Name: Um In-vitro Preparação de neurônios entéricos isolados e células gliais do plexo mioentérico do Rato Adulto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Aprenda a isolar neurônios e células gliais do plexo mioentérico de ratos adultos. Este protocolo de cultura celular permite estudar funções individuais e interações entre neurônios entéricos e glia usando eletrofisiologia e imunocitoquímica.

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Instituto Nacional de Saúde Grant DA024009, DK046367 &amp; T32DA007027.

Todo cuidado com os animais e os procedimentos experimentais foram de acordo e aprovado pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use a Virginia Commonwealth University. 1. Preparação de lamelas de vidro estéreis de poli-D-lisina e laminina revestidos em placas de 24 poços <ol><li> Todos os procedimentos para o passo 1 são realizados em condições estéreis, sob um capuz e com reagentes estéreis. Lamínulas de vidro e água deionizada duplo (DDH 2 O) devem ser esterilizados com antecedência. Preparação das placas pode ser feita de até duas semanas antes do isolamento do neurónio. </li><li> Sob o capô, use uma pinça estéril para colocar lamelas de vidro autoclavados em 12 poços de uma placa de 24 poços. </li><li> Prepare estoque poli-D-lisina antes do tempo. Adicionar 50 ml de ddH2O estéril a 5 mg de poli-D-lisina. Vortex e armazenar em 3 ml alíquotas a -20 ° C. Descongele alíquotas antes do uso. </li><li> Para uma concentração final de 1 ml de caldo de poli-D-lisina por cada 25 cm2: pipeta 80 ulEstoque de poli-D-lisina na parte superior de cada lamela de vidro (2 cm 2). Vamos solução para resolver 10 min. </li><li> Remover poli-D-lisina utilizando vácuo e lave com lamelas 3x estéril DDH 2 O. </li><li> Permitir que as placas para secar por pelo menos 2 horas sob o capô. </li><li> As placas podem ser armazenadas a 4 ° C ou - 20 ° C antes de se proceder ao revestimento da laminina. </li><li> Prepare estoque laminina antes do tempo. Descongele laminina no gelo e manter em gelo durante o uso. Dilui-se a uma concentração de 50 ug / ml; prestar atenção a concentração do lote; cada lote será diferente. Dependendo da concentração muito, cerca de 20 ml de ddH2O serão adicionados a cada frasco de laminina. Alíquotas (5 ml) e armazenar a -80 ° C. Descongelar as aliquotas sobre gelo antes da utilização. </li><li> Lamelas de revestimento com 5 mg / cm 2 laminina, pipeta de 200 mL de estoque laminina em cada lamela. </li><li> Incubar a solução de laminina em lamelas de 1 hora. </li><li> Aspirar solução laminina restante e lave uma vez com lamelasDDH 2 O. Evite superfície de lamelas de raspagem. </li><li> Loja de placas a 4 ° C por até duas semanas. </li></ol> 2. Preparação Prévia do Neuron Isolation Solutions <ol><li> Preparar a solução de Krebs (em mM: 118 NaCl, 4,6 KCl, 1,3 NaH 2 PO 4, 1,2 MgSO4, 25 de NaHCO3, 11 de glucose, e 2,5 CaCl 2). Lugar 13,79 g NaCl (FW 58.44), 0,686 g KCl (FW 74.55), 0,312 g NaH 2 PO 4 (FW 120), 0,289 g MgSO4 (FW 120,4), 4,20 g de NaHCO3 (FW 84.01), 3,96 g de glicose (FW 180,2) e 0,555 g de CaCl2 (FW 111) em 2 L DDH 2 a 0. Frio a 4 ° C. </li><li> Prepara enxaguar meios (F12 com soro de bovino fetal a 10% (FBS) e antibiótico / antimicótico a): A uma garrafa de 500 ml de meio F12, adicionar 