como de LacZ (controle de de construto), onde uma única amostra consiste em 200 cabeças de de mosca. Embora a tecnologia actual permite a análise de amostras muito pequenas, incluindo as células individuais 28, temos reunidas 200 cabeças para eliminar a variação experimental, biológicas e técnicas, permitindo-nos identificar as alterações celulares associadas com o processo da doença, com confiança estatística elevada. Esta abordagem é projetado para detectar apenas as mudanças na expressão gênica que são consistentes na população, orientando-nos para as vias mais críticas de condução degeneração. Como estamos interessados ​​em idade-dependentes mudanças nas cabeças destes moscas, cada genótipo foi obtido com 1, 10, e 20 dias de idade. Um aspecto fundamental da estesanálises globais é a produção de réplicas biológicas que o apoio de uma análise estatística robusta. A nossa experiência anterior com microarrays e RNA-seq sugere que a análise de amostras biológicas, em triplicado fornecer significância estatística forte dos dados 11, 12. Nós descrever na seção 1) como gerar apenas uma repetição, biológica (Rep 1) para cada ponto de genótipo e do tempo. Estes procedimentos podem ser repetidos para gerar Reps 2 e 3, ou feitas em paralelo, o tempo que cada Rep está correctamente identificado. Embora três repetições é o objetivo, estabelecendo um representante (ou mesmo quinto) quarto é altamente recomendado para cobrir questões relacionadas com a baixa produtividade, perda de moscas durante o envelhecimento ou perda acidental de material (moscas, cabeças, ou RNA), em uma ou mais amostras. Descobrimos que 10 cruzes (frascos identificados por letras AJ) produzido descendência suficiente para obter 200 cabeças / genótipo / hora ponto. Extremo cuidado deve ser aplicada a fim de evitar confusão, uma vez que um grande número de garrafas de umre necessários para obter um Rep (10 garrafas x 3 genótipos x 3 pontos tempo = 90 garrafas). Para isso, designado cada garrafa utilizando genótipo, ponto de tempo, e carta de garrafa. Por exemplo, SCA3-27Q 20E refere-se ao frasco de quinta (de 10) das moscas que expressam Atxn3-27Q envelhecida durante 20 dias. Uma vez que o eclose descendência, as moscas são mantidas em frascos separados marcadas com o identificador exclusivo. Mantivemos os números de moscas obtidos para cada amostra, garrafa, e ponto de coleta (de manhã e à noite) em uma planilha do Excel. Nós revisamos o número de moscas por frasco antes de congelar a ter em letalidade conta e fugitivos. A partir dessas contagens finais, frascos adicionando 200 moscas podem ser facilmente localizados, antes de abrir o congelador, contribuindo assim para a preservação das amostras. Desde moscas coletadas em uma garrafa só pode ser usado em um Rep, que maximizou a sua contribuição de cada repetição biológica, apesar de todos os representantes continha moscas de várias garrafas. Nós reservadosas moscas dos frascos não usados ​​na sua Rep prevista para Reps outros, como amostras de substituição, ou para outras experiências relacionadas (western blot, qPCR).

