Um In-vitro Preparação de neurônios entéricos isolados e células gliais do plexo mioentérico do Rato Adulto

O objetivo geral deste procedimento é isolar neurônios funcionalmente viáveis e CLIA do plexo mioentérico de camundongos adultos. Isso é feito revestindo primeiro a superfície da cultura de células estéreis com polilisina e laminina. O segundo passo é preparar soluções e área cirúrgica para isolamento do plexo mioentérico.

Em seguida, remova o trato gastrointestinal e isole a seção desejada para criar a preparação do plexo mioentérico do músculo longitudinal. A etapa final é digerir sequencialmente o LMMP em colagenase e tripsina, seguido pelo plaqueamento das células nas superfícies de cultura de células pré-codificadas. Em última análise, eletrofisiologia, imunocitoquímica e PCR de célula única podem ser usados para estudar os efeitos dos neurônios entéricos, glia ou a interação entre esses dois tipos de células.

Demonstrando o procedimento estará a Dra. Trisha Har Smith, pós-doutoranda em todos os laboratórios, e auxiliando-a estará Joy Gombe, candidata a doutorado em todos os laboratórios. A principal vantagem dessa técnica sobre as técnicas existentes é que os neurônios e a glia vêm do camundongo adulto. Isso permite neurônios e glia totalmente funcionais, que podem vir de animais geneticamente modificados.

Embora esse método possa fornecer informações sobre as propriedades elétricas dos neurônios. Também pode ser aplicado a outras metodologias, como imunocitoquímica, PCR de célula única e imagens de cálcio em tempo real. Comece este procedimento colocando um camundongo sacrificado em decúbito dorsal na superfície cirúrgica.

Em seguida, limpe a pele abdominal com etanol 70%. Em seguida, levante-o com uma pinça e abra a cavidade abdominal com uma tesoura para revelar os órgãos digestivos internos. Depois disso, levante uma seção do íleo para revelar a mesentaria.

Remova o trato gastrointestinal e corte o mesentério com uma tesoura. Em seguida, remova e desfie suavemente o íleo e o cólon. Tenha cuidado para não puxar o mesentério do íleo e do cólon depois que o intestino de comprimento total for desvendado.

Remova o íleo cortando o intestino distal ao estômago e proximal ao ceco. Este procedimento também pode ser realizado com um tecido colônico, removendo o cólon do distal ao ceco e ao proximal ao ânus. Em seguida, divida o íleo em três ou mais pedaços grandes.

Esfregue suavemente a solução de kreb através da seção intestinal até que toda a matéria fecal seja removida para um recipiente de lixo separado. Coloque a seção limpa no recipiente de Krebs rotulado como limpo e repita os procedimentos até que todo o íleo seja limpo. Para remover o LMMP, corte o íleo em pequenos segmentos de dois a quatro centímetros.

Depois, coloque um segmento de íleo em uma haste de plástico ou vidro. O íleo deve se encaixar confortavelmente, mas não solto ou esticado. Evite que o trato gastrointestinal gire em torno da haste prendendo suavemente o tubo na haste com o polegar.

Em seguida, remova suavemente os pedaços de mesentério que ainda estão presos ao trato gastrointestinal com uma pinça. Depois disso, separe o LMMP do músculo circular subjacente. Primeiro esfregando suavemente a borda da pinça ao longo de toda a linha onde o mesentério foi preso de cima para baixo do segmento.

Posteriormente, crie suavemente uma lacuna no músculo longitudinal. Em seguida, retire suavemente o músculo longitudinal usando um cotonete amarrado com crebs começando no topo da lacuna, usando o traço horizontal mais leve enquanto aplica uma pressão muito leve até que o músculo longitudinal comece a se separar do músculo circular. Faça isso em toda a faixa ao longo do ponto de fixação do mesentary.

Em seguida, trabalhe suavemente ao redor do tubo GI, movendo-se de cima para baixo e para trás. Como o músculo longitudinal é lentamente separado do músculo circular ao redor do tubo. Quando concluído, o LMMP sairá naturalmente do tubo gastrointestinal restante.

Em seguida, coloque a tira fina resultante do músculo longitudinal no béquer rotulado LMMP e repita os procedimentos para todos os segmentos neste procedimento. Coloque o enxágue nos segmentos LMMP na solução de digestão. Em seguida, corte o LMMP em pedaços minúsculos com uma tesoura.

Em seguida, digeri-los por 60 minutos. Em banho-maria a 37 graus Celsius com um shaker enquanto é suavemente borbulhado com carbogênio. Após a digestão estar completa, reúna as células por centrifugação por oito minutos a 356 Gs em uma centrífuga, resfrie a quatro graus Celsius.