50 ml de FBS e 5 ml de Antibiótico / antimicótica líquido 100x (Gibco). </li><li> Prepara entérico meios neurónios (Neurobasal Um media com B-27, 2 mM de L-glutamina, 1% de FBS, 10 ng / ml, Glia Neurotr DerivadoFator ophic (GDNF), e Antibiótico / antimicótica líquido 100x). Para fazer estoque GDNF, adicionar 1 ml ddH2O a 10 mg GDNF e congelar volta em 50 mL alíquotas, armazenar a -80 ° C. Para um frasco para injectáveis ​​de suportes completos 50 neurónios, combinar 47,5 ml por meio Neurobasal, 1 ml de B-27 (50x), 500 ul de FBS, 500 ul mM de L-glutamina (Gibco), 50 ul de banco de GDNF, 200 e 500 ul de Antibiótico / Líquido 100x antimicótico. Meios é feita em pequenos lotes de 50 ml para assegurar a sua frescura de GDNF e para evitar a contaminação de grandes quantidades desta mistura de meios de comunicação celular caros. </li></ol> 3. Colheita Longitudinal Muscle / plexo mioentérico (PMLM) Preparação de Ratos <ol><li> Ética nacionais e institucionais apropriadas devem estar no local antes de realizar experimentos com animais. Adultos ratinhos Swiss Webster com um peso superior a 25 g (em geral, ao longo de 8 semanas de idade) são alojados em grupos de 6, antes das experiências. Os tecidos de dois ratos são usados ​​para o isolamento de neurónios entéricos ileal e glia e três ratinhos são usados ​​paraisolamento das células do cólon. </li><li> Prepare área cirúrgica. Reúna pequenas tesouras cirúrgicas, fórceps angulares, cotonetes, três copos de vidro de 200 ml e um copo de plástico / haste (pincel). Certifique-se de todas as fontes são muito bem lavados e lavados antes de usar para minimizar a contaminação. Esta etapa pode ser realizada um dia antes da experiência. </li><li> Colocar em solução de Krebs gelada e borbulhas com carbogénio (95% de oxigénio, 5% de CO 2) durante pelo menos 30 minutos para estabilizar o pH. </li><li> Ligar vários equipamentos e produtos químicos quentes para estabilizar a temperatura desejada; banho de água de calor (s) a 37 ° C, centrífuga legal para solução de 4 ° C, o lugar de Hank salina balanceada (HBSS) e 0,5% de tripsina em banho-maria (37 ° C ). Mídia neurônios completos e enxaguar mídia deve permanecer refrigerado. </li><li> Coloque 150 ml gelada borbulhava Krebs em três copos de vidro de 200 ml rotulados &#39;sujo&#39;, &#39;limpo&#39; e &#39;PMLM. Bolha copo rotulado &#39;PMLM&#39; com carbogen. </li><li> Após a aprovação do Comitê de Ética, euthanize mouse por deslocamento cervical ou asfixia CO 2. </li><li> Coloque o rato em decúbito dorsal sobre a superfície, a pele limpa cirúrgico com etanol 70%, e levantar a pele abdominal usando uma pinça. Com uma tesoura, a cavidade abdominal aberta e revelar órgãos digestivos internos. </li><li> Remover o comprimento do tracto gastrointestinal, levantando uma secção do íleo e revelando a sua mesentério. Snip através mesentério com uma tesoura para remover suavemente e desvendar o íleo eo cólon, tendo o cuidado para não puxar mesentério do íleo / cólon. </li><li> Depois de todo o comprimento do intestino é desvendado, remover o íleo, cortando através do intestino distal e proximal do estômago ao ceco Nota:. Este procedimento também pode ser realizada com o tecido do cólon através da remoção do cólon de distal para proximal do ceco para a o ânus. </li><li> Os