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Companhia </td><td> Gato. Número </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Jazz mistura Drosophila alimentos </td><td> Fisher Scientific </td><td> AS-153 </td><td></td></tr><tr><td> Os frascos criogênicos </td><td> Corning, Inc. </td><td> 430658 </td><td></td></tr><tr><td> Microtubos </td><td> Axygen </td><td> MCT-175-CS </td><td></td></tr><tr><td> RNaseZap </td><td> Ambion </td><td> AM9786 </td><td> Tratar todas as superfícies </td></tr><tr><td> 5/32 &quot;bolas de moagem, de aço inoxidável </td><td> OPS Diagnóstico </td><td> GSS 156-5000-01 </td><td></td></tr><tr><td> TRIzol </td><td> Ambion </td><td> 15596018 </td><td></td></tr><tr><td> 1-bromo-3-cloropropano </td><td> Sigma </td><td> B9673-200ML </td><td></td></tr><tr><td> ISOPROpanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A416-500 </td><td></td></tr><tr><td> Água tratada com DEPC </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP561-1 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Promega </td><td> M6101 </td><td></td></tr><tr><td> RNasin inibidor da ribonuclease </td><td> Promega </td><td> N2111 </td><td></td></tr><tr><td> Kit Mini RNeasy </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads kit de purificação de ARNm </td><td> Invitrogen </td><td> 610-06 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos com tampas de rosca cônica </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-681-344 </td><td></td></tr><tr><td> Screw Caps w / O-Rings </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-681-364 </td><td></td></tr><tr><td> 2,0 milímetros esferas de zircônia </td><td> Biospec Products </td><td> 11079124zx </td><td></td></tr><tr><td> Methanol, de grau HPLC </td><td> Fisher Scientific </td><td> A4524 </td><td></td></tr><tr><td> Clorofórmio, grau HPLC </td><td> Acros Organics </td><td> AC39076 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Stocks de Drosophila </td></tr><tr><td> da-Gal4 </td><td> Bloomington Banco Central </td><td> 5460 </td><td></td></tr><tr><td> Gal80 [ts] </td><td> Bloomington Banco Central </td><td> 7108 </td><td></td></tr><tr><td> UEA-MJD-27Q </td><td> Bloomington Banco Central </td><td> 8149 </td><td></td></tr><tr><td> UEA-MJD-78Q </td><td> Bloomington Banco Central </td><td> 8150 </td><td></td></tr><tr><td> UAS-LacZ </td><td> Bloomington Banco Central </td><td> 8529 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Injectar + MatSleeper ic </td><td> INJECTAR + MATIC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microsieve Set </td><td> Fisher Scientific </td><td> 3410531 </td><td> Use duas maiores malhas </td></tr><tr><td> Geno Grinder / 2000 </td><td> Amostra SPEX Prep </td><td> SP2100-115 </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall Microcentrífuga Legenda </td><td> ThermoScientific </td><td> 75002436 </td><td></td></tr><tr><td> FreeZone Plus 2.5 L Sistema de Congelar Cascade a seco </td><td> Labconco </td><td> 7670041 </td><td></td></tr><tr><td> Bioanalyzer v 2,6 </td><td> Agilent </td><td> 2100 </td><td></td></tr><tr><td> DynaMag-2 Magnet </td><td> Invitrogen </td><td> 123-21D </td><td></td></tr><tr><td> Espectrofotômetro NanoDrop </td><td> ThermoScientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rápido Prep talão batedor </td><td> ThermoScientific </td><td> FP120 </td><td> &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> CentriVap Vacufuge Mais </td><td> Labconco </td><td> 022820001 </td><td></td></tr></tbody></table>

purificação de transcrições e metabolitos de<em&gt; drosophila</em&gt; cabeças

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

Durante a última década, temos tentado compreender os mecanismos moleculares e celulares da degeneração neuronal utilizando Drosophila como um organismo modelo. Apesar de moscas da fruta fornecem óbvias vantagens experimentais, a pesquisa sobre doenças neurodegenerativas mais tem se baseou em técnicas tradicionais, incluindo interação genética, histologia, imunofluorescência e bioquímica de proteínas. Estas técnicas são eficazes para mecanicista, a hipótese-driven estudos, que levam a uma compreensão detalhada do papel dos genes individuais em problemas bem definidos biológicos. No entanto, as doenças neurodegenerativas são muito complexas e afecta múltiplos organelos celulares e processos ao longo do tempo. O advento de novas tecnologias e da idade omics oferece uma oportunidade única para entender as perturbações globais celulares subjacentes doenças complexas. Organismos modelo flexíveis, tais como Drosophila são ideais para adaptar essas novas tecnologias por causa de sua forte annotção e docilidade alta. Um desafio com estes pequenos animais, no entanto, é a purificação de um número suficiente de moléculas informativas (DNA, mRNA, proteínas, metabolitos) a partir de tecidos altamente relevantes, tais como o cérebro da mosca. Outros desafios consistem em coletar um grande número de moscas para experimental repetições (crítico de robustez estatística) e desenvolvimento de procedimentos consistentes para a purificação de material de alta qualidade biológica. Aqui, descrevemos os procedimentos para a recolha de milhares de cabeças de mosca e da extração de transcritos e metabólitos para entender como as mudanças globais na expressão gênica e metabolismo contribuir para doenças neurodegenerativas. Estes procedimentos são facilmente escaláveis ​​e podem ser aplicadas ao estudo de contribuições proteômicas e epigenômico a doença.

Para contornar a letalidade induzida pela expressão ubíqua de Atxn3 expandido sob o controle de da-Gal4, introduzimos regulação temporal de Gal4 com Gal80 ts. Mas antes de de prosseguir com a recolha e congelamento de grandes números de moscas, nós queria para determinar a dinâmica de expressão de o nosso transgene sob o controle de Gal80 ts e da-Gal4. Para fazer isso, foram geradas as cruzes, deixou a progénie a 18 ° C, recolheu as moscas adultas, e mantidas durante 24 horas a 18 ° C. Em seguida, foram colocados as moscas a uma temperatura restritiva (29 ° C) e incubou-se a eles para 0, 6, 12, 24, 36, 48, e 72 h. Em seguida, verificou-se a acumulação do alelo poliQ expandida por western blot das moscas individuais seguindo protocolos publicados 10. A expressão foi detectada pela primeira vez, mas 6 horas fraco após mudança de temperatura e continuou a aumentar até às 48 h, quando atingiu níveis de saturação (Figura 2A). Interestingly, uma banda de peso molecular elevado de poliQ insolúvel apareceu após 48 horas, indicando o tempo que leva para a proteína de modo a formar grandes agregados. Nós também dissecado os cérebros da mosca em cada ponto de de tempo para determinar a distribuição de o alelo de poliQ expandida pela técnica de imunofluorescência (A Figura 2B). A proteína foi detectada pela primeira vez 24 horas após a mudança de temperatura, ainda que com uma distribuição irregular. Entre os dias 24 e 48 hr os os níveis da proteína de continuaram a subir, fazendo com que cérebro vários centraliza claramente visível, incluindo os lóbulos antenais e os o das projeções corporais de cogumelo (A Figura 2B). Entre os 48 e 72 hr a expressão de o alelo de poliQ expandida chegou a os níveis de maximais, o que sugere de que o sistema Gal4 foi plenamente activado a esta hora. Com base em estes resultados, nós selecionado 24 hr depois de o turno temperatura como o ponto de primeira vez que (dia 1) para experimentos de subseqüentes. As coleções de de moscas-das 10 e 20 dias velhas Foram também medidos os de partida a partir de o turno temperatura (time 0), que é o momento em que a experiência se inicia com a nova expressão dos transgenes patogénicos e controlo. Uma vez que verificámos que Atxn3 foi detectada após 24 hr, sob o controlo de Gal80 ts e da-Gal4 a 29 ° C, nós saber se estas moscas que mostram sinais de neurodegeneração ao longo de 20 dias. Uma vez que estes moscas começar a expressar as proteínas patogênicos como adultos, nós temia que eles pode precisar de um tempo de incubação longo para mostrar fenótipos neurodegenerativas. Para determinar a toxicidade de Atxn3-78Q nestas condições, foram coletadas moscas expressando LacZ, Atxn3-27Q e 78Q-Atxn3, e gravou sua longevidade. Considerando que as moscas que expressam LacZ e Atxn3-27Q exibida sobre a viabilidade de 90% após 20 dias, moscas expressando Atxn3-78Q mostrou baixa sobrevivência no dia 20 (30%) (Figura 3). Na verdade, Atxn3-78Q moscas começaram a morrer por dia 10 (7% de mortalidade), e pelo 15 º dia foi a perda significativa (20%), que acelerou nos últimos cinco days. Assim, estes resultados indicaram que a expressão de adultos de um gene patogénico resultou na expectativa de vida reduzida, um sinal chave de fenótipos neurodegenerativas induzidas por Atxn3-78Q. Um dos aspectos mais críticos da presente protocolo foi o manuseamento e preservação das amostras após o congelamento para garantir a qualidade