Name: Um In-vitro Preparação de neurônios entéricos isolados e células gliais do plexo mioentérico do Rato Adulto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Aprenda a isolar neurônios e células gliais do plexo mioentérico de ratos adultos. Este protocolo de cultura celular permite estudar funções individuais e interações entre neurônios entéricos e glia usando eletrofisiologia e imunocitoquímica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Instituto Nacional de Saúde Grant DA024009, DK046367 &amp; T32DA007027.

Todo cuidado com os animais e os procedimentos experimentais foram de acordo e aprovado pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use a Virginia Commonwealth University. 1. Preparação de lamelas de vidro estéreis de poli-D-lisina e laminina revestidos em placas de 24 poços <ol><li> Todos os procedimentos para o passo 1 são realizados em condições estéreis, sob um capuz e com reagentes estéreis. Lamínulas de vidro e água deionizada duplo (DDH 2 O) devem ser esterilizados com antecedência. Preparação das placas pode ser feita de até duas semanas antes do isolamento do neurónio. </li><li> Sob o capô, use uma pinça estéril para colocar lamelas de vidro autoclavados em 12 poços de uma placa de 24 poços. </li><li> Prepare estoque poli-D-lisina antes do tempo. Adicionar 50 ml de ddH2O estéril a 5 mg de poli-D-lisina. Vortex e armazenar em 3 ml alíquotas a -20 ° C. Descongele alíquotas antes do uso. </li><li> Para uma concentração final de 1 ml de caldo de poli-D-lisina por cada 25 cm2: pipeta 80 ulEstoque de poli-D-lisina na parte superior de cada lamela de vidro (2 cm 2). Vamos solução para resolver 10 min. </li><li> Remover poli-D-lisina utilizando vácuo e lave com lamelas 3x estéril DDH 2 O. </li><li> Permitir que as placas para secar por pelo menos 2 horas sob o capô. </li><li> As placas podem ser armazenadas a 4 ° C ou - 20 ° C antes de se proceder ao revestimento da laminina. </li><li> Prepare estoque laminina antes do tempo. Descongele laminina no gelo e manter em gelo durante o uso. Dilui-se a uma concentração de 50 ug / ml; prestar atenção a concentração do lote; cada lote será diferente. Dependendo da concentração muito, cerca de 20 ml de ddH2O serão adicionados a cada frasco de laminina. Alíquotas (5 ml) e armazenar a -80 ° C. Descongelar as aliquotas sobre gelo antes da utilização. </li><li> Lamelas de revestimento com 5 mg / cm 2 laminina, pipeta de 200 mL de estoque laminina em cada lamela. </li><li> Incubar a solução de laminina em lamelas de 1 hora. </li><li> Aspirar solução laminina restante e lave uma vez com lamelasDDH 2 O. Evite superfície de lamelas de raspagem. </li><li> Loja de placas a 4 ° C por até duas semanas. </li></ol> 2. Preparação Prévia do Neuron Isolation Solutions <ol><li> Preparar a solução de Krebs (em mM: 118 NaCl, 4,6 KCl, 1,3 NaH 2 PO 4, 1,2 MgSO4, 25 de NaHCO3, 11 de glucose, e 2,5 CaCl 2). Lugar 13,79 g NaCl (FW 58.44), 0,686 g KCl (FW 74.55), 0,312 g NaH 2 PO 4 (FW 120), 0,289 g MgSO4 (FW 120,4), 4,20 g de NaHCO3 (FW 84.01), 3,96 g de glicose (FW 180,2) e 0,555 g de CaCl2 (FW 111) em 2 L DDH 2 a 0. Frio a 4 ° C. </li><li> Prepara enxaguar meios (F12 com soro de bovino fetal a 10% (FBS) e antibiótico / antimicótico a): A uma garrafa de 500 ml de meio F12, adicionar 50 ml de FBS e 5 ml de Antibiótico / antimicótica líquido 100x (Gibco). </li><li> Prepara entérico meios neurónios (Neurobasal Um media com B-27, 2 mM de L-glutamina, 1% de FBS, 10 ng / ml, Glia Neurotr DerivadoFator ophic (GDNF), e Antibiótico / antimicótica líquido 100x). Para fazer estoque GDNF, adicionar 1 ml ddH2O a 10 mg GDNF e congelar volta em 50 mL alíquotas, armazenar a -80 ° C. Para um frasco para injectáveis ​​de suportes completos 50 neurónios, combinar 47,5 ml por meio Neurobasal, 1 ml de B-27 (50x), 500 ul de FBS, 500 ul mM de L-glutamina (Gibco), 50 ul de banco de GDNF, 200 e 500 ul de Antibiótico / Líquido 100x antimicótico. Meios é feita em pequenos lotes de 50 ml para assegurar a sua frescura de GDNF e para evitar a contaminação de grandes quantidades desta mistura de meios de comunicação celular caros. </li></ol> 3. Colheita Longitudinal Muscle / plexo mioentérico (PMLM) Preparação de Ratos <ol><li> Ética nacionais e institucionais apropriadas devem estar no local antes de realizar experimentos com animais. Adultos ratinhos Swiss Webster com um peso superior a 25 g (em geral, ao longo de 8 semanas de idade) são alojados em grupos de 6, antes das experiências. Os tecidos de dois ratos são usados ​​para o isolamento de neurónios entéricos ileal e glia e três ratinhos são usados ​​paraisolamento das células do cólon. </li><li> Prepare área cirúrgica. Reúna pequenas tesouras cirúrgicas, fórceps angulares, cotonetes, três copos de vidro de 200 ml e um copo de plástico / haste (pincel). Certifique-se de todas as fontes são muito bem lavados e lavados antes de usar para minimizar a contaminação. Esta etapa pode ser realizada um dia antes da experiência. </li><li> Colocar em solução de Krebs gelada e borbulhas com carbogénio (95% de oxigénio, 5% de CO 2) durante pelo menos 30 minutos para estabilizar o pH. </li><li> Ligar vários equipamentos e produtos químicos quentes para estabilizar a temperatura desejada; banho de água de calor (s) a 37 ° C, centrífuga legal para solução de 4 ° C, o lugar de Hank salina balanceada (HBSS) e 0,5% de tripsina em banho-maria (37 ° C ). Mídia neurônios completos e enxaguar mídia deve permanecer refrigerado. </li><li> Coloque 150 ml gelada borbulhava Krebs em três copos de vidro de 200 ml rotulados &#39;sujo&#39;, &#39;limpo&#39; e &#39;PMLM. Bolha copo rotulado &#39;PMLM&#39; com carbogen. </li><li> Após a aprovação do Comitê de Ética, euthanize mouse por deslocamento cervical ou asfixia CO 2. </li><li> Coloque o rato em decúbito dorsal sobre a superfície, a pele limpa cirúrgico com etanol 70%, e levantar a pele abdominal usando uma pinça. Com uma tesoura, a cavidade abdominal aberta e revelar órgãos digestivos internos. </li><li> Remover o comprimento do tracto gastrointestinal, levantando uma secção do íleo e revelando a sua mesentério. Snip através mesentério com uma tesoura para remover suavemente e desvendar o íleo eo cólon, tendo o cuidado para não puxar mesentério do íleo / cólon. </li><li> Depois de todo o comprimento do intestino é desvendado, remover o íleo, cortando através do intestino distal e proximal do estômago ao ceco Nota:. Este procedimento também pode ser realizada com o tecido do cólon através da remoção do cólon de distal para