Name: Padronização de células co-cultura Usando duas fases aquosas Sistemas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Aprenda a padronizar células em sistemas de duas fases aquosas usando polímeros de polietilenoglicol e dextrano. Este método permite organizar espacialmente diferentes populações celulares de forma rápida e eficiente para aplicações em engenharia de tecidos.

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Este trabalho foi financiado pela Fundação Coulter, Fundação Beyster, a oportunidade de Pesquisa de Graduação (UROP) programa de verão para ATA e um National Science Foundation Graduate Student Research Fellowship (Grant DGE não 0718128; ID:. 2010101926) para JBW.

1. Caracterização fase do sistema: Limiares determinante para a Separação de Fase <ol><li> Preparar soluções contendo PEG e DEX no tampão desejado, ou meio de cultura celular, como mostrado na Figura 1 (pontos roxos) em 15 ml ou 50 ml de tubos cónicos. Daqui por diante, o PEG e DEX se referirá a 35 kDa PEG e DEX 500 kDa, no entanto, concentrações críticas vão mudar dependendo dos dois polímeros usados. Registar a massa de PEG e DEX em cada solução. Soluções de alta concentração de polímeros pode levar várias horas para dissolver. Vórtice pode ser utilizado para as soluções isentas de soro. Para meios contendo soro ou proteínas, colocar os tubos em um estágio de balanço até que ambos os polímeros são completamente dissolvido. Registar o peso dos meios de comunicação utilizados para dissolver os polímeros e tomar nota das concentrações iniciais. </li><li> Uma vez que os polímeros estão completamente dissolvidos, as soluções devem aparecer turva. Esta é a primeira indicação de que a separação de fases ocorreu. Para confirmar isso, permitir que osoluções de polímero a descansar numa posição vertical à temperatura ambiente durante 20 min. Centrifugação a 1000 xg pode ser utilizado para acelerar o processo de separação de fases. A fase inferior mais densa será DEX-rico e a fase de topo será PEG-rico. </li><li> Lentamente, adicionar tampão adicional ou de mídia para os tubos. Pequenos incrementos deverá ser utilizado de modo a não ultrapassar o ponto de separação de fases. </li><li> Quando a solução torna-se clara e não se separa da fase após a centrifugação, o limiar para a separação de fases foi atingido. Registar o peso final do tubo. </li><li> Utilizando os pesos anteriores registadas para os polímeros, juntamente com o peso final após a adição de meios de comunicação, determinar a% em peso / peso de cada um dos dois polímeros em que a separação de fase não ocorre. </li><li> Traçar estes valores como PEG% p / p sobre o eixo y e% wt / wt DEX sobre o eixo x. Esta trama, conhecido como a curva binodal, pode ser usado para determinar a concentração de limiar de separação de fases para Concentrati diferenteComplementos de PEG / DEX em um meio de cultura de células específico. </li></ol> 2. Configuração 1: Padronização de exclusão (formato de 96 poços Plate) <ol><li> Preparar soluções separadas de 5,0% p / p de PEG e 12,8% em peso / peso DEX em meio de cultura de células. Use ATPS soluções de pelo menos duas vezes o ponto crítico para assegurar que um ATPS permanece após os polímeros de equilibrar-se com respeito ao outro. Há uma pequena quantidade de fluxo de DEX para a fase rica em PEG e vice-versa, por isso, trabalhar muito perto da concentração crítica pode resultar em perda de fase do sistema em termos de concentração gota abaixo do ponto crítico. Da mesma forma, a transferência da placa de cultura de células para uma incubadora com humidade e temperatura controlada pode alterar as propriedades de duas fases e tornar as duas soluções miscíveis. Nota: Algumas células podem ter um melhor desempenho com outras formulações ATPs. Formulações aceitáveis ​​podem ser seleccionados com base nas curvas de binodais determinados a partir da parte 1. </li><li> Colheita das células a serem usadas para a exclusão patterning. Determinar o número total / concentração de células disponíveis. Opcional: rotular as células com CellTracker ou outros não-citotóxicos rótulos para microscopia de fluorescência. </li><li> Agregar as células e ressuspender o sedimento em um volume apropriado de 5,0% de PEG para obter o número desejado de células por exclusão. Por exemplo, um poço de uma placa de 96 poços requer 37500 células de fibroblastos de ser ressuspensas em 200 ul de PEG para produzir confluência no dia seguinte. Dimensionar estes números como apropriado para outros tipos de células e tamanhos de substratos de cultura. </li><li> Usando uma micropipeta, dispensar 0,5 ul de gotas de DEX sobre um substrato de cultura de células secas. Gotas maiores volumes maiores produzem zonas de exclusão. Que variam em tamanho de gotículas 0,1-1 ul são recomendados para micropatterning exclusão. Opcional: DEX gotículas podem