tecidos podem ser divididos entre cólon proximal e distal, e jejenum e íleo. O restante deste procedimento irá se referir ao isolamento do íleo; tele é o mesmo procedimento para o isolamento de PMLM cólon. Coloque todo o íleo em um recipiente de vidro com gelo frio Krebs marcado &#39;sujo&#39;. </li><li> Criar uma ferramenta para limpar o íleo; contundente uma grande agulha de 20 G com uma pedra de arquivamento e anexá-lo a uma grande seringa (10 ml) contendo gelo frio Krebs. </li><li> Limpar a matéria fecal a partir do íleo pela secção do íleo em três ou mais peças de grandes dimensões. Remover uma secção do íleo do recipiente e colocar a agulha embotada para a extremidade de um pedaço do íleo. </li><li> Suavemente executar Krebs a seção do intestino até que toda a matéria fecal é removido em um recipiente separado. Coloque a secção limpa no recipiente de Krebs marcado &quot;limpa&quot;. Repita até íleo inteiro é limpo. </li><li> Para remover o PMLM, cortar o íleo em segmentos pequenos, cerca de 2-4 cm. Coloque um segmento de íleo numa vareta de vidro ou de plástico; íleo deve caber confortavelmente, mas não ser solto ou tenso (~ 2 mm). Comece a remoção do PMLM removendo delicadamente pedaços de mesentério ainda anexared para o tracto gastrointestinal (GI), utilizando um fórceps. Impedir que o tracto GI de rodar em torno da haste, fixando o tubo suavemente para a haste com o polegar. </li><li> Separa-se a PMLM a partir do músculo circular subjacente; primeiro esfregar suavemente a ponta da pinça segundo a linha inteira onde o mesentério foi ligado, a partir de cima para baixo do segmento, criando uma abertura suavemente no músculo longitudinal. Então provocar suavemente o músculo longitudinal com um cotonete umedecido com Krebs. </li><li> Comece na parte superior da abertura no músculo longitudinal e provocar distância utilizando o mais leve traço horizontal enquanto que a aplicação de pressão muito leve até ao músculo longitudinal só começa a separar a partir do músculo circular; fazer descer toda a faixa ao longo do ponto de fixação do mesentério. </li><li> Em seguida, começa a funcionar suavemente em torno do tubo gastrointestinal; movimento de cima para baixo e de trás como o músculo longitudinal é lentamente separada do músculo circular por todo o caminho volta do tubo. Quando concluído, oPMLM virão naturalmente fora o resto do tubo gastrointestinal. </li><li> Coloque a tira fina resultante do músculo longitudinal no copo marcado &#39;PMLM. Repetir para todos os segmentos. </li><li> Depois de todas as faixas de PMLM foram recolhidas a partir de um mouse, repita o procedimento para todos os outros ratos sendo usados. Lave os copos &#39;sujos&#39; e &#39;limpo&#39; antes de re-uso. </li><li> Lavar o PMLM 3x para remover a contaminação biológica. Preencha três 2 ml tubos Eppendorf com gelo frio Krebs. Coloque as tiras PMLM no primeiro tubo e centrifugação durante 30 segundos a 356 xg numa centrifugadora de refrigeração a 4 ° C. Remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e mover as tiras PMLM para a próxima Krebs tubo cheio limpo. Repita este procedimento para cada um dos tubos restantes. </li></ol> 4. Digest PMLM <ol><li> Preparar a solução de digestão colocando 13 mg de colagenase de tipo 2 e 3 mg de BSA, em 10 ml de