proximal do ceco para a o ânus. </li><li> Os tecidos podem ser divididos entre cólon proximal e distal, e jejenum e íleo. O restante deste procedimento irá se referir ao isolamento do íleo; tele é o mesmo procedimento para o isolamento de PMLM cólon. Coloque todo o íleo em um recipiente de vidro com gelo frio Krebs marcado &#39;sujo&#39;. </li><li> Criar uma ferramenta para limpar o íleo; contundente uma grande agulha de 20 G com uma pedra de arquivamento e anexá-lo a uma grande seringa (10 ml) contendo gelo frio Krebs. </li><li> Limpar a matéria fecal a partir do íleo pela secção do íleo em três ou mais peças de grandes dimensões. Remover uma secção do íleo do recipiente e colocar a agulha embotada para a extremidade de um pedaço do íleo. </li><li> Suavemente executar Krebs a seção do intestino até que toda a matéria fecal é removido em um recipiente separado. Coloque a secção limpa no recipiente de Krebs marcado &quot;limpa&quot;. Repita até íleo inteiro é limpo. </li><li> Para remover o PMLM, cortar o íleo em segmentos pequenos, cerca de 2-4 cm. Coloque um segmento de íleo numa vareta de vidro ou de plástico; íleo deve caber confortavelmente, mas não ser solto ou tenso (~ 2 mm). Comece a remoção do PMLM removendo delicadamente pedaços de mesentério ainda anexared para o tracto gastrointestinal (GI), utilizando um fórceps. Impedir que o tracto GI de rodar em torno da haste, fixando o tubo suavemente para a haste com o polegar. </li><li> Separa-se a PMLM a partir do músculo circular subjacente; primeiro esfregar suavemente a ponta da pinça segundo a linha inteira onde o mesentério foi ligado, a partir de cima para baixo do segmento, criando uma abertura suavemente no músculo longitudinal. Então provocar suavemente o músculo longitudinal com um cotonete umedecido com Krebs. </li><li> Comece na parte superior da abertura no músculo longitudinal e provocar distância utilizando o mais leve traço horizontal enquanto que a aplicação de pressão muito leve até ao músculo longitudinal só começa a separar a partir do músculo circular; fazer descer toda a faixa ao longo do ponto de fixação do mesentério. </li><li> Em seguida, começa a funcionar suavemente em torno do tubo gastrointestinal; movimento de cima para baixo e de trás como o músculo longitudinal é lentamente separada do músculo circular por todo o caminho volta do tubo. Quando concluído, oPMLM virão naturalmente fora o resto do tubo gastrointestinal. </li><li> Coloque a tira fina resultante do músculo longitudinal no copo marcado &#39;PMLM. Repetir para todos os segmentos. </li><li> Depois de todas as faixas de PMLM foram recolhidas a partir de um mouse, repita o procedimento para todos os outros ratos sendo usados. Lave os copos &#39;sujos&#39; e &#39;limpo&#39; antes de re-uso. </li><li> Lavar o PMLM 3x para remover a contaminação biológica. Preencha três 2 ml tubos Eppendorf com gelo frio Krebs. Coloque as tiras PMLM no primeiro tubo e centrifugação durante 30 segundos a 356 xg numa centrifugadora de refrigeração a 4 ° C. Remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e mover as tiras PMLM para a próxima Krebs tubo cheio limpo. Repita este procedimento para cada um dos tubos restantes. </li></ol> 4. Digest PMLM <ol><li> Preparar a solução de digestão colocando 13 mg de colagenase de tipo 2 e 3 mg de BSA, em 10 ml de solução de Krebs-borbulhar carbogénio. </li><li> Segmentos lugar do PMLM lavadas em solução de digestão e uso scissores para cortar PMLM em pedaços minúsculos. </li><li> Digest PMLM durante 60 min a 37 ° C em banho-maria com agitador enquanto era feito borbulhar suavemente com carbogénio. </li><li> Após a digestão completa é, recolher as células por centrifugação durante 8 min a 356 xg centrifugadora arrefecida até 4 ° C. </li><li> Deste ponto em diante, todos os procedimentos devem ser feitos em condições estéreis em uma capa de cultura celular! Todos os reagentes e recipientes devem ser esterilizados antes do uso. </li><li> Durante a centrifugação, preparar uma solução de tripsina 0,05% colocando 1 ml de tripsina a 0,25% aquecida e 4 ml de HBSS aquecida num tubo ml de cultura de células estéril 50. </li><li> Após a centrifugação, remover e descartar o sobrenadante. Não use um aspirador, o que provavelmente vai sugar o pellet celular, devido à baixa velocidade de centrifugação. Cuidadosamente remover o pelete de células e colocar em tubo limpo com 5 ml de solução de tripsina a 0,05%. </li><li> Digerir células em solução de tripsina a 0,05%, em banho de água a 37 ° C com agitação durante 7 min. Não exceda 7 min de tratamento de tripsina, total ou neurônios perecerá. </li><li> Neutralizar a tripsina com 10 ml de frio Enxaguada mídia após 7 min de tratamento tripsina. </li><li> Centrifugar as células durante 8 minutos a 356 x g. Remova e descarte de mídia. </li><li> Durante a centrifugação, o equilíbrio de uma secção de malha Nitex esterilizado no topo de um tubo de 15 ml de cultura de células estéril. </li><li> Após a centrifugação, remover e descartar o sobrenadante. Gentilmente mistura de células ressuspender por trituração em 3 ml de mídia neurônios completos. Evitar a formação de bolhas de ar durante este passo e todos os passos futuros em que mistura de células é triturado. Todas as triturações deve ser feito com muito cuidado. Filtrar a solução da célula através de Nitex de malha no tubo de 15 ml de cultura de células limpo. </li><li> Opcional: tubo de cultura de células Cap e coloque no misturador Hula refrigerado (ou qualquer mixer que proporciona rotação), com rolamento suave e inclinação para 30 min. Este passo é opcional, mas recomendada. </li><li> Opcional: Após misturador Hula, adicionar 2 ml a frio Enxaguada media para lavar as células. </li><li> Recolher as células por centrifugação (8 min, 356 x g). Retire e elimine o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as células em 1200 ul de mídia neurônios completos. Triturar as células suavemente usando 1 ml ponteira de plástico. Não gera bolhas de ar. Pipeta lenta e suavemente até que a maioria dos pedaços são quebrados e as células são suspensas em líquido. </li><li> Adicionar 750 ul de meio completo para cada um dos 12 poços contendo uma lamela de vidro pré-revestido e adicionar 100 ul da solução de células trituradas. </li><li> Incubar neurónios em cultura celular incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> Alterar metade dos media celulares a cada dois dias. </li><li> Os neurônios estão prontos para registros eletrofisiológicos após 1-2 dias em cultura. </li></ol>