ser depositados 24 hr antes do tempo permitido para desidratar e à temperatura ambiente. Isso pode produzir padrões mais limpas. </li><li> Pipetar 200 ul de suspensão de células em PEG tele bem para cobrir as gotículas de DEX. </li><li> Coloca-se num incubador humidificado durante 12 horas a 37 ° C, 5% CO 2. Certifique-se de que o prato não é inclinada durante o manuseio e que está colocado sobre uma prateleira incubadora nível para evitar a perturbação dos padrões. </li><li> Remover a solução de PEG e lavar três vezes com 200 ul de meio de cultura. </li><li> Adicionar meio de cultura fresco e de retorno para a incubadora. </li><li> Monitorar as culturas periodicamente para observar a movimentação das células para a zona de exclusão. </li></ol> 3. Configuração 2: Padronização Island (formato de 96 poços Plate) <ol><li> Preparam-se soluções de 5,0% p / p de PEG e 12,8% em peso / peso DEX em meio de cultura de células, como descrito acima. </li><li> Colheita das células a serem usadas para padronização ilha. Determinar o número total / concentração de células disponíveis. </li><li> Pellet e ressuspender as células em um volume apropriado de 12,8% DEX para alcançar a concentração desejada de células por patterning ilha. As concentrações de 5000 cells / ul ou menos são recomendados para os tipos de células fortemente aderentes. Para as células que têm dificuldade em fixar ou células que aderem fracamente, concentrações de até 10.000 células / uL pode ser considerada. </li><li> Trabalhar rapidamente, para evitar a secagem, as gotas de pipeta 0,5 ul de DEX sobre um substrato seco de células de cultura, como descrito acima. Não permitir que as gotas para secar. Opcional: 200 ul de solução de PEG pode ser adicionado ao poço antes do tempo. DEX gotículas pode então ser depositado na solução de PEG, onde irá afundar para o fundo e a superfície de contacto da cultura. Isso pode produzir padrões mais limpas da ilha. </li><li> Cobrir as gotículas DEX com 200 uL de PEG. </li><li> Coloca-se num incubador humidificado durante 12 horas a 37 ° C, 5% CO 2. Certifique-se de que o prato não é inclinada durante o manuseio e que está colocado sobre uma prateleira incubadora nível para evitar a perturbação dos padrões. </li><li> Remover a solução de PEG e lavar três vezes com 200 ul de meio de cultura. </li><li> Adicionar nova culturamédio e de retorno para a incubadora. </li><li> Monitorar as culturas periodicamente para observar a movimentação das células e para fora de proliferação das ilhas. </li></ol> 4. Configuração 3: Exclusão Co-culturas (formato de 96 poços Plate) <ol><li> Preparam-se soluções de 5,0% p / p de PEG e 12,8% em peso / peso DEX em meio de cultura de células, como descrito acima. </li><li> Colheita das células a serem usadas para a exclusão e padronização ilha. Determinar o número total / concentração de células disponíveis para cada tipo de célula. Opcional: Alguns pares de células podem exibir índices de proliferação significativamente diferentes. Para evitar que as células excluídas superpopular as células insulares estampados (especialmente para culturas de longo prazo), o tratamento das células utilizadas para a exclusão com mitomicina C, durante 2 horas ou irradiar-los antes da colheita. Isto irá evitar a proliferação. CellTracker corantes fluorescentes podem ser usadas para distinguir as duas populações de células, se necessário. </li><li> Agregar as células e ressuspender o sedimento de exclusion padronização em um volume apropriado de 5,0% de PEG para obter o número desejado de células, como descrito acima. Ressuspender o sedimento em patterning ilha em um volume apropriado de 12,8% DEX para conseguir a concentração desejada de células, como descrito acima. </li><li> Usando uma micropipeta, dispensar 0,5 ul de gotas de suspensão de células de DEX sobre um substrato de cultura de células secas. Não permitir que as gotas para secar. </li><li> Cobrir as gotículas DEX com 200 ul de suspensão de células PEG. </li><li> Coloca-se num incubador humidificado durante 12 horas a 37 ° C, 5% CO 2. Certifique-se de que o prato não é inclinada durante o manuseio e que está colocado sobre uma prateleira incubadora nível para evitar a perturbação dos padrões. </li><li> Remover a solução de PEG e lavar três vezes em 200 ul de meio de cultura. </li><li> Adicionar meio de cultura fresco e de retorno para a incubadora. </li><li> Monitorar as co-culturas de observar a interação entre populações de células. Opcionais: Os controles podem ser preparados através da realização de exclusão ou ilha padronização individually, por co-cultura de células que não interagem ou bloqueando as vias de interesse em uma ou ambas as populações de células antes ou depois da modelação. </li></ol>

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Os autores não têm concorrência de interesses financeiros.