solução de Krebs-borbulhar carbogénio. </li><li> Segmentos lugar do PMLM lavadas em solução de digestão e uso scissores para cortar PMLM em pedaços minúsculos. </li><li> Digest PMLM durante 60 min a 37 ° C em banho-maria com agitador enquanto era feito borbulhar suavemente com carbogénio. </li><li> Após a digestão completa é, recolher as células por centrifugação durante 8 min a 356 xg centrifugadora arrefecida até 4 ° C. </li><li> Deste ponto em diante, todos os procedimentos devem ser feitos em condições estéreis em uma capa de cultura celular! Todos os reagentes e recipientes devem ser esterilizados antes do uso. </li><li> Durante a centrifugação, preparar uma solução de tripsina 0,05% colocando 1 ml de tripsina a 0,25% aquecida e 4 ml de HBSS aquecida num tubo ml de cultura de células estéril 50. </li><li> Após a centrifugação, remover e descartar o sobrenadante. Não use um aspirador, o que provavelmente vai sugar o pellet celular, devido à baixa velocidade de centrifugação. Cuidadosamente remover o pelete de células e colocar em tubo limpo com 5 ml de solução de tripsina a 0,05%. </li><li> Digerir células em solução de tripsina a 0,05%, em banho de água a 37 ° C com agitação durante 7 min. Não exceda 7 min de tratamento de tripsina, total ou neurônios perecerá. </li><li> Neutralizar a tripsina com 10 ml de frio Enxaguada mídia após 7 min de tratamento tripsina. </li><li> Centrifugar as células durante 8 minutos a 356 x g. Remova e descarte de mídia. </li><li> Durante a centrifugação, o equilíbrio de uma secção de malha Nitex esterilizado no topo de um tubo de 15 ml de cultura de células estéril. </li><li> Após a centrifugação, remover e descartar o sobrenadante. Gentilmente mistura de células ressuspender por trituração em 3 ml de mídia neurônios completos. Evitar a formação de bolhas de ar durante este passo e todos os passos futuros em que mistura de células é triturado. Todas as triturações deve ser feito com muito cuidado. Filtrar a solução da célula através de Nitex de malha no tubo de 15 ml de cultura de células limpo. </li><li> Opcional: tubo de cultura de células Cap e coloque no misturador Hula refrigerado (ou qualquer mixer que proporciona rotação), com rolamento suave e inclinação para 30 min. Este passo é opcional, mas recomendada. </li><li> Opcional: Após misturador Hula, adicionar 2 ml a frio Enxaguada media para lavar as células. </li><li> Recolher as células por centrifugação (8 min, 356 x g). Retire e elimine o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as células em 1200 ul de mídia neurônios completos. Triturar as células suavemente usando 1 ml ponteira de plástico. Não gera bolhas de ar. Pipeta lenta e suavemente até que a maioria dos pedaços são quebrados e as células são suspensas em líquido. </li><li> Adicionar 750 ul de meio completo para cada um dos 12 poços contendo uma lamela de vidro pré-revestido e adicionar 100 ul da solução de células trituradas. </li><li> Incubar neurónios em cultura celular incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> Alterar metade dos media celulares a cada dois dias. </li><li> Os neurônios estão prontos para registros eletrofisiológicos após 1-2 dias em cultura. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que há grandes interesses conflitantes existe.