<ol><li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enteric+nervous+system+and+neurogastroenterology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">The enteric nervous system and neurogastroenterology.</a> Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (5), 286-294 (2012).</li>
<li>Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enteric+nervous+system%3A+A+second+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Hosp.+Pract.+%28Minneap%29%22%5BJournal%5D)">The enteric nervous system: A second brain.</a> Hosp. Pract. (Minneap). 34 (7), 31-32 (1999).</li>
<li>Gershon, A. A., Chen, J., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+lytic%2C+latent%2C+and+reactivating+varicella-zoster+virus+infections+in+isolated+enteric+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">A model of lytic, latent, and reactivating varicella-zoster virus infections in isolated enteric neurons.</a> J. Infect. Dis. 197, 61-65 (2008).</li>
<li>Wakabayashi, K., Mori, F., Tanji, K., Orimo, S., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+peripheral+nervous+system+in+synucleinopathies%2C+tauopathies+and+other+neurodegenerative+proteinopathies+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain.</a> Acta. Neuropathol. 120 (1), 1-12 (2010).</li>
<li>Hirst, G. D., Holman, M. E., Spence, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+types+of+neurones+in+the+myenteric+plexus+of+duodenum+in+the+guinea-pig%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Two types of neurones in the myenteric plexus of duodenum in the guinea-pig.</a> J. Physiol. 236 (2), 303-326 (1974).</li>
<li>Clerc, N., Furness, J. B., Bornstein, J. C., Kunze, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+electrophysiological+and+morphological+characteristics+of+myenteric+neurons+of+the+duodenum+in+the+guinea-pig%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Correlation of electrophysiological and morphological characteristics of myenteric neurons of the duodenum in the guinea-pig.</a> Neuroscience. 82 (3), 899-914 (1998).</li>
<li>Rugiero, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+whole-cell+currents+by+patch+clamp+of+guinea-pig+myenteric+neurones+in+intact+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of whole-cell currents by patch clamp of guinea-pig myenteric neurones in intact ganglia.</a> J. Physiol. 538 (Pt. 2), 447-463 (2002).</li>
<li>Jessen, K. R., Saffrey, M. J., Baluk, P., Hanani, M., Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enteric+nervous+system+in+tissue+culture.+III.+studies+on+neuronal+survival+and+the+retention+of+biochemical+and+morphological+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The enteric nervous system in tissue culture. III. studies on neuronal survival and the retention of biochemical and morphological differentiation.</a> Brain Res. 262 (1), 49-62 (1983).</li>
<li>Smith, T. H., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphine+decreases+enteric+neuron+excitability+via+inhibition+of+sodium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Morphine decreases enteric neuron excitability via inhibition of sodium channels.</a> PLoS One. 7 (9), e45251(2012).</li>
<li>Abdo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glial+cells+protect+neurons+from+oxidative+stress+in+part+via+reduced+glutathione%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Enteric glial cells protect neurons from oxidative stress in part via reduced glutathione.</a> FASEB J. 24 (4), 1082-1094 (2010).</li>
<li>Aube, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+enteric+neurone+phenotype+and+intestinal+functions+in+a+transgenic+mouse+model+of+enteric+glia+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Changes in enteric neurone phenotype and intestinal functions in a transgenic mouse model of enteric glia disruption.</a> Gut. 55 (5), 630-637 (2006).</li>
<li>Bassotti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glial+cells+and+their+role+in+gastrointestinal+motor+abnormalities%3A+Introducing+the+neuro-gliopathies%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Enteric glial cells and their role in gastrointestinal motor abnormalities: Introducing the neuro-gliopathies.</a> World J. Gastroenterol. 13 (30), 4035-4041 (2007).</li>
<li>Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-specific+genetics%2C+anatomy+and+function+of+enteric+neural+serotonergic+pathways+in+inbred+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice.</a> J. Physiol. 587 (Pt. 3), 567-586 (2009).</li>
<li>Phillips, R. J., Walter, G. C., Powley, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+vagal+afferents+innervating+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Auton.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in vagal afferents innervating the gastrointestinal tract.</a> Auton. Neurosci. 153 (1-2), 90-98 (2010).</li>
<li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Types+of+neurons+in+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Auton.+Nerv.+Syst%22%5BJournal%5D)">Types of neurons in the enteric nervous system.</a> J. Auton. Nerv. Syst. 81 (1-3), 87-96 (2000).</li>
<li>Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+functional+roles+for+enteric+glia+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract.</a> Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (11), 625-632 (2012).</li>
<li>Pomeranz, H. D., Rothman, T. P., Chalazonitis, A., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest-derived+cells+isolated+from+the+gut+by+immunoselection+develop+neuronal+and+glial+phenotypes+when+cultured+on+laminin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural crest-derived cells isolated from the gut by immunoselection develop neuronal and glial phenotypes when cultured on laminin.</a> Dev. Biol. 156 (2), 341-361 (1993).</li>
</ol>

