O tomate / GFP-FLP / FRT Method for Imaging ao vivo de Mosaico Adulto Drosophila As células fotorreceptoras

O objetivo geral do experimento a seguir é analisar o desenvolvimento e a sobrevivência de neurônios fotorreceptores em mosaico na retina de drosófilas vivas. Isso é conseguido cruzando um estoque de mosca, carregando uma mutação recombinada em um cromossomo FRT com um estoque de tomate G-F-P-F-L-P-F-R-T. Na progênie, os clones de mosaico são gerados por recombinação mitótica durante o desenvolvimento.

Como segundo passo, as moscas vivas são incorporadas aos aeros, o que mantém a mosca imóvel. Em seguida, a retina da mosca viva imobilizada é fotografada com um microscópio confocal para visualizar os neurônios fotorreceptores do mosaico, todos os fotorreceptores expressam a proteína fluorescente verde, GFP, o tipo selvagem e os fotorreceptores heterozigotos expressam a proteína fluorescente vermelha tomate na imagem de mesclagem. Os receptores mutantes homozigotos são verdes, enquanto os fotorreceptores do tipo selvagem e heterozigotos são amarelos.

São obtidos resultados que mostram defeitos de desenvolvimento e degeneração de neurônios fotorreceptores com base na visualização da mesma mosca ao longo de dias a semanas. O método de tomate, G-F-P-F-L-P-F-A pode ajudar a responder a perguntas rápidas no campo da degeneração neuronal e demonstrar a necessidade de genes específicos para a sobrevivência e função dos fotorreceptores na mosca adulta. Este método também é útil para abordar questões de S em mutantes que afetam o desenvolvimento, como aqueles em que o estabelecimento da polaridade das células PNA é afetado em comparação com a secção histológica clássica da retina.

A primeira vantagem desse método é que ele é rápido e, portanto, pode ser usado para triagem de fluxo de gelo. A segunda vantagem desse método é que ele é feito em drosófilas vivas, o que permite a análise do curso do tempo da degeneração dos fotorreceptores em um único nível celular e ao longo de várias semanas. Para visualização dos fotorreceptores pela técnica de neutralização da córnea, as moscas devem ser imobilizadas em placas aros.

Comece enchendo uma garrafa de esguicho com água e coloque-a no gelo. Em seguida, prepare 200 mililitros de 1,5%aros e mantenha-o a 55 graus Celsius até que seja usado. Agora, anestesie as moscas com CO2 por pelo menos um minuto.

Despeje a solução de aros quente em uma placa de Petri de 35 milímetros ou 65 milímetros e coloque imediatamente a drosófila anestesiada no aros. Comece com 10 moscas por prato. Ao aprender a técnica com a prática, até 20 moscas podem ser rastreadas simultaneamente.

Sob um microscópio de dissecação, oriente uma drosófila de lado com uma pinça. Empurre uma asa para dentro do aros de forma que a asa e metade do corpo fiquem embutidas no aros. Cole a outra asa na superfície do aros.

A cabeça não está embutida. Se as moscas não estiverem profundamente incorporadas, a mosca estará livre para mover a cabeça causando problemas. Altas temperaturas do aros podem danificar as córneas, mas se o aros estiver muito frio, será difícil incorporar a mosca.

Assim que todas as moscas estiverem embutidas, transfira o prato para o gelo e deixe o agros solidificar. Assim que o aros estiver solidificado, retorne o prato ao escopo e oriente cada cabeça de forma que um olho fique exposto à objetiva de imersão. Quando a pseudopupila, a mancha escura está no centro do olho, a cabeça está bem orientada.

Além disso, remova todas as pernas ou risi que obscurecem o olho. A etapa de orientação é uma etapa crítica que visa encontrar a região do olho com o campo de foco mais amplo. Fotorreceptores, geralmente é o centro do olho.

Depois de orientar todos os olhos, cubra as moscas com gelo, água fria e coloque o prato no gelo para manter a anestesia até que as moscas sejam visualizadas. Para visualizar os fotorreceptores, comece colocando a placa de Petri em uma lâmina de vidro presa ao estágio do microscópio para que seja possível manipular suavemente a posição do prato no palco. Mergulhe a objetiva de imersão na água da placa de Petri e posicione a cabeça da mosca sob o feixe de excitação.

Comece com o filtro GFP. Se for difícil distinguir as partes do corpo da mosca, particularmente a parte distal do abdômen e a cabeça, olhe diretamente para o estágio e reposicione a drosófila. Mova o palco para cima e para baixo até que o feixe convirja para o olho.

Quando o olho está no nível certo, ele reflete a luz de excitação. Olhando pela ocular ou para a tela, centralize o campo de visão no olho e concentre-se abaixo da córnea. Visualizando assim os fotorreceptores fluorescentes.

Para melhorar a imagem confocal, abra o orifício mais do que o normalmente recomendado para a objetiva. Por exemplo, use um valor de 2 0 4 em vez do padrão 98 para a abertura do orifício. A microscopia confocal fornece uma boa técnica alternativa à microscopia de fluorescência padrão porque as imagens têm menos fundo e um campo mais amplo de fotorreceptores focados para acompanhar o destino de um fotorreceptor individual dentro do mesmo olho durante um período de tempo.

Primeiro, reduza a temperatura do aros para 45 graus Celsius para maximizar a sobrevivência do animal. Em segundo lugar, coloque apenas uma drosófila por prato para que as moscas não se misturem durante as observações. Além disso, certifique-se de orientar a mosca do mesmo lado para ver o mesmo olho.

Em seguida, sob o microscópio confocal, reconheça o mesmo clone fotorreceptor por sua forma e pela polaridade do olho. Se o clone de interesse estiver fora do campo de visão, reoriente o olho debaixo d'água para armazenar a mosca. Para visualizar novamente mais tarde, escorra a água do prato.

Em seguida, puxe suavemente a mosca para fora do aros com uma pinça, depois seque a drosófila em um lenço de papel e transfira-a para um frasco. Retorne o frasco a 25 graus Celsius, certificando-se de que a mosca não fique presa na comida. O método de tomate descrito, G-F-P-F-L-P-F-R-T foi implementado como uma triagem rápida para mutações clonais em fotorreceptores.

A tela descobriu defeitos de desenvolvimento que afetam vários processos e a morte de células de neurônios fotorreceptores. Os resultados são apresentados em pormenor em linha. Sete in absentia é necessário para o recrutamento de fotorreceptores, particularmente para R sete, um dos fotorreceptores internos.

A perda de sete in absentia resultou na perda dos fotorreceptores internos e alguns fotorreceptores externos. A cabeça granulada está envolvida no estabelecimento da polaridade da célula planar. Verificou-se que alguns Oma TIA são invertidos em clones mutantes de cabeça granulada, e que a cabeça granulada é necessária em R três fotorreceptores para migalhas de estabelecimento de polaridade celular planar correta e proteína de membrana apical necessária para rabdo.

Descobriu-se que a morfogênese leva a fotorreceptores irregulares, maiores ou menores quando mutada. Usando o protocolo descrito, o rastreamento longitudinal de fotorreceptores individuais foi usado para acompanhar seu destino durante a idade adulta. Isso revelou uma mutação da gordura P que induz a degeneração progressiva dos fotorreceptores na idade adulta.

Nos mosaicos, os fotorreceptores do tipo selvagem não foram afetados. Este método foi possível porque os fotorreceptores individuais puderam ser reidentificados pela morfologia e polaridade do clone ao qual pertencem. Para confirmar o papel da gordura P no mutante da gordura P, a degeneração dos neurônios fotorreceptores foi evitada pela expressão da gordura P do tipo selvagem nos fotorreceptores externos.

No fundo mutante, depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como visualizar o fotorreceptor do mosaico, neuroneuros em viver um estudo sobre degeneração e desenvolvimento neuro.