Animais usados Este protocolo foi otimizado para camundongos Swiss Webster. No entanto, este método é facilmente adaptável a outros mamíferos de pequeno porte, tais como ratos, e outras estirpes de ratinhos. Temos realizado com sucesso isolamentos preliminares com C57 e receptores μ-opióide knock-outs. No entanto, também é possível que outras estirpes de ratinhos pode ser problemática devido às variações morfológicas no tracto GI. Além disso, existem diferenças entre as estirpes conhecidas de r...

O sistema nervoso entérico (ENS) é vasta rede de nervos e células da glia, que corre todo o comprimento do tracto gastrointestinal (GI). A ENS funcionalmente controla todos os aspectos da digestão, incluindo o peristaltismo, a absorção / secreção fluida, sensação de estímulos, etc (para revisão ver 1). Contém mais de 500 milhões de neurónios, mais do que o encontrado na medula espinhal, e contém todas as classes neurotransmissor que se encontra no cérebro. Além disso, o ENS é único na medida em que ele pode funcionar por reflexo, sem entrada a partir do sistema nervoso central 2. Compreender do ENS é crucial não apenas para compreender o seu papel fisiológico normal, mas entender seu envolvimento numa variedade de neuropatias, que podem ser congénita (doença de Hirschsprung), adquirida (Chagas), secundário para os estados de doença (gastroparesia diabética), a droga induzida (síndrome do intestino opióides), ou devido a uma lesão (íleo pós-operatório) 1. Além disso, os neurónios entéricos pode ser um reservoir para infecções virais (varicela zóster) 3. Devido às suas semelhanças com o cérebro e os elevados níveis de serotonina no intestino, os medicamentos que visam o tratamento de defeitos do sistema nervoso central, têm frequentemente efeitos secundários indesejáveis ​​sobre o ENS 2. É também de notar que muitas neuropatias tais como a doença de Alzheimer e doença de Parkinson mostra alterações celulares semelhantes nos neurónios entéricos longos antes da sua aparência em neurónios centrais, tornando-o acessível a ENS um modelo para estudar a patogénese destas doenças 4. Portanto, uma compreensão completa do ENS é uma necessidade em compreender os estados de doença e prevenir / prever os efeitos secundários farmacológicos. Os neurónios do ENS terem sido tradicionalmente estudada em cobaias utilizando preparações Wholemount 5-7 ou culturas de neurónios 8. Apesar da facilidade com que os neurônios podem ser estudados neste grande animal, este modelo tem muitas limitações, incluindofalta de linhagens geneticamente modificadas, a falta de reagentes específicos para a espécie, eo alto custo associado com ordenação e abrigando esses assuntos. O desenvolvimento de um modelo de sistema nervoso entérico murino tem a vantagem única de várias knock out sistemas, uma vasta gama de outras metodologias estabelecidas que podem ser usados ​​em conjunção com a técnica de cultura de células, e a capacidade de fornecer uma validação para o modelo de cobaia . O SNE é composta por três plexos que correm o comprimento do tracto gastrointestinal: o exterior do plexo mientérico (entre o músculo longitudinal e circular), que é o principal responsável pelas acções peristálticos do intestino, bem como os plexos submucosa e mucosa, ( encontrado em e dentro da mucosa, respectivamente), que controla em grande parte a absorção de fluido / secreção e a detecção de estímulos 1. Este método começa com o isolamento do músculo / plexo mientérico (PMLM) preparação longitudinal por raspagemfora a camada exterior do músculo do tracto GI. Isto reduz drasticamente a contaminação problemas que surgem quando a camada mucosa está envolvida no isolamento. Como um resultado, este processo é ideal para o estudo de controlo neuronal da motilidade em vez de acções secretoras do ENS. O método aqui apresentado resulta numa cultura mista de neurónios entéricos e glia. Pelo menos dois tipos diferentes de neurónios estão presentes, com base em observações anteriores, electrofisiológicos e imunocitoquímica 9. A presença de células gliais é altamente vantajosa, uma vez que não só são um importante tipo de células a estudar, por direito próprio, mas contribuem para a sobrevivência dos neurónios entéricos 10 e manter a expressão do receptor nativo na superfície de células neuronais 11. Além disso, as deficiências da glia entérico pode levar a doenças gastrointestinais, estados anormais de motilidade, cunhados 12 &#39;neuro-gliopathies&#39;. Portanto, a cultura ENS aqui apresentados resultados em vários tipos de células que estão maduros para a investigação. As vantagens desta metodologia são a facilidade de isolamento, os requisitos de ferramentas de baixo custo, e um curto espaço de tempo para dominar a técnica por pessoal de laboratório experientes. Limitações da metodologia incluem o baixo rendimento das células em geral a partir de volumes elevados de tecido ea exclusão de ENS neurônios de plexi da mucosa e submucosa. Este procedimento será altamente vantajosa para os estudiosos especializados em eletrofisiologia, imuno-histoquímica, PCR de uma única célula, e outras metodologias.