Padronização de células co-cultura Usando duas fases aquosas Sistemas

O objetivo geral deste procedimento é padronizar diretamente as células em ambientes totalmente aquosos. Isso é feito dissolvendo primeiro polímeros de cadeia longa, como polietilenoglicol e dextrina em tubos separados contendo meio de cultura celular. O segundo passo é tripsizar anize, colher pellets e ressuspender células na densidade de semeadura desejada em uma ou ambas as soluções poliméricas.

Em seguida, as soluções de polímero são dispensadas em uma placa de cultura de células. A incompatibilidade dos dois polímeros permite a padronização espacial dos dois líquidos totalmente aquosos. As células podem ser incluídas em qualquer solução polimérica ou em ambas as soluções poliméricas para produzir uma variedade de padrões.

A etapa final é remover as soluções de polímero assim que as células aderirem por quatro horas ou mais e substituí-las por meio de cultura. Em última análise, a microscopia de campo claro ou fluorescência pode ser usada para confirmar o padrão celular. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a impressão de micro contato, é que as células são padronizadas em um ambiente totalmente aquoso com ferramentas simples, como padrões de micro tubos.

Este método pode ser usado para engenharia de tecidos para avaliar a migração celular e investigar a sinalização percrina e autócrina célula a célula, demonstrando que os procedimentos serão Abraham, um estudante de graduação, e Joshua White, um estudante de pós-graduação do laboratório de Takayama. Comece dissolvendo os dois polímeros diferentes no meio específico que será usado em seus experimentos. Neste exemplo, o polietilenoglicol, também conhecido como PEG e a Dextrina, também conhecida como Dex, têm pesos moleculares de 35 kilodaltons e 500 kilodaltons, respectivamente.

Prepare 16 amostras de dois mililitros em tubos cônicos de 15 mililitros, cada um com diferentes concentrações de PEG e dex, semelhante ao gráfico mostrado aqui. Para conseguir isso, pese as quantidades apropriadas de PEG e dex de acordo com o gráfico e misture-as no meio, balançando-as suavemente até que ambos os polímeros estejam totalmente dissolvidos. Isso pode levar várias horas após os polímeros estarem totalmente dissolvidos.

A solução deve ser nebulosa. Confirmar a separação de fases centrifugando as amostras a 1000 Gs durante cinco minutos. A fase inferior mais densa será rica em dex.

A fase superior será rica em pinos. Em seguida, adicione lentamente 0,1 mililitros de meio adicional aos tubos e vortex as amostras por 20 segundos. Em seguida, centrifugue novamente as amostras para verificar a separação de fases.

A solução fica límpida após a adição de volumes adicionais de meio, repita esta etapa adicionando mais 0,1 mililitro de meio misturando e centrifugando as amostras até que a solução fique límpida e não se separe mais de fases. Isso indica que o limite de ponto crítico foi atingido para essa mistura específica. Registre o peso final de cada tubo neste ponto.

Finalmente, determine a porcentagem de peso por peso dos dois polímeros no ponto de separação da face. Plote a curva nodal do compartimento, colocando a peg de peso percentual por peso no eixo y e os decks de peso percentual por peso no eixo X. Esta curva é o limite de concentrações para a separação facial de PEG e dex neste meio.

Para iniciar o padrão de exclusão de células, prepare soluções separadas de PEG e dex com o dobro de seus valores de ponto crítico, conforme determinado pelo limiar nodal do bin. Para esses experimentos, 5% de peso por peso PEG e 12,8% de peso por peso são adicionados ao DMEM com 10% de FBS e 1% de antibióticos. Os tubos são colocados em um balancim para que se dissolvam completamente.

Em seguida, colha as células a serem usadas para padronização de exclusão para este experimento, as células hela a 80% de confluência são tripas usando 0,5% de tripsina por três minutos. Uma vez colhidas, conte o número de células usando um hemocitômetro, em seguida, faça um pellet e ressuspenda as células a 375.000 células por mililitro em meio com 5% de PEG adicionado. Essa concentração produzirá amostras que, quando cultivadas, se tornarão confluentes no dia seguinte.

Em seguida, usando um micropipetador, dispense gotículas de 0,5 microlitro da solução de deck de 12,8% em uma placa seca de 96 poços para padronização de exclusão. As gotículas de Dex podem secar em condições estéreis para uso posterior. Em seguida, dispense 200 microlitros de suspensão de células PEG hela no poço lentamente.

Para cobrir as gotículas D, é importante primeiro cobrir a gota D com a solução PEG antes de preencher as áreas circundantes, pois isso evita que ela interrompa a gotícula quando ela se espalha pelo poço. Depois que todos os poços forem padronizados e semeados cuidadosamente, coloque a placa de cultura de células em uma incubadora umidificada. Certifique-se de que o prato não seja inclinado durante o manuseio e que seja colocado em uma prateleira nivelada da incubadora para evitar interromper os padrões após as células terem aderido por 12 horas.