A ATPS método micropatterning célula exige conhecimentos muito pouco além de proficiência em técnicas de cultura de células e podem ser rapidamente dominado. As vantagens desta abordagem são que é barato, rápido e compatível com uma variedade de tipos de células e formatos de cultura. Por estas razões, o nosso protocolo deve ser adotada facilmente por cientistas da vida, particularmente aqueles que estudam a proliferação celular, migração e quimiotaxia, e da influência de interações juxtacrine e parácrina entre populaçõ...

De duas fases aquosas sistemas (ATPSs) formam-se quando as soluções de dois polímeros incompatíveis são misturados em conjunto em concentrações suficientemente elevadas. A separação de fases é influenciada por uma série de factores que incluem o peso molecular e polaridade dos polímeros, a temperatura da solução, pH e teor iónico do solvente aquoso de 1, 2. O ponto em que as duas soluções poliméricas separadas, é determinada pelas propriedades físico-químicas do sistema de fase escolhida, mas geralmente ocorre em baixas concentrações de polímero (inferiores a 20% wt / wt), sob condições não desnaturantes, permitindo ATPSs a ser utilizado para a biotecnologia 3-9 aplicações. De longe, os mais extensivamente estudados ATPS é o polietileno glicol (PEG) / dextrano sistema (DEX). Os ATPS formadas por estes polímeros de baixo custo e biocompatível foi originalmente descrita para a purificação de biomoléculas por meio de particionamento molecular de 2, 10. Particionamentoocorre quando as moléculas ou partículas adicionais que não contribuem para o sistema de fases são misturadas com PEG e DEX. Com base nas suas afinidades relativas para ou DEX ou PEG, as moléculas ou partículas será preferencialmente residir dentro de uma das duas fases, ou na interface. Outra propriedade do SDFA PEG / DEX é a existência de tensão interfacial entre as duas fases de polímero. ATPSs formados por PEG e DEX geralmente exibem as tensões interfaciais, que são muito mais baixos do que outras fases líquido-líquido e dois sistemas, tais como óleo e água, no entanto, as forças de tensão interfacial ainda exercem efeitos em pequenas partículas, tais como vírus, células e agregados de proteína 2 , 11-13. Finalmente, visto que um maior peso molecular de PEG e DEX separado em concentrações baixas (inferiores a 5% em peso / peso para polímeros de alto peso molecular variedades), na presença de concentrações fisiológicas de sais, há poucos ou nenhuns efeitos nocivos sobre as células de mamíferos incorporado dentro destas sistemas14-16. Recentemente, as propriedades interfaciais e efeitos de particionamento de ATPSs foram aplicadas por nosso laboratório para padronização de células 14, 16-20. Isto foi conseguido por uma densa micropatterning solução DEX em substratos de cultura de células na presença de PEG. Quando as células são incorporados na fase de PEG, são excluídos de entrar nas gotículas de DEX, devido a PEG / DEX tensão interfacial 20. Quando as células são modelados na fase de DEX, eles são retidos na superfície do substrato de cultura de células por tensão interfacial e partição 16, 17, 19. Em contraste com outros métodos de padronização celular, ATPS padronização celular é fácil de aprender e requer apenas conhecimentos rudimentares sobre os polímeros em si, e da capacidade de realização de cultura de células e usar uma micropipeta. Outros métodos para padronização de células muitas vezes envolvem equipamentos especializados e treinamento que não são facilmente traduzidos para poe ciências da vida. Por exemplo, alguns métodos (microcontact impressão ou impressão a jacto de tinta) células padrão indirectamente mediante a aplicação de padrões de biomoléculas adesivas de células a um substrato de cultura que, posteriormente, servir como locais para ligação de células 21, 22. Embora as abordagens indirectas são úteis para alguns tipos de células, elas requerem um elevado grau de destreza do utilizador e equipamento especializado para fabricar a ferramenta de modelação, e pode carecem de especificidade, dependendo do tipo específico de célula padrão / biomolécula. Alternativamente, as células podem ser depositadas com uma especificidade elevada padrão por meio de métodos de modelação directos, que incluem padrões de fluxo laminar stenciling, e impressão jacto de tinta 23-26. No entanto, essas técnicas também requerem perícia do utilizador e equipamento especializado e podem danificar as células durante o processo de impressão. Embora estes métodos geralmente produzem padrões precisos de células, para padronização célula para ser uma ferramenta útil nas ciências da vida, deve ser rentável umª simples de implementar. Relatamos aqui um protocolo detalhado para a geração de culturas de células utilizando os estampados ATPSs descritos nos nossos pedidos anteriormente publicados-. Usando apenas micropipetas, os usuários podem gerar zonas de exclusão de células ou ilhas de células para os ensaios de migração. Isto é conseguido por meio de PEG / DEX tensão interfacial ou que retém as células na fase de DEX ou exclui células depositadas na fase de PEG de DEX. Combinando estas duas técnicas fundamentais de modelação, é possível gerar rapidamente co-culturas de células, tais como fibroblastos de células de fígado de co-culturas. Métodos de padronização, os parâmetros e os resultados esperados ATPS são descritos em detalhe.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Fabricante </td></tr><tr><td> Dextran 500.000 kDa </td><td> Pharmacosmos, Dinamarca </td></tr><tr><td> Polietilenoglicol 35000 kDa </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td></tr><tr><td> Hela </td><td> ATCC, Manassas, VA </td></tr><tr><td> HepG2 C3A </td><td> ATCC, Manassas, VA </td></tr><tr><td> NIH 3T3 </td><td> ATCC, Manassas, VA </td></tr><tr><td> Rastreador de celular </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco, Carlsbad, CA </td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Gibco, Carlsbad, CA </td></tr><tr><td> F12 </td><td> Gibco, Carlsbad, CA </td></tr><tr><td> Soro Fetal Bovino </td><td> Gibco, Carlsbad, CA </td></tr></tbody></table>