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagentes</td></tr><tr><td>Fisherbrand Coverglass para Óculos de Cobertura de Crescimento (12 mm de diâmetro)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>Sigma</td><td>P6407- 5 mg</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 24 poços</td><td>CELLTREAT</td><td>229124</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>Laminina</td><td>BD Biosciences</td><td>354 232</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ddH2O</td><td></td><td></td><td>Pode preparar em laboratório&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga estéril de 15 ml</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188261</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga estéril de 50 ml</td><td>Greiner Bio-one</td><td>227261</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP358-212</td><td>MW 58.44</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP366-500</td><td>MW 74.55</td></tr><tr><td>NaH2PO4 .2H2O</td><td>Fisher Chemicals</td><td>S369-3</td><td>MW137.99</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506-500G</td><td>MW 120.4</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014-5KG</td><td>MW 84.01</td></tr><tr><td>glicose</td><td>Fisher Chemicals</td><td>D16-1</td><td>MW 180.16</td></tr><tr><td>CaCl22H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5080-500G</td><td>MW 147.02</td></tr><tr><td>F12 media</td><td>Gibco</td><td>11330</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Qualidade Biológica Inc.</td><td>110-001-101HI</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>Antibiótico/antimicótico 100x líquido</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Neurobasal A media</td><td>Gibco</td><td>10888</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>200 mM L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030164</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fator Neurotrófico Derivado da Glia (GDNF)</td><td>Neurômica</td><td>PR27022</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tesoura de Dissecação de Ponta Afiada</td><td>Fisher Scientific</td><td>8940</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>Pinça de Tecido de Dissecação</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-41</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>Aplicadores de Algodão Fisher</td><td>Scientific</td><td>23-400-101</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>250 ml Copo de Vidro Graduado</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-100-250</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>2 L Cantil de vidro Erlenmyer</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-500-2000</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>Vara de plástico (pincel infantil)</td><td>Crayola</td><td>05 3516</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Airgas</td><td>UN 3156</td><td>5% CO2</td></tr><tr><td>10 ml Seringa Leur-lock</td><td>Becton Dickinson</td><td>309604</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>21 G x 1 1/2 pol. Agulha Hipodérmica</td><td>Becton Dickinson</td><td>305167</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>de colagenase tipo 2</td><td>Worthington</td><td>LS004174</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Albumina de Soro Bovino American</td><td>Bioanalytical</td><td>AB00440</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf Microcentrifuge de 2 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-864-252</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>Nitrex Mesh 500 &micro; M</td><td>Elko Filtering Co</td><td>100560</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>Conjunto de Pipetas</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-377-328</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>Sharpeining Stone</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9681212</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>LabGard ES 425 Biological Safety Cabinet (capuz de cultura de células)</td><td>Nuaire</td><td>NU-425-400</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>10 L Banho de Água Agitado</td><td>Edvotek</td><td>5027</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>Microcentrífuga 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Pode usar uma única centrífuga maior com adaptadores de tamanho</td></tr><tr><td>Centrífuga Allegra Série 6</td><td>Beckman Coulter</td><td>366816</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>HuluMixer Misturador de Amostras</td><td>Invitrogen</td><td>15920D</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Incubadora de CO2 de Jaqueta de Água AutoFlow</td><td>Nuiare</td><td>NU-4750</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>Balança Analítica</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS104</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr></tbody></table>