do material extraído. Foram extraídos entre 15-80 ug de ARN total por 200 cabeças (dependendo da idade e do genótipo), antes de tratamento de acordo com DNase NanoDrop. Cerca de um terço (6-25 ug) foram recuperados como RNA altamente puro após DNase tratamento pela razão de absorvância a 260 nm/280 nm. No entanto, verificou-se que a melhor maneira de determinar a qualidade do RNA para a preparação de bibliotecas de cDNA de RNA-seq foi analisar o RNA total no Bioanalyzer. Felizmente, apenas uma pequena quantidade de ARN (5 ng) foi utilizado no Bioanalyzer, portanto, não prejudicar a capacidade de produzir diversas bibliotecas por amostra. Como um exemplo, que funcionou duas amostras do totalRNA antes DNase tratamento num chip Bioanalyzer, um deles suspeito de ser degradada (Figura 4A-C). A elevada qualidade do RNA (amostra 1) produziu três bandas nítidas de ARN, duas apenas abaixo de 2.000 nucleótidos (nt) em tamanho, e uma pequena banda abaixo de 200 nt, que representam os RNAs ribossomais (Figura 4A). As duas bandas de ao redor 2.000 nt correspondem a o rRNA 18S (smaller de pico) e de duas fragmentos a partir de o rRNA 28S (maior do de pico), o que é um aspecto único de rRNA biologia em Drosophila (consulte a Figura 4B). Estas qualidades também foram observados nos traços Bioanalyzer (Figura 4B). Em contraste, uma amostra de RNA degradado (amostra 2) não produzem os picos agudos dos RNAs ribossomais, e acumulou múltiplas bandas de menos de 500 nt (Figura 4A). Esta distribuição de tamanhos foi prontamente distinguido dos traços Bioanalyzer (Figura 4C), em que os picos amplos de menor tamanho foram observados. Também é importante observar wcomo a diferença entre as unidades do eixo y entre as duas amostras de ARN, o que demonstra que a amostra degradada tinha RNA menos. Apenas RNA exibindo a máxima qualidade (rácio NanoDrop de absorvância a 260 nm/280 nm entre 1,8 e 2,1, com 2,1 sendo óptima, ver passo protocolo 3.8) vai ser utilizado para a geração de bibliotecas. Para a extracção dos metabolitos, seguimos uma água clássico / metanol / clorofórmio (2.0:2.0:1.8) extracção procedimento 3 dividida em duas etapas, para maximizar a extracção de metabolitos polares e não-polares 35. Após separação das fases polar e não-polar, é reconstituído em água deuterada ou clorofórmio deuterado, respectivamente, e adicionou padrões internos para análise por RMN. Os espectros de RMN obtidos utilizando este método de extracção foram bem resolvidos com as linhas de base plana e linhas estreitas (Figura 5), indicando a purificação de alta qualidade extratos, adequado tanto para o perfil metabólico umd a identificação de um grande número de metabolitos. Figura 5 mostra a identificação de alguns picos proeminentes correspondendo a metabolitos altamente abundantes, tais como glucose e sacarose, e duas chaves de ácidos metabólicos, lactato e acetato, de acordo com os desvios químicos na literatura 7. O do deslocamento químico (em partes por milhões de) representa o blindagem eletromagnética de uma molécula de parente a uma molécula de standard (TMS, primeiro pico a partir de-se o direito). Shieldedmolecules Mais têm densidade mais alta elétron em torno de o núcleo e irá aparecer para o direito de o espectro de, incluindo alquilos. Moléculas desblindagem tais como amida e hidrogénios aromáticos aparece à esquerda do espectro. A seção do meio ocupado (ppm 3-4) é enriquecido para as moléculas de de açúcar. <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50245/50245fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50245/50245fig1.jpg" /> <strong&gt; Figura 1. Fluxo de trabalho experimental. Primeiro, vamos definir cruzes para coletar moscas dos genótipos desejados (linha superior). Em seguida, passamos virgens a 29 ° C para activar a expressão do gene, a idade deles para 1, 10, e 20 dias, e flash-congelá-los (segunda linha). Nós próxima coletar cabeças congelados usando uma microsieve (terceira linha). As cabeças de são freeze-dried chão, para cima, e tratados, para a extração de RNA (quarta fileira será de) ou os metabolitos (row parte inferior). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50245/50245fig2.jpg" /> A Figura 2. Cinética de de expressão de (A) de Western blot que mostram Atxn3-78Q expressão (Gal80 ts; DA-Gal4 / UAS-Atxn3-78Q). Em moscas-das incubadas em meios com de 29 ° C 0-72 hr. A banda fraca é detectada pela primeira vez em 6 horas e a saturação é atingida por 48 horas após a indução. (B) por imunofluorescência de cérebros inteiros das moscas mesmos. Os cérebros foram dissecados, fixados, umd coradas com um anticorpo que reconhece a proteína poliQ expandida. A proteína é detectada pela primeira vez em cogumelo do corpo (MB) as projecções e os lóbulos antenais (AL). Entre 48 e 72 horas, a expressão atinge níveis máximos e é altamente visível nos centros cerebrais com inervação abundante. O nível de expressão por neurónio é fraca, como visto no lobo óptico (OL), excepto em alguns neurônios grandes entre o OL eo cérebro central. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50245/50245fig3.jpg" /> Figura 3. Atxn3-78Q reduz expectativa de vida voa expressar LacZ, Atxn3-27Q e Atxn3-78Q ubiquitously na fase adulta (Gal80 ts; da-Gal4). Foram monitorados pela sua longevidade a 29 ° C. Moscas expressar LacZ (azul) e Atxn3-27Q (verde) apresentaram níveis baixos de mortalidade por dia 20. Em contraste, as moscas expressando Atxn3-78Q (vermelho) exibidouma mortalidade pronunciada começando no dia 10. De dia 15 mostraram uma redução de 20% da viabilidade, o que acelerou durante os próximos cinco dias, atingindo uma taxa de mortalidade de 70% até o dia 20. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50245/50245fig4.jpg" /> Figura 4. RNA avaliação de qualidade. RNA de alta qualidade e amostras degradadas foi executado em um chip Bioanalyzer. (A) Bioanalyzer executado com uma elevada qualidade de ARN (amostra 1) e uma RNA degradado (amostra 2) ao lado de um marcador de tamanho (faixa da esquerda). Note os três picos pontiagudos correspondentes ao RNA ribossomal na pista central. (B) Bioanalyzer rastreamento para a amostra 1, com dois picos característicos fortes logo abaixo 2.000 nt e outra abaixo de 200. (C) Bioanalyzer o rastreamento para a amostra 2, o qual consiste de RNA na sua maior parte degradadas. Note-se a diferença em unidades de on o eixo-y entre os painéis de B e C. Figura 5. Espectros de RMN representante 1D de metabolitos polares. Representante 1D espectro de RMN de prótons de metabólitos polares de Drosophila e 2D complementar COSY (correlação espectroscopia) e HSQC (heteronuclear correlação quântica único) experimentos para atribuição de pico. Metabolites identificado de acordo com a substância química conhecida turnos de-1: Sucrose; 2: Glucose; 3: Beta-alanina; 4: Acetate; 5: Lactate.

Descrevemos a seguir os processos de extracção e purificação de ARNm e metabolitos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Cabeças. Estamos aplicando essas técnicas para entender melhor as perturbações celulares subjacentes degeneração neuronal. Estas metodologias podem ser facilmente dimensionados e adaptados para outras &quot;mico&quot; projetos.

Purificação de Transcrições e metabolitos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Cabeças

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

O objetivo deste procedimento é obter transcritos e metabólitos de cabeças de drosófila com qualidade e quantidade suficientes para realizar estudos de alto rendimento consistentes. Isso é realizado primeiramente gerando e congelando rapidamente moscas de genótipo e idade apropriados em triplicata. Em seguida, o tecido é preparado para extração separando as cabeças das moscas dos corpos, mantendo o tecido congelado.Em seguida, as cabeças são liofilizadas. Por fim, o tecido é tratado com triol ou clorofórmio para extrair transcritos ou metabólitos, respectivamente. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram que RNA e metabólitos de alta qualidade podem ser obtidos por meio de análise em bioanalisador e por espectroscopia de RMN.Respectivamente, embora este método possa fornecer informações sobre a base celular da neurodegeneração progressiva, ele também pode ser aplicado a outras doenças, como câncer, envelhecimento e distúrbios mediados por estresse. Para começar, realize cruzamentos combinando 10 fêmeas virgens com um transgene de interesse sob o controle de UAS e cinco machos gal sensíveis à temperatura e sem água. Transfira quatro machos para frascos grandes.Rotule os frascos e coloque-os a 25 graus Celsius. Após dois dias, remova os adultos dos frascos e coloque os frascos a 18 graus Celsius. Quando os ELOs prole coletarem virgens, coloque-os em pequenos frascos com alimento para moscas, rotule os frascos e mantenha-os a 18 graus Celsius por 24 horas. Após 24 horas a 18 graus Celsius, transfira os frascos para 29 graus Celsius.Transfira as moscas para tubos limpos a cada dois dias até atingirem os dias 10 e 20. Quando as moscas atingirem a idade desejada, conte-as e use um funil pequeno para transferi-las para tubos criogênicos previamente rotulados. Inverta os tubos sobre a bancada e aguarde 30 minutos.Em seguida, faça uma congelação rápida. Congele os frascos por imersão em nitrogênio líquido e armazene em uma caixa de congelador pré-rotulada e pré-resfriada. Para coletar as cabeças das moscas, monte a peneira e pré-resfrie-a a menos 80 graus Celsius por pelo menos 30 minutos.Resfrie uma peça de paraforma de nove por 14 centímetros em gelo seco durante cinco minutos. Despeje os crioviales sobre a paraforma alguns de cada vez. Use um pincel para contar as moscas e armazene-as em outro criovial em gelo seco até que 100 moscas sejam acumuladas.Em seguida, mergulhe a peneira em nitrogênio líquido e adicione as 100 moscas à câmara superior; agite vigorosamente a peneira por um minuto. Mergulhe-a novamente no nitrogênio líquido e agite por mais um minuto. Abra a peneira.Colete as cabeças da câmara inferior em um tubo micro, e coloque-o a menos 80 graus Celsius até que todas as amostras estejam prontas para serem liofilizadas. Abra os tubos micro, envolva as tampas com filme parafilm e faça pequenos orifícios. Coloque as amostras no liofilizador por um mínimo de dois dias para extrair o RNA.Retire as amostras do liofilizador e adicione três pequenas bolas de aço estéreis a cada microtubo. Coloque no moedor de tecidos e execute a 1.500 golpes por minuto. Por um minuto, adicione um mililitro de triazol e use parafina para selar os tubos; triture por um minuto, bata nos tubos de cabeça para baixo, se necessário, para soltar as bolas de aço, e triture por um minuto adicional.Pipete a mistura para um novo tubo microfugável livre de RNAses. Peliculize os detritos celulares em uma microcentrífuga de bancada a 12.000 × g durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Após transferir o sobrenadante S para um novo tubo microfugável, adicione 0,1 volumes de bromocloropropano e agite vigorosamente por 15 segundos.Incube à temperatura ambiente por três minutos, depois centrifugue a 12.000 ×g por 15 minutos a quatro graus Celsius; transfira a camada aquosa superior para um novo tubo microcêntrifuga. Precipite o RNA adicionando 0,5 volumes de isopropanol gelado e inverta o tubo seis vezes para homogeneizar. Incube a amostra à temperatura ambiente por 10 minutos, depois centrifugue após remover o sobrenadante S.Lave o RNA adicionando um mililitro de etanol a 70% gelado e vortex brevemente. Antes de centrifugar, remova o sobrenadante e seque o pellet ao ar por pelo menos 15 minutos. Adicione 80 microlitros de água DEPC e coloque a 55 graus Celsius por 10 minutos.Em seguida, armazene-o durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte. Determine a concentração de RNA após purificar 30 microgramas de RNA total de acordo com o protocolo descrito no texto e, após determinar a concentração, utilize o ensaio PICO de RNA total em um bioanalisador para avaliar a qualidade do RNA para a purificação de MNA. Coloque um tubo microfúgável livre de RNAses contendo 30 microlitros de esferas magnéticas (dyna beads) em um ímã por um a dois minutos e remova o sobrenadante.Re-suspenda as esferas em 15 microlitros de tampão de ligação. Incube o tubo no ímã e remova o tampão após usar água DEPC para ajustar o volume de cinco microgramas de RNA total para 15 microlitros. Aqueça o RNA a 65 graus C por dois minutos e coloque no gelo.Adicione 15 microlitros de RNA total aos 15 microlitros de microesferas pré-lavadas e incube por 30 minutos à temperatura ambiente. Coloque no ímã por um a dois minutos e remova o sobrenadante. Após a lavagem do RNA três vezes com 35 microlitros de tampão de lavagem B e remoção da última lavagem, elua o MR.NA adicionando 15 microlitros de cloreto de tris frio a 10 milimolares e aquecendo a amostra a 80 graus Celsius por dois minutos.Transfira imediatamente o sobrenadante S para um tubo livre de RNAses e congele a menos 80 graus Celsius. O rendimento deve ser de cerca de 1 a 5% do RNA total para realizar a extração com metilclorofórmio. Comece adicionando butil-hidroxitolueno ao clorofórmio até uma concentração de 0,1 miligrama por mililitro.Transfira 200 cabeças para tubos cónicos de polipropileno com tampa de rosca previamente pesados e resfriados, congele a menos 80 graus Celsius e liofilize após determinar o peso seco. Adicione cinco a sete esferas de zircônia e homogeneíze em um homogeneizador de esferas por dois ciclos de 20 segundos a 800 hertz. Com base no peso seco, calcule as quantidades de água, metanol e clorofórmio a serem adicionadas nas seguintes proporções, onde X é o peso da amostra mais pesada em gramas e o produto é o volume de cada líquido em mililitros para o tubo contendo as cabeças liofilizadas. Adicione todo o metanol calculado e 45% da água total. Após homogeneizar a amostra no homogeneizador de esferas por mais dois ciclos de 20 segundos cada, adicione todo o clorofórmio e a água restante a um vial cônico de vidro sobre gelo.Transfira a mistura de esferas para o vial de vidro e agite por 10 minutos, depois incube por 10 minutos em gelo. Após uma centrifugação por cinco minutos a 2000 vezes G e quatro graus C, use uma pipeta Pasteur para remover a fase polar superior e coloque-a em um segundo tubo microcêntrifugo. Após congelar a fase apolar inferior em um pequeno vial de vidro a menos 80 graus Celsius, seque-a sob um fluxo de gás nitrogênio.Adicione 620 microlitros de clorofórmio desaturado para reidratar a fase não polar. Transfira 600 microlitros para tubos de RMN rotulados e coloque a polifase na Sentri VA a 30 graus Celsius. Execute a Sentri VA até que o tubo esteja completamente seco, em torno de sete horas.Reidrate o politrofo com 620 microlitros de tampão de fosfato de sódio 0,1 molar em óxido de deutério contendo um milimolar de TMSP como padrão interno e vortexie por 30 segundos. Após uma centrifugação a 10.000 RPM e quatro graus Celsius por cinco minutos, transfira 600 microlitros do SUPINATO para tubos de RMN para determinar a dinâmica de expressão do expandido em ataques no gene trench triplo sob o controle de GAL A TTS. Quatro blots de Western foram realizados em diferentes pontos temporais à temperatura restritiva e, conforme mostrado aqui, a expressão foi fraca após seis horas e continuou aumentando até 48 horas, quando atingiu níveis saturados.A proteína também foi detectada por imunofluorescência em cérebros de moscas dissecados primeiramente em 24 horas, atingindo então níveis máximos entre 48 e 72 horas após a mudança de temperatura. Para determinar a toxicidade da ATIN 3 78 Q, coletamos moscas expressando LAX Z aax em 3 27 Q e AAX em 3 78 Q e registramos sua longevidade. Enquanto moscas expressando lack Z e ATEX em 3 27 Q exibiram viabilidade superior a 90% após 20 dias, moscas expressando atex em 3 78 Q mostraram baixa sobrevivência no dia 20. Neste exemplo, duas amostras de RNA total antes do tratamento com DNA foram analisadas em um chip do bioanalisador.A amostra de RNA de alta qualidade um produziu três bandas nítidas de RNA dois logo abaixo de 2000 nucleotídeos de tamanho e uma banda menor abaixo de 200 nucleotídeos, representando os RNAs ribossômicos. Essas características também foram observadas nos traçados do bioanalisador. Em contraste, uma amostra de RNA degradada amostra dois não produziu os picos nítidos dos RNAs ribossômicos e acumulou múltiplas bandas com menos de 500 nucleotídeos.Essa distribuição de tamanho foi facilmente distinguida nos traços do bioanalisador, nos quais picos largos de tamanho menor foram observados. Apenas o RNA que exibe qualidade máxima é utilizado para gerar bibliotecas. A análise de RMN nesta figura identifica alguns picos proeminentes correspondentes a metabólitos altamente abundantes, como glicose e sacarose, e dois ácidos metabólicos principais, lactato e acetato, de acordo com os deslocamentos químicos descritos na literatura.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como obter transcritos e metabólitos de alta qualidade a partir de grandes coleções de cabeças de Joss, o que permitirá revelar as perturbações moleculares e celulares induzidas por amiloides tóxicos que medeiam a perda de células neuronais.

