Microfluidic On-chip Reação Capture-cicloadição para imobilizar reversível pequenas moléculas ou estruturas multi-componentes para aplicações de biossensores

O objetivo geral do experimento a seguir é demonstrar uma estratégia rápida e generalizável para imobilizar reversivelmente pequenas moléculas e nanopartículas funcionalizadas na superfície de chips sensores. Isso é conseguido pela primeira imobilização de anticorpos anti-GST em uma superfície de sensor. Como uma segunda etapa, captura do antígeno GST.

Funcionalizado com grupos transciclo, octina ou tetrazina, fornece uma superfície reativa para reações subsequentes de edição de ciclo com derivados de seno tet de moléculas pequenas ou conjugados de ciclooctanagem de tendência de nanopartículas, que são posteriormente funcionalizados com derivados de seno tet de moléculas pequenas. Em seguida, a superfície funcionalizada pode ser usada para análise de interação com um alvo solubilizado desejado. Na última etapa, a superfície é regenerada, permitindo ciclos de edição cíclica de captura subsequentes, os resultados de ligação mostram que as reações bioortogonais do navio preservam a capacidade de pequenas moléculas imobilizadas ou duas nanopartículas funcionalizadas in situ de interagir com o alvo FK BP 12 e ilustram como essa abordagem pode ampliar a gama de aplicações para SPR.

A principal vantagem desta técnica de edição do ciclo de captura no chip é que ela permite a rápida reversibilidade e mobilização de pequenas moléculas com controle sobre a orientação e a densidade de mobilização I. Normalmente, o processo de edição do ciclo de captura pode ser realizado em minutos, diminuindo significativamente os tempos de preparação da superfície, demonstrando que o procedimento será Jason Sandler, um aluno do nosso laboratório Para iniciar este procedimento com oito microlitros de uma solução T-C-O-N-H-S de 50 milimolares em DMSO para 100 microlitros de uma solução GST de um miligrama por mililitro em PBS. Depois de agitar a mistura à temperatura ambiente durante uma hora, retirar o excesso de reagente com uma coluna de dessalinização Zeba.

Em seguida, adicione seis microlitros de uma solução de éster tetra NHS de 25 milimolares em DMF a 75 microlitros de uma solução de um miligrama por mililitro de GST em PBS e agite a mistura em temperatura ambiente após uma hora. Dilua a mistura de reação com 25 microlitros de PBS e purifique usando uma coluna de dessalinização por centrifugação. Em seguida, adicione 100 microlitros da solução de 50 milimolares T-C-O-N-H-S a 150 microlitros de uma solução de nanopartículas emanada e agite a mistura da mesma maneira que antes.

Após a mistura, remover o excesso de reagente por filtração em gel usando uma coluna NAP 10. Aludido com buffer PBS. Colete a faixa colorida que contém o produto N-P-T-C-O.

Transferir a amostra purificada para um tubo de centrifugação contendo um dispositivo de filtragem centrífuga com um limite de peso molecular de 100 000. Em seguida, concentre a amostra em um volume final de aproximadamente 150 microlitros após a centrifugação. Adicione 50 microlitros de solução de anidrido cínico 0,1 molar em DMSO à solução NPTC.

Depois de agitar a mistura à temperatura ambiente por uma hora, purifique o produto NPTCO usando uma coluna NAP 10 iludindo com PBS usando um plasma de superfície no instrumento de ressonância, selecione imobilização nas células de fluxo um e dois no modelo do assistente de imobilização AM. Modifique o método de Amin para ativar grupos carboxílicos de superfície por injeção de uma solução um-para-um de EDC 0,4 molar e NHS 0,1 molar por 480 segundos. A uma taxa de fluxo de 10 microlitros por minuto, defina a injeção de etanolamina para extinguir os ésteres ativados restantes para um 422º tempo de contato a uma taxa de fluxo de 10 microlitros por minuto.