Enquanto isso, prepare a solução de tripsina a 0,05% em um capuz de cultura de células adicionando um mililitro de tripsina a 0,25% aquecido e quatro mililitros de HBSS aquecido em um tubo de cultura de células estéril de 50 mililitros. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante, remova cuidadosamente o pellet celular e coloque-o em um tubo limpo com cinco mililitros de solução de tentina a 0,05%. Em seguida, digerir as células em solução de 0,05% de tentina em banho-maria a 37 graus Celsius com agitação por sete minutos, neutralizar a tentina com 10 mililitros de meio de enxágue frio.

Após sete minutos de tratamento com tripsina, centrifugue as células por oito minutos a 356 gs. Enquanto isso, a seção de equilíbrio da malha TX esterilizada em cima de um tubo de cultura de células estéril de 15 mililitros. Após centrifugação, rejeitar o sobrenadante e ressuspender suavemente a mistura de células, provocando-a em três mililitros.

Meios neurais completos. Todas as alterações devem ser feitas com muito cuidado Para evitar a geração de bolhas de ar, filtre a solução celular através da malha NYX em um tubo de cultura de células limpas de 15 mililitros. Recolher as células por centrifugação durante oito minutos a 356 gs.

Depois disso, remova e descarte o sobrenadante. Ressuspenda as células em 1200 microlitros de meios neurais completos. Em seguida, coloque as células suavemente usando uma ponta de pipeta de plástico de um mililitro.

Tenha cuidado para não gerar bolhas de ar, pipetar lenta e suavemente até que a maioria dos pedaços se quebre e as células fiquem suspensas em líquido. Agora, adicione 750 microlitros da mídia completa a cada um dos 12 poços contendo uma lamínula de vidro pré-codificada. Em seguida, adicione 100 microlitros da solução celular nominal.

Incube os neurônios em uma incubadora de cultura de células a 37 graus Celsius com 5% de mudança de dióxido de carbono. Metade da mídia celular a cada dois dias. Os neurônios estão prontos para registros eletrofisiológicos após um a dois dias em cultura.

Aqui é mostrada a caracterização imuno-histoquímica dos neurônios entéricos. Lea isolada do rato. A microscopia confocal do músculo longitudinal revelou a coloração neuronal específica da beta três tubulina em toda a preparação do músculo longitudinal do Monte ileal do camundongo.

E essas são as células isoladas das preparações LMMP, que contêm os neurônios que se coaram positivamente para ligação cal e as células da glia Retin mostradas aqui foram visualizadas com o marcador específico da glia GFAP. No entanto, nenhuma coloração foi observada quando o anticorpo primário foi omitido. Aqui estão os neurônios e a glia isolados do músculo longitudinal do camundongo crescendo próximos uns dos outros.

As imagens de microscopia confocal indicam que os neurônios verdes e o ggl vermelho crescem prontamente adjacentes um ao outro e parecem interagir in vitro. Esta figura mostra a eletrofisiologia dos neurônios entéricos cultivados e CLIA no modo de pinça de corrente. Todos os neurônios exibiram potenciais de ação na injeção de corrente.

Os CLIA não têm potenciais de ação, mas exibem grandes potenciais eletrotônicos em resposta à injeção de corrente. Os neurônios cultivados do íleo do camundongo são uma população heterogênea eletrofisiológica. No modo de pinça de corrente, uma injeção de corrente de 0,09 nano amperes nos neurônios resulta em potenciais de ação.

Um neurônio HP negativo retorna imediatamente ao potencial de membrana em repouso após a estimulação. Enquanto um HP positivo, os neurônios exibem um A HP após a estimulação em que o potencial de membrana em repouso cai abaixo da linha de base antes de retornar lentamente ao valor inicial. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em quatro horas se executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter os copos e instrumentos cirúrgicos o mais limpos possível. Além disso, itere e borbulhe as células suavemente e troque metade do meio de cultura celular a cada dois dias após este procedimento. Métodos como eletrofisiologia e imunocitoquímica podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como como os canais iônicos no intestino respondem ao tratamento medicamentoso e para aprender sobre a expressão de proteínas em neurônios e lia, e como a interação desses dois tipos de células são alteradas por vários tratamentos após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da neurobiologia explorarem as funções básicas das neuropatias e neuropatias g do sistema nervoso entérico em animais geneticamente modificados. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar neurônios e glia do plexo TER do sistema nervoso entérico de camundongos adultos.