Os autores declaram que há grandes interesses conflitantes existe.

Animais usados Este protocolo foi otimizado para camundongos Swiss Webster. No entanto, este método é facilmente adaptável a outros mamíferos de pequeno porte, tais como ratos, e outras estirpes de ratinhos. Temos realizado com sucesso isolamentos preliminares com C57 e receptores μ-opióide knock-outs. No entanto, também é possível que outras estirpes de ratinhos pode ser problemática devido às variações morfológicas no tracto GI. Além disso, existem diferenças entre as estirpes conhecidas de r...

O sistema nervoso entérico (ENS) é vasta rede de nervos e células da glia, que corre todo o comprimento do tracto gastrointestinal (GI). A ENS funcionalmente controla todos os aspectos da digestão, incluindo o peristaltismo, a absorção / secreção fluida, sensação de estímulos, etc (para revisão ver 1). Contém mais de 500 milhões de neurónios, mais do que o encontrado na medula espinhal, e contém todas as classes neurotransmissor que se encontra no cérebro. Além disso, o ENS é único na medida em que ele pode funcionar por reflexo, sem entrada a partir do sistema nervoso central 2. Compreender do ENS é crucial não apenas para compreender o seu papel fisiológico normal, mas entender seu envolvimento numa variedade de neuropatias, que podem ser congénita (doença de Hirschsprung), adquirida (Chagas), secundário para os estados de doença (gastroparesia diabética), a droga induzida (síndrome do intestino opióides), ou devido a uma lesão (íleo pós-operatório) 1. Além disso, os neurónios entéricos pode ser um reservoir para infecções virais (varicela zóster) 3. Devido às suas semelhanças com o cérebro e os elevados níveis de serotonina no intestino, os medicamentos que visam o tratamento de defeitos do sistema nervoso central, têm frequentemente efeitos secundários indesejáveis ​​sobre o ENS 2. É também de notar que muitas neuropatias tais como a doença de Alzheimer e doença de Parkinson mostra alterações celulares semelhantes nos neurónios entéricos longos antes da sua aparência em neurónios centrais, tornando-o acessível a ENS um modelo para estudar a patogénese destas doenças 4. Portanto, uma compreensão completa do ENS é uma necessidade em compreender os estados de doença e prevenir / prever os efeitos secundários farmacológicos. Os neurónios do ENS terem sido tradicionalmente estudada em cobaias utilizando preparações Wholemount 5-7 ou culturas de neurónios 8. Apesar da facilidade com que os neurônios podem ser estudados neste grande animal, este modelo tem muitas limitações, incluindofalta de linhagens geneticamente modificadas, a falta de reagentes específicos para a espécie, eo alto custo associado com ordenação e abrigando esses assuntos. O desenvolvimento de um modelo de sistema nervoso entérico murino tem a vantagem única de várias knock out sistemas, uma vasta gama de outras metodologias estabelecidas que podem ser usados ​​em conjunção com a técnica de cultura de células, e a capacidade de fornecer uma validação para o modelo de cobaia . O SNE é composta por três plexos que correm o comprimento do tracto gastrointestinal: o exterior do plexo mientérico (entre o músculo longitudinal e circular), que é o principal responsável pelas acções peristálticos do intestino, bem como os plexos submucosa e mucosa, ( encontrado em e dentro da mucosa, respectivamente), que controla em grande parte a absorção de fluido / secreção e a detecção de estímulos 1. Este método começa com o isolamento do músculo / plexo mientérico (PMLM) preparação longitudinal por raspagemfora a camada exterior do músculo do tracto GI. Isto reduz drasticamente a contaminação problemas que surgem quando a camada mucosa está envolvida no isolamento. Como um resultado, este processo é ideal para o estudo de controlo neuronal da motilidade em vez de acções secretoras do ENS. O método aqui apresentado resulta numa cultura mista de neurónios entéricos e glia. Pelo menos dois tipos diferentes de neurónios estão presentes, com base em observações anteriores, electrofisiológicos e imunocitoquímica 9. A presença de células gliais é altamente vantajosa, uma vez que não só são um importante tipo de células a estudar, por direito próprio, mas contribuem para a sobrevivência dos neurónios entéricos 10 e manter a expressão do receptor nativo na superfície de células neuronais 11. Além disso, as deficiências da glia entérico pode levar a doenças gastrointestinais, estados anormais de motilidade, cunhados 12 &#39;neuro-gliopathies&#39;. Portanto, a cultura ENS aqui apresentados resultados em vários tipos de células que estão maduros para a investigação. As vantagens desta metodologia são a facilidade de isolamento, os requisitos de ferramentas de baixo custo, e um curto espaço de tempo para dominar a técnica por pessoal de laboratório experientes. Limitações da metodologia incluem o baixo rendimento das células em geral a partir de volumes elevados de tecido ea exclusão de ENS neurônios de plexi da mucosa e submucosa. Este procedimento será altamente vantajosa para os estudiosos especializados em eletrofisiologia, imuno-histoquímica, PCR de uma única célula, e outras metodologias.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagentes</td></tr><tr><td>Fisherbrand Coverglass para Óculos de Cobertura de Crescimento (12 mm de diâmetro)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>Sigma</td><td>P6407- 5 mg</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 24 poços</td><td>CELLTREAT</td><td>229124</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>Laminina</td><td>BD Biosciences</td><td>354 232</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ddH2O</td><td></td><td></td><td>Pode preparar em laboratório&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga estéril de 15 ml</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188261</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga estéril de 50 ml</td><td>Greiner Bio-one</td><td>227261</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP358-212</td><td>MW 58.44</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP366-500</td><td>MW 74.55</td></tr><tr><td>NaH2PO4 .2H2O</td><td>Fisher Chemicals</td><td>S369-3</td><td>MW137.99</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506-500G</td><td>MW 120.4</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014-5KG</td><td>MW 84.01</td></tr><tr><td>glicose</td><td>Fisher Chemicals</td><td>D16-1</td><td>MW 180.16</td></tr><tr><td>CaCl22H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5080-500G</td><td>MW 147.02</td></tr><tr><td>F12 media</td><td>Gibco</td><td>11330</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Qualidade Biológica Inc.</td><td>110-001-101HI</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>Antibiótico/antimicótico 100x líquido</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Neurobasal A media</td><td>Gibco</td><td>10888</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>200 mM L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030164</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fator Neurotrófico Derivado da Glia (GDNF)</td><td>Neurômica</td><td>PR27022</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tesoura de Dissecação de Ponta Afiada</td><td>Fisher Scientific</td><td>8940</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>Pinça de Tecido de Dissecação</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-41</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>Aplicadores de Algodão Fisher</td><td>Scientific</td><td>23-400-101</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>250 ml Copo de Vidro Graduado</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-100-250</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>2 L Cantil de vidro Erlenmyer</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-500-2000</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>Vara de plástico (pincel infantil)</td><td>Crayola</td><td>05 3516</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Airgas</td><td>UN 3156</td><td>5% CO2</td></tr><tr><td>10 ml Seringa Leur-lock</td><td>Becton Dickinson</td><td>309604</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>21 G x 1 1/2 pol. Agulha Hipodérmica</td><td>Becton Dickinson</td><td>305167</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>de colagenase tipo 2</td><td>Worthington</td><td>LS004174</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Albumina de Soro Bovino American</td><td>Bioanalytical</td><td>AB00440</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf Microcentrifuge de 2 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-864-252</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>Nitrex Mesh 500 &micro; M</td><td>Elko Filtering Co</td><td>100560</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>Conjunto de Pipetas</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-377-328</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>Sharpeining Stone</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9681212</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>LabGard ES 425 Biological Safety Cabinet (capuz de cultura de células)</td><td>Nuaire</td><td>NU-425-400</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>10 L Banho de Água Agitado</td><td>Edvotek</td><td>5027</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>Microcentrífuga 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Pode usar uma única centrífuga maior com adaptadores de tamanho</td></tr><tr><td>Centrífuga Allegra Série 6</td><td>Beckman Coulter</td><td>366816</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>HuluMixer Misturador de Amostras</td><td>Invitrogen</td><td>15920D</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Incubadora de CO2 de Jaqueta de Água AutoFlow</td><td>Nuiare</td><td>NU-4750</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>Balança Analítica</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS104</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr></tbody></table>

um<em&gt; in-vitro</em&gt; preparação de neurônios entéricos isolados e células gliais do plexo mioentérico do rato adulto