um<em&gt; in-vitro</em&gt; preparação de neurônios entéricos isolados e células gliais do plexo mioentérico do rato adulto

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

O sistema nervoso entérico é uma vasta rede de neurónios e células da glia a todo o comprimento do tracto gastrointestinal que funcionalmente controla a motilidade gastrointestinal. Um procedimento para o isolamento e cultura de uma população mista de neurónios e células da glia do plexo mientérico é descrito. As culturas primárias podem ser mantida durante mais de 7 dias, sendo as ligações entre os neurónios em desenvolvimento e glia. A tira de músculo longitudinal com o plexo mientérico é anexa separada do músculo circular subjacente do cólon ou do íleo do rato e submetidos a digestão enzimática. Em condições estéreis, a população de neurónios e células gliais isolado são conservados no interior do sedimento após centrifugação e semeadas em lamelas. Dentro de 24-48 horas, neuritos ocorre e os neurónios podem ser identificados por meio de marcadores pan-neuronais. Depois de dois dias em cultura, os neurônios disparam potenciais de ação isolados, como observado por estudos patch clamp. Além disso, a glia entérico também podem ser identifIED, pela coloração GFAP. A rede de neurônios e células gliais em estreita aposição forma dentro de 5-7 dias. Neurónios entéricos podem ser individualmente e directamente estudada usando métodos tais como a imuno-histoquímica, electrofisiologia, imagiologia de cálcio, e PCR de uma única célula. Além disso, este procedimento pode ser realizado em animais geneticamente modificados. Esta metodologia é simples de executar e barato. Em geral, este protocolo apresenta os componentes do sistema nervoso entérico de uma forma facilmente manipulada de modo a que podemos descobrir melhor a funcionalidade do ENS em estados normais e de doença.

<html> Imediatamente a seguir ao isolamento de células PMLM derivados, neurónios e outros tipos de células não serão prontamente evidentes. Estar, células redondas de fenótipo indistinta pode ser visto, bem como detritos de tecido a partir de fragmentos de tecido digerido e do tecido conjuntivo. Este destroços é de nenhum interesse e será em grande parte removido com a primeira mudança de media em dois dias. Não tente limpar os slides antes disso, como as células viáveis ​​saudáveis ​​serão removidos também. <p class...

Nós demonstramos um protocolo de cultura de células para o estudo directo de componentes neuronais e gliais do sistema nervoso entérico. Um neurônio / glia cultura mista em lamelas é preparado a partir do plexo mioentérico de rato adulto fornecendo a capacidade de examinar neurônio individual e função glia por eletrofisiologia, imuno-histoquímica,<em&gt; Etc</em&gt;.

Um<em&gt; In-vitro</em&gt; Preparação de neurônios entéricos isolados e células gliais do plexo mioentérico do Rato Adulto

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar neurônios funcionalmente viáveis e CLIA do plexo mientérico de camundongo adulto. Isso é realizado primeiramente revestindo a superfície estéril de cultura celular com polilisina e laminina. O segundo passo é preparar as soluções e a área cirúrgica para o isolamento do plexo mientérico.Em seguida, remova o trato gastrointestinal e isole a seção desejada para criar uma preparação de plexo mientérico do músculo longitudinal. O passo final é digerir sequencialmente o LMMP em colagenase e tripsina, seguido pelo plaqueamento das células em superfícies de cultura celular pré-codificadas. Por fim, pode-se utilizar eletrofisiologia, imunocitoquímica e PCR em célula única para estudar os efeitos dos neurônios entéricos, da glia ou da interação entre esses dois tipos celulares.Quem demonstrará o procedimento será a Dra. Trisha Har Smith, pesquisadora pós-doutoranda no laboratório, e quem a auxiliará será Joy Gombe, candidata a doutorado no laboratório. A principal vantagem desta técnica em relação às técnicas existentes é que os neurônios e as glias são obtidos de camundongos adultos. Isso permite obter neurônios e glias plenamente funcionais, que

an-vitro-preparation-isolated-enteric-neurons-glia-from-myenteric

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Uma forma alternativa de isolar motoneurônios embrionárias de camundongos a partir da medula espinhal é descrito. O método leva em consideração o fato de que a lectina pode ligar para a afinidade baixo do nervo receptor do fator de crescimento p75NTR. Este preplating lectina baseado permite uma purificação semelhante ao que, com um anticorpo específico contra o p75NTR.

Lectina baseado em isolamento e cultura de motoneurônios embrionárias de rato

Este vídeo demonstra um método para isolar células gliais entéricas da submucosa e lâmina própria do intestino de camundongos. Ele descreve as etapas envolvidas na extração do tecido da submucosa e da lâmina própria, isolando as células gliais entéricas delas e cultivando as células em uma placa de poço revestida para estabelecer uma cultura de células gliais entéricas.