padronização de células co-cultura usando duas fases aquosas sistemas

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Padronização de tecnologias de células que são rápido, fácil de usar e acessível será necessário para o futuro desenvolvimento de ensaios de alto rendimento, plataformas de celulares para o estudo de interações célula-célula e sistemas de engenharia de tecidos. Este protocolo detalhado descreve um método para a geração de co-culturas de células utilizando soluções biocompatíveis de dextrano (DEX) e polietileno glicol (PEG), que separada da fase quando combinado acima das concentrações de limiar. As células podem ser estampados em uma variedade de configurações que usam este método. Patterning exclusão de células pode ser realizada através da impressão de gotículas de DEX sobre um substrato e cobrindo-os com uma solução de PEG que contêm as células. A tensão interfacial formada entre as duas soluções poliméricas de células faz com que a cair em torno do lado de fora da gotícula de DEX e formar uma clareira circular que pode ser usado para ensaios de migração. Ilhas de células pode ser modelado por meio da supressão de uma célula fase rica DEX em uma solução de PEG ou cobrindo o DEXgota com uma solução de PEG. Co-culturas podem ser formados directamente através da combinação de exclusão de células com DEX patterning ilha. Estes métodos são compatíveis com uma variedade de abordagens para manipulação de líquidos, incluindo micropipetting manual, e pode ser usado com virtualmente qualquer tipo de célula aderente.

Para selecionar uma combinação apropriada de PEG e DEX para padronização de células é importante para determinar a curva binodal. Esta curva de delineia os pontos em que se podem formar um ATPS e pode variar para um dado conjunto de polímeros com base em temperatura, pH e teor iónico. Para a cultura de células que requerem formulações médias personalizadas que podem ser necessários para determinar experimentalmente a curva binodal. Isto é conseguido através da geração de uma série de ATPSs que estão longe do binodal e v...

De duas fases aquosas sistemas foram usados ​​para as populações em simultâneo múltiplos padrões de células. Este método fácil e rápido para a padronização de células tira vantagem da separação de fases de soluções aquosas de dextrano e polietileno glicol e a tensão interfacial que existe entre as duas soluções poliméricas.