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

O sistema nervoso entérico é uma vasta rede de neurónios e células da glia a todo o comprimento do tracto gastrointestinal que funcionalmente controla a motilidade gastrointestinal. Um procedimento para o isolamento e cultura de uma população mista de neurónios e células da glia do plexo mientérico é descrito. As culturas primárias podem ser mantida durante mais de 7 dias, sendo as ligações entre os neurónios em desenvolvimento e glia. A tira de músculo longitudinal com o plexo mientérico é anexa separada do músculo circular subjacente do cólon ou do íleo do rato e submetidos a digestão enzimática. Em condições estéreis, a população de neurónios e células gliais isolado são conservados no interior do sedimento após centrifugação e semeadas em lamelas. Dentro de 24-48 horas, neuritos ocorre e os neurónios podem ser identificados por meio de marcadores pan-neuronais. Depois de dois dias em cultura, os neurônios disparam potenciais de ação isolados, como observado por estudos patch clamp. Além disso, a glia entérico também podem ser identifIED, pela coloração GFAP. A rede de neurônios e células gliais em estreita aposição forma dentro de 5-7 dias. Neurónios entéricos podem ser individualmente e directamente estudada usando métodos tais como a imuno-histoquímica, electrofisiologia, imagiologia de cálcio, e PCR de uma única célula. Além disso, este procedimento pode ser realizado em animais geneticamente modificados. Esta metodologia é simples de executar e barato. Em geral, este protocolo apresenta os componentes do sistema nervoso entérico de uma forma facilmente manipulada de modo a que podemos descobrir melhor a funcionalidade do ENS em estados normais e de doença.

<html> Imediatamente a seguir ao isolamento de células PMLM derivados, neurónios e outros tipos de células não serão prontamente evidentes. Estar, células redondas de fenótipo indistinta pode ser visto, bem como detritos de tecido a partir de fragmentos de tecido digerido e do tecido conjuntivo. Este destroços é de nenhum interesse e será em grande parte removido com a primeira mudança de media em dois dias. Não tente limpar os slides antes disso, como as células viáveis ​​saudáveis ​​serão removidos também. <p class...

Nós demonstramos um protocolo de cultura de células para o estudo directo de componentes neuronais e gliais do sistema nervoso entérico. Um neurônio / glia cultura mista em lamelas é preparado a partir do plexo mioentérico de rato adulto fornecendo a capacidade de examinar neurônio individual e função glia por eletrofisiologia, imuno-histoquímica,<em&gt; Etc</em&gt;.

Um<em&gt; In-vitro</em&gt; Preparação de neurônios entéricos isolados e células gliais do plexo mioentérico do Rato Adulto