Isolando células gliais entéricas da submucosa e lâmina própria de um camundongo

Muscle neurônios sensoriais estão envolvidos na sinalização proprioceptor e também informar sobre eventos estaduais e lesão relacionada com o metabolismo. Nós descrevemos um rato adulto em preparação músculo-nervo vitro para estudos sobre músculos aferentes ativado por estiramento.

Um In Vitro Adulto mouse para estudar as propriedades de queima de músculos aferentes

Este vídeo demonstra um protocolo para a realização de gravações eletrofisiológicas de fibra única em uma preparação in vitro do nervo colorreto de camundongo.

In vitro caracterização funcional de Rato Colorretal Aferente Endings

O sistema nervoso entérico (ENS) é uma rede de neurônios e glia localizada na parede intestinal que controla os reflexos intestinais. Este protocolo descreve métodos para registrar a atividade de neurônios entéricos e glia em preparações vivas de ENS usando imagens de Ca2+.

In Situ Ca 2+ Imagem do Sistema Nervoso Entérico

O sistema nervoso entérico é formado por células da crista neural que proliferam, migram e colonizam o intestino. As células da crista neural se diferenciam em neurônios com marcadores específicos para seu fenótipo de neurotransmissor. Este protocolo descreve uma técnica de dissecação, fixação e imunocoloração do trato gastrointestinal embrionário murino para visualizar a expressão de neurotransmissores do sistema nervoso entérico.

Immunostaining para Visualize Murino desenvolvimento do sistema nervoso entérico

Aqui, descrevemos o isolamento de células gliais-entérico da submucosa intestinal-usando sequencial incubação do EDTA para quelato cátions divalentes e, em seguida, incubação em solução de recuperação de célula não enzimáticos. Chapeamento da suspensão de células resultante na poli-D-lisina e laminina resulta em uma cultura altamente enriquecida de células gliais submucosas para análise funcional.

Isolamento de células gliais entéricas da Submucosa e Propria do Lamina do rato adulto

Aqui, apresentamos uma nova técnica microcirúrgica para o isolamento de células-tronco neurais da Eminência ganglionar embrião de rato E13 .

Isolamento e cultura de células-tronco neurais embrionárias de rato

Aqui apresentamos um protocolo para isolamento in vitro de múltiplas populações de células gliais de um SNC de camundongo. Este método permite a segregação de micróglias regionais, células precursoras de oligodendrócitos e astrócitos para estudar os fenótipos de cada um em uma variedade de sistemas de cultura.

Dissecção e isolamento da glia murina de múltiplas regiões do sistema nervoso central

Este protocolo apresenta uma maneira única de gerar culturas de células do sistema nervoso central a partir de cérebros embrionários de camundongos do dia 17 para pesquisa em neuro(imuno)logia. Este modelo pode ser analisado usando várias técnicas experimentais, incluindo RT-qPCR, microscopia, ELISA e citometria de fluxo.

Estabelecendo culturas mistas de células neuronais e gliais de cérebros embrionários de camundongos para estudar infecção e imunidade inata

Este protocolo descreve o isolamento de astrócitos purificados e microglia da medula espinhal de camundongos adultos, facilitando aplicações subsequentes, como análise de RNA e cultura celular. Inclui métodos e procedimentos detalhados de dissociação celular projetados para melhorar a qualidade e o rendimento das células isoladas.

Isolamento de Astrócitos Puros e Microglia da Medula Espinhal de Camundongos Adultos para Ensaios In Vitro e Estudos Transcriptômicos

Aprenda a isolar neurônios e células gliais do plexo mioentérico de ratos adultos. Este protocolo de cultura celular permite estudar funções individuais e interações entre neurônios entéricos e glia usando eletrofisiologia e imunocitoquímica.

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