Remova a solução de PEG e lave três vezes com 200 microlitros de meio de cultura para remover quaisquer polímeros residuais. Em seguida, adicione 200 microlitros de meio de cultura fresco e retorne a placa à incubadora. Monitore as culturas periodicamente para observar a proliferação e migração celular para as zonas de exclusão Para iniciar o padrão da ilha.

Prepare soluções de 5% de peso por peso de PEG e 12,8% de peso por peso em meio de cultura de células. Colha também as células hela a serem usadas para padronização de ilhas e, novamente, determine o número total de células disponíveis usando um hemocitômetro. Em seguida, pellet e resus.

Gire as células a 5 milhões de células por mililitro em meio. Continuando com 12,8% dex, uma concentração mais alta de células pode ser necessária para atingir a confluência em 24 horas se as células não aderirem tão bem quanto as células heela. Em seguida, pipete 200 microlitros de solução de PEG em cada poço de uma placa de 96 poços.

Em seguida, adicione lentamente uma gota de 0,5 microlitro de suspensão de células de convés em cada poço contendo a solução de PEG. As gotículas afundarão e entrarão em contato com a superfície da cultura. Em seguida, transfira cuidadosamente a placa para a incubadora, tomando cuidado para não inclinar a placa em nenhum ponto, o que pode atrapalhar os padrões após 12 horas.

Retirar a solução de PEG e lavar três vezes com 200 microlitros de meio de cultura. Em seguida, adicione 200 microlitros de meio de cultura fresco e retorne a placa à incubadora. Monitore as culturas periodicamente para observar a proliferação celular e a migração para fora das ilhas.

Comece a padronização de co-cultura preparando soluções de 5% de peso por peso PEG e 12,8% de peso por peso decks em DMEM com 10% FPS e 1% de antibióticos também aumentam os dois tipos de células a serem usados na exclusão e padronização de ilhas, para que fiquem perto da confluência. Ao mesmo tempo, usaremos Hep G duas ilhas de hepatócitos C3 a com NIH três fibroblastos T três ao seu redor. Em seguida, colha os dois tipos de células e conte-os separadamente usando um hemocitômetro.

Esses dois tipos de células podem ser facilmente distinguidos usando pellets de microscopia de campo claro, os hepatócitos Hep G dois C3 A para padronização de ilhas e resus gastam em decks de 12,8%. Em seguida, coloque os fibroblastos para exclusão, padronização e resus suspensos em 5% peg. Em seguida, dispense gotículas de 0,5 microlitro de suspensão de células D em uma placa seca de 96 poços e cubra as gotículas dex suavemente com 200 microlitros de suspensão de células de pinos.

Em seguida, transfira a placa para uma incubadora após 12 horas. Remova o meio e enxágue três vezes com 200 microlitros de meio de cultura. Em seguida, adicione 200 microlitros de meio de cultura fresco e retorne a placa à incubadora.

Finalmente, monitorar a intensidade da coloração de coculturas de albumina pode ser usado para avaliar os efeitos benéficos da cocultura de fibroblastos. As concentrações de polímero necessárias para formar uma variedade de sistemas aquosos bifásicos são descritas aqui pelas curvas nodais do compartimento em concentrações acima da curva nodal do compartimento. O sistema forma duas fases abaixo da curva nodal do compartimento.

A solução é um sistema monofásico transparente de pelo menos duas vezes. As concentrações daquelas encontradas na curva binal são suficientes para uso nos sistemas aquosos bifásicos descritos neste vídeo. O primeiro exemplo de seu uso é um padrão de exclusão em que pequenas áreas podem ser deixadas vazias de células.

O padrão de ilha cria exatamente o oposto do padrão de exclusão, onde pequenas regiões podem ser assentadas com células. A combinação desses dois procedimentos pode ser utilizada para formar uma co-cultura única, onde uma ilha de células pode ser cercada por outro tipo de célula, conforme mostrado aqui. As células Hela plaqueadas usando padrões de exclusão proliferarão e migrarão para preencher o vazio.

Com o tempo. O tamanho do vazio pode ser monitorado para fornecer informações valiosas sobre a migração e o crescimento celular sob condições variadas. O padrão de ilha, por outro lado, pode ser usado para medir o crescimento celular.

A combinação de padrões de ilha e exclusão produz regiões bem definidas de co-cultura. Aqui são mostradas ilhas de hepatócitos cercadas por células de fibroblastos. Descobriu-se que essas colônias mantêm sua organização por pelo menos quatro dias em cultura.

Usando este sistema, várias ilhas de células podem ser cultivadas na mesma placa. Quando cultivados apenas como ilhas, os hepatócitos produziram um pouco menos de albumina do que quando cultivados em co-cultura com fibroblastos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar concentrações de polímeros com o dobro da concentração crítica para formar soluções bifásicas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como formular um sistema aquoso de duas fases e usá-lo para padronizar células e definir geometrias.