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar neurônios funcionalmente viáveis e CLIA do plexo mientérico de camundongo adulto. Isso é realizado primeiramente revestindo a superfície estéril de cultura celular com polilisina e laminina. O segundo passo é preparar as soluções e a área cirúrgica para o isolamento do plexo mientérico.Em seguida, remova o trato gastrointestinal e isole a seção desejada para criar uma preparação de plexo mientérico do músculo longitudinal. O passo final é digerir sequencialmente o LMMP em colagenase e tripsina, seguido pelo plaqueamento das células em superfícies de cultura celular pré-codificadas. Por fim, pode-se utilizar eletrofisiologia, imunocitoquímica e PCR em célula única para estudar os efeitos dos neurônios entéricos, da glia ou da interação entre esses dois tipos celulares.Quem demonstrará o procedimento será a Dra. Trisha Har Smith, pesquisadora pós-doutoranda no laboratório, e quem a auxiliará será Joy Gombe, candidata a doutorado no laboratório. A principal vantagem desta técnica em relação às técnicas existentes é que os neurônios e as glias são obtidos de camundongos adultos. Isso permite obter neurônios e glias plenamente funcionais, que potencialmente podem ser derivados de animais geneticamente modificados.Embora este método possa fornecer informações sobre as propriedades elétricas dos neurônios, ele também pode ser aplicado a outras metodologias, como imunocitoquímica, PCR de célula única e imagem de cálcio em tempo real. Inicie este procedimento colocando um camundongo eutanasiado em posição recumbente dorsal sobre a superfície cirúrgica.Em seguida, limpe a pele abdominal com etanol 70%. Depois, levante-a com uma pinça e abra a cavidade abdominal com uma tesoura para expor os órgãos digestivos internos. Após isso, levante um segmento do íleo para revelar o mesentério.Remova o trato gastrointestinal e corte o mesent&eacute;rio com uma tesoura. Em seguida, remova e desenrole cuidadosamente o &iacute;leo e o c&oacute;lon. Tenha cuidado para n&atilde;o puxar o mesent&eacute;rio do &iacute;leo e do c&oacute;lon ap&oacute;s o intestino ser completamente desenrolado.Remova o íleo cortando o intestino distal ao estômago e proximal ao ceco. Este procedimento também pode ser realizado com tecido colônico, removendo o cólon do ponto distal ao ceco até o ponto proximal ao ânus. Em seguida, seccione o íleo em três ou mais pedaços grandes.Esfregue suavemente a solução de Krebs através do segmento intestinal até que toda a matéria fecal seja removida para um recipiente de resíduos separado. Coloque o segmento limpo no recipiente de Krebs rotulado como limpo e repita os procedimentos até que todo o íleo seja limpo. Para remover o LMMP, corte o íleo em segmentos pequenos de dois a quatro centímetros.Em seguida, coloque um segmento de íleo sobre uma haste de plástico ou vidro. O íleo deve ajustar-se firmemente, mas sem ficar solto ou tenso. Evite que o trato gastrointestinal gire ao redor da haste fixando suavemente o tubo à haste com o polegar.Em seguida, remova cuidadosamente com pin&ccedil;as os fragmentos de mesent&eacute;rio ainda aderidos ao trato gastrointestinal. Depois disso, separe a camada muscular longitudinal-mucosa (LMMP) do m&uacute;sculo circular subjacente, esfregando suavemente a borda da pin&ccedil;a ao longo de toda a linha onde o mesent&eacute;rio estava aderido, do topo at&eacute; a base do segmento.Posteriormente, crie suavemente uma abertura no músculo longitudinal. Em seguida, separe delicadamente o músculo longitudinal usando um cotonete embebido em crebs, começando no topo da abertura, com o traço horizontal mais leve possível e aplicando pressão muito suave até que o músculo longitudinal comece a se separar do músculo circular. Faça isso ao longo de toda a tira, seguindo o ponto de fixação mesentérica.Em seguida, trabalhe suavemente ao redor do tubo gastrointestinal movendo-se de cima para baixo e vice-versa, à medida que o músculo longitudinal é lentamente separado do músculo circular ao redor de todo o tubo. Quando concluído, o LMMP se soltará naturalmente do tubo gastrointestinal remanescente.Em seguida, coloque a tira fina resultante de músculo longitudinal no béquer rotulado como LMMP e repita os procedimentos para todos os segmentos neste procedimento. Coloque os segmentos de LMMP na solução de lavagem na solução de digestão. Em seguida, corte o LMMP em pedaços minúsculos com tesoura.Em seguida, digira-os por 60 minutos em banho-maria a 37 graus Celsius com agitação, borbulhando suavemente com carbogênio. Após a conclusão da digestão, recolha as células por centrifugação durante oito minutos a 356 Gs em uma centrífuga resfriada a quatro graus Celsius.Enquanto isso, prepare uma solução de tripsina a 0,05% em uma cabine de cultura celular adicionando um mililitro de tripsina a 0,25% aquecida e quatro mililitros de HBSS aquecido em um tubo estéril de cultura celular de 50 mililitros. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante, remova cuidadosamente o pellet celular e coloque-o em um tubo limpo com cinco mililitros da solução de tripsina a 0,05%. Em seguida, digira as células na solução de tripsina a 0,05% em banho-maria a 37 graus Celsius com agitação durante sete minutos e neutralize a tripsina com 10 mililitros de meio de lavagem frio.Após sete minutos de tratamento com tripsina, centrifugue as células por oito minutos a 356 ×g. Enquanto isso, posicione um pedaço esterilizado de malha TX sobre um tubo estéril de cultura celular de 15 mililitros. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante e ressuspenda suavemente a mistura celular agitando-a em três mililitros.Meio completo para neurônios. Todas as alterações devem ser feitas com muita delicadeza para evitar a formação de bolhas de ar, em seguida filtre a solução celular através de malha NYX para um tubo de cultura celular limpo de 15 mililitros. Recolha as células por centrifugação durante oito minutos a 356 ×g.Em seguida, remova e descarte o sobrenadante. Re-suspenda as células em 1200 microlitros de meio completo para neurônios. Depois, pipeteie suavemente as células usando uma ponteira plástica de um mililitro.Tenha cuidado para não gerar bolhas de ar; pipete lentamente e com suavidade até que a maioria dos fragmentos esteja desfeita e as células estejam suspensas no líquido. Agora, adicione 750 microlitros do meio completo a cada uma das 12 poças contendo um lamínula de vidro pré-codificado. Em seguida, adicione 100 microlitros da solução celular titulada.Incube os neurônios em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Troque metade do meio de cultura a cada dois dias. Os neurônios estarão prontos para gravações eletrofisiológicas após um a dois dias em cultura.É mostrada aqui a caracterização imuno-histoquímica de neurônios entéricos. Lea isolada do camundongo. A microscopia confocal do músculo longitudinal revelou a marcação específica de beta três tubulina neuronal na preparação do músculo longitudinal ileal em montagem inteira proveniente do camundongo.E estas são as células isoladas dos preparos do LMMP, que contêm os neurônios que coraram positivamente para calretinina e células gliais Retin. As células gliais mostradas aqui foram visualizadas com o marcador específico para glia GFAP. No entanto, nenhuma coloração foi observada quando o anticorpo primário foi omitido. Aqui estão os neurônios e a glia isolados do músculo longitudinal de camundongo, crescendo em estreita proximidade uns com os outros.As imagens de microscopia confocal indicam os neurônios verdes e o ggl vermelho crescendo prontamente adjacentes um ao outro e parecem interagir in vitro. Esta figura mostra a eletrofisiologia dos neurônios entéricos cultivados e do CLIA no modo de fixação de corrente. Todos os neurônios exibiram potenciais de ação após a injeção de corrente.CLIA não apresentam potenciais de ação, mas exibem grandes potenciais eletrotônicos em resposta à injeção de corrente. Os neurônios cultivados do íleo de camundongo constituem uma população eletrofisiologicamente heterogênea. No modo de fixação de corrente, uma injeção de corrente de 0,09 nanoampères em neurônios resulta em potenciais de ação.Neurônios HP negativos retornam imediatamente ao potencial de repouso da membrana após a estimulação. Enquanto isso, neurônios HP positivos exibem um PPA após a estimulação, no qual o potencial de repouso da membrana cai abaixo da linha de base antes de retornar lentamente ao valor inicial. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em quatro horas, se executada corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manter vidraria e instrumentos cirúrgicos tão limpos quanto possível. Além disso, realize a iteração e aeração das células suavemente e troque metade do meio de cultura celular a cada dois dias após este procedimento. Métodos como eletrofisiologia e imunocitoquímica podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a forma como canais iônicos no intestino respondem ao tratamento com fármacos, e para investigar a expressão de proteínas em neurônios e células gliais, bem como como a interação entre esses dois tipos celulares é alterada por diversos tratamentos após seu desenvolvimento.Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de neurobiologia explorarem as funções básicas das neuropatias e neuropatias do sistema nervoso entérico em animais geneticamente modificados. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar neurônios e gliócitos do plexo TER do sistema nervoso entérico de camundongos adultos.