Padronização de células co-cultura Usando duas fases aquosas Sistemas

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

O objetivo geral deste procedimento é padronizar diretamente células em ambientes totalmente aquosos. Isso é realizado primeiramente pela dissolução de polímeros de cadeia longa, como polietilenoglicol e dextrina, em tubos separados contendo meio de cultura celular. O segundo passo é tripsinizar, colher o pellet e ressuspender as células na densidade de semeadura desejada em uma ou ambas as soluções poliméricas.Em seguida, as soluções poliméricas são dispensadas em uma placa de cultura celular. A incompatibilidade entre os dois polímeros permite o padrão espacial dos dois líquidos totalmente aquosos. As células podem ser incluídas em qualquer uma das soluções poliméricas ou em ambas as soluções poliméricas para produzir uma variedade de padrões.O passo final consiste em remover as soluções poliméricas após as células terem sido deixadas aderirem por quatro horas ou mais e substituí-las por meio de cultura. Por fim, pode-se utilizar microscopia de campo claro ou de fluorescência para confirmar o padrão celular. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a impressão por microcontato, é que as células são padronizadas em um ambiente inteiramente aquoso, u

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Um protocolo para impressão robótica de esferoides de células cancerígenas em um formato de placa de 96 poços de alto rendimento usando um sistema aquoso de duas fases é apresentado.

Produção Robotic da Cancer Cell Spheroids com um sistema aquoso bifásico para Drug Testing

Descrevemos um protocolo para modificar a afinidade celular de uma superfície de andaime em ambiente aquoso. O método aproveita a fotocatálise de dióxido de titânio para decompor o filme orgânico na região foto-irradiada. Mostramos que ele pode ser usado para criar microdomínios de proteínas de andaimes, tanto ex situ quanto in situ.

Photopatterning proteínas e células em Aqueous Ambiente Usando TiO<sub&gt; 2</sub&gt; Photocatalysis

Apresentamos um protocolo para realizar a padronização subtrativa de monocamadas de células vivas em uma superfície. Isso é obtido pela lise local e seletiva das células aderentes usando uma sonda microfluídica (MFP). O lisado celular recuperado de regiões locais pode ser usado para análise a jusante, permitindo estudos de perfil molecular.

Padronização Subtractive rápida de camadas de células vivas com uma Probe microfluídicos

Descrevemos um processo sequencial para formação mediada por luz e subsequente padronização bioquímica de matrizes de hidrogel sintético para aplicações de cultura de células tridimensionais. A construção e modificação de hidrogéis com química de fotoclique citocompatível é demonstrada. Além disso, são apresentadas técnicas fáceis para quantificar e observar padrões e determinar a viabilidade celular dentro desses hidrogéis.

Formação Light-mediada e padronização de hidrogéis para aplicações de cultura celular

Este relatório descreve uma técnica simples e fácil de executar, usando vácuo de baixa pressão, para preencher canais microfluídicos com células e substratos para pesquisa biológica.

Um método versátil de padronização proteínas e células

Aqui apresentamos um protocolo para células de micropattern em resolução unicelular usando a adesão programada pelo DNA. Este protocolo usa uma plataforma de fotolitografia benchtop para criar padrões de oligonucleotídeos de DNA em um slide de vidro e, em seguida, rotula membranas celulares com oligonucleotídeos complementares disponíveis comercialmente. A hibridização dos oligos resulta em adesão celularprogramada.

Padronização simples, acessível e modular de células usando DNA

Tradicionalmente, a cultura celular é realizada em substratos planares que imitam mal o ambiente natural das células in vivo. Aqui descrevemos um método para produzir substratos de cultura celular com geometrias curvas fisiologicamente relevantes e proteínas extracelulares micropatteradas, permitindo investigações sistemáticas sobre o sensoriamento celular dessas pistas extracelulares.

Geração de Microambientes Celulares Multicue por UV-Fotopatterning de Substratos de Cultura Celular Tridimensional

Este protocolo descreve um método de padronização de células sem tinta, sem rótulo, independente de substrato e de alto rendimento, baseado no efeito Arquimedes Magnético.

Padronização de células usando a estratégia Magnetic-Archimedes

O protocolo mostra um novo modelo experimental in vitro que pode recapitular a biologia de dois tipos de linhagens celulares aderentes com um andaime impresso em tridimensional (3D). A construção deste modelo e os procedimentos operacionais, desde a preparação e cultura celular até a análise e avaliação, são descritos.

Modelo de co-cultura usando dois tipos de linhagens celulares aderentes

A técnica de litografia versátil plasma foi desenvolvido para gerar padrões de superfície estável para orientar adesão celular. Esta técnica pode ser aplicada para criar redes de células, incluindo as que imitam tecidos naturais e tem sido usada para estudar vários tipos de células distintas.

Padronização de plasma de superfície litografia para a Criação de Redes de celular

Aprenda a padronizar células em sistemas de duas fases aquosas usando polímeros de polietilenoglicol e dextrano. Este método permite organizar espacialmente diferentes populações celulares de forma rápida e eficiente para aplicações em engenharia de tecidos.

Padronização de células co-cultura Usando duas fases aquosas Sistemas

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