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Vigilância de todo o genoma de erros de transcrição em organismos eucarióticos

Aqui, apresentamos um protocolo de dissociação de célula para isolar eficientemente células presentes em baixa abundância dentro do sistema visual de Drosophila através de célula de fluorescência ativada classificação (FACS).

Purificação de células Low-abundante no sistema Visual da drosófila

Aqui, nós apresentamos um protocolo para dissociar e classificar uma população específica da pilha das glândulas acessórias masculinas de Drosophila (pilhas secundárias) para o sequenciamento do RNA e o RT-qPCR. A isolação da pilha é conseguida com a purificação de FACS de pilhas secundárias GFP-expressando após um processo multistep-dissociation que exige a dissecção, a digestão dos proteases e a dispersão mecânica.

Um protocolo baseado em FACS para isolar o RNA das células secundárias de glândulas acessórias masculinas de Drosophila

Com base no mecanismo de montagem do complexo proteico INAD, neste protocolo, foi desenvolvida uma purificação de afinidade modificada mais estratégia de concorrência para purificar o canal endogenso Drosophila TRP.

Purificação dos canais potenciais do receptor transitório Endogenous Drosophila

Aprenda a purificar mRNA e metabolitos de cabeças de Drosophila para estudos de neurodegeneração. Este método de extração de alta qualidade permite análises de alto rendimento em biologia molecular.

Purificação de Transcrições e metabolitos de

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