an-vitro-preparation-isolated-enteric-neurons-glia-from-myenteric

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Uma forma alternativa de isolar motoneurônios embrionárias de camundongos a partir da medula espinhal é descrito. O método leva em consideração o fato de que a lectina pode ligar para a afinidade baixo do nervo receptor do fator de crescimento p75NTR. Este preplating lectina baseado permite uma purificação semelhante ao que, com um anticorpo específico contra o p75NTR.

Lectina baseado em isolamento e cultura de motoneurônios embrionárias de rato

Este vídeo demonstra um método para isolar células gliais entéricas da submucosa e lâmina própria do intestino de camundongos. Ele descreve as etapas envolvidas na extração do tecido da submucosa e da lâmina própria, isolando as células gliais entéricas delas e cultivando as células em uma placa de poço revestida para estabelecer uma cultura de células gliais entéricas.

Isolando células gliais entéricas da submucosa e lâmina própria de um camundongo

Muscle neurônios sensoriais estão envolvidos na sinalização proprioceptor e também informar sobre eventos estaduais e lesão relacionada com o metabolismo. Nós descrevemos um rato adulto em preparação músculo-nervo vitro para estudos sobre músculos aferentes ativado por estiramento.

Um In Vitro Adulto mouse para estudar as propriedades de queima de músculos aferentes

Este vídeo demonstra um protocolo para a realização de gravações eletrofisiológicas de fibra única em uma preparação in vitro do nervo colorreto de camundongo.

In vitro caracterização funcional de Rato Colorretal Aferente Endings

O sistema nervoso entérico (ENS) é uma rede de neurônios e glia localizada na parede intestinal que controla os reflexos intestinais. Este protocolo descreve métodos para registrar a atividade de neurônios entéricos e glia em preparações vivas de ENS usando imagens de Ca2+.

In Situ Ca 2+ Imagem do Sistema Nervoso Entérico

O sistema nervoso entérico é formado por células da crista neural que proliferam, migram e colonizam o intestino. As células da crista neural se diferenciam em neurônios com marcadores específicos para seu fenótipo de neurotransmissor. Este protocolo descreve uma técnica de dissecação, fixação e imunocoloração do trato gastrointestinal embrionário murino para visualizar a expressão de neurotransmissores do sistema nervoso entérico.

Immunostaining para Visualize Murino desenvolvimento do sistema nervoso entérico

Aqui, descrevemos o isolamento de células gliais-entérico da submucosa intestinal-usando sequencial incubação do EDTA para quelato cátions divalentes e, em seguida, incubação em solução de recuperação de célula não enzimáticos. Chapeamento da suspensão de células resultante na poli-D-lisina e laminina resulta em uma cultura altamente enriquecida de células gliais submucosas para análise funcional.

Isolamento de células gliais entéricas da Submucosa e Propria do Lamina do rato adulto

Aqui, apresentamos uma nova técnica microcirúrgica para o isolamento de células-tronco neurais da Eminência ganglionar embrião de rato E13 .

Isolamento e cultura de células-tronco neurais embrionárias de rato

Aqui apresentamos um protocolo para isolamento in vitro de múltiplas populações de células gliais de um SNC de camundongo. Este método permite a segregação de micróglias regionais, células precursoras de oligodendrócitos e astrócitos para estudar os fenótipos de cada um em uma variedade de sistemas de cultura.

Dissecção e isolamento da glia murina de múltiplas regiões do sistema nervoso central

Este protocolo apresenta uma maneira única de gerar culturas de células do sistema nervoso central a partir de cérebros embrionários de camundongos do dia 17 para pesquisa em neuro(imuno)logia. Este modelo pode ser analisado usando várias técnicas experimentais, incluindo RT-qPCR, microscopia, ELISA e citometria de fluxo.

Estabelecendo culturas mistas de células neuronais e gliais de cérebros embrionários de camundongos para estudar infecção e imunidade inata

Este protocolo descreve o isolamento de astrócitos purificados e microglia da medula espinhal de camundongos adultos, facilitando aplicações subsequentes, como análise de RNA e cultura celular. Inclui métodos e procedimentos detalhados de dissociação celular projetados para melhorar a qualidade e o rendimento das células isoladas.

Isolamento de Astrócitos Puros e Microglia da Medula Espinhal de Camundongos Adultos para Ensaios In Vitro e Estudos Transcriptômicos

Aprenda a isolar neurônios e células gliais do plexo mioentérico de ratos adultos. Este protocolo de cultura celular permite estudar funções individuais e interações entre neurônios entéricos e glia usando eletrofisiologia e imunocitoquímica.

Um

Explorar mais vídeos