Insira o nome do ligante anti GST e defina para injetar por um tempo de contato de 420 segundos a uma taxa de fluxo de 10 microlitros por minuto. Em seguida, coloque os frascos de solução previamente preparados no rack de reagentes dois. Certifique-se de combinar as posições com a lista de conteúdo após atribuir o nome do arquivo e o destino onde os dados serão salvos.

Inicie a imobilização. Edite o assistente de imobilização para injetar apenas 20 microgramas por mililitro da solução de ligante GST por 420 segundos a cinco microlitros por minuto sobre a célula de fluxo de referência um. Coloque os frascos contendo a solução de oleína TERAZ 10 micromolares previamente preparada e a solução de regeneração no suporte de reagentes dois.

Selecione o método de execução manual, defina a vazão para cinco microlitros por minuto e o caminho do fluxo para a célula de fluxo dois. Injete a solução G-S-T-T-C-O por 420 segundos, seguida pela solução Teraz Benz Lamine por 600 segundos. Em seguida, regenere a superfície com duas 32ª injeções de solução de regeneração.

Depois de colocar o zine GST TERAZ, NPCO, teraz Belamine e frascos de solução de regeneração no rack de reagentes dois, selecione o método de execução manual do instrumento e, em seguida, defina a taxa de fluxo para cinco microlitros por minuto e o caminho do fluxo para a célula de fluxo dois. Injetar uma solução de GST Tetrazine durante 60 segundos, seguida de uma solução de N-P-T-C-O durante 60 segundos. Por fim, injete uma solução de tetras zine belamina por 60 segundos.

Quando terminar, regenere a superfície da mesma maneira que antes. Em seguida, selecione um novo método e insira os parâmetros gerais, que incluem coleta de dados, detecção de taxa, compartimento de amostra, temperatura, unidades de concentração e configurações de buffer. No painel de etapas de ensaio, crie uma nova etapa e nomeie-a como amostra.

Em seguida, defina a finalidade e conecte as configurações baseadas na amostra no painel de tipos de ciclo, crie uma nova etapa do ciclo e insira os seguintes comandos. Capture a regeneração de amostra um e a regeneração dois. Selecione o comando de captura e insira G-S-T-T-C-O como o ligante.

Nomeie 120 segundos como o tempo de contato, cinco microlitros por minuto como a taxa de fluxo. E defina o caminho do fluxo para o segundo. Em seguida, selecione o comando sample e insira um 182º tempo de contato, um 62º tempo de dissociação, uma taxa de fluxo de 30 microlitros por minuto e defina o caminho do fluxo para ambos.

Depois disso, selecione o comando de regeneração um e insira a solução de regeneração. Nomeie um 32º tempo de contato a 30 microlitros por minuto e defina o caminho do fluxo para o segundo. Repita o mesmo procedimento para a regeneração.

Dois comandos selecionam set, run e definem o caminho do fluxo para dois traços. Selecione a seguir e preencha a lista de amostras com a solução de analito tetra Belamina e uma série de concentrações de 1,5 a 20 micromolares em uma diluição de um a dois. Em seguida, selecione ao lado do painel de posição do rack.

Depois de colocar os frascos para injetáveis de solução no suporte de reagente dois, coloque a série de diluição. Em uma placa de 96 poços. Certifique-se de combinar as posições com a lista de conteúdo.

Salve o modelo de método e inicie o ensaio de ligação. Digamos que uma vez que um novo método e os parâmetros gerais tenham sido selecionados, crie e nomeie a amostra de captura e as etapas de regeneração no painel de etapas do ensaio. Em seguida, selecione a finalidade correspondente e conecte as configurações básicas.

Em seguida, selecione o painel de tipos de ciclo e crie três etapas de ciclo. Captura, amostragem e regeneração. Insira o comando de captura duas vezes no ciclo de captura.

Entre no painel de captura um. Selecione a solução de captura como variável. Em seguida, defina o tempo de contato para 300 segundos a uma taxa de fluxo de cinco microlitros por minuto e defina o caminho do fluxo para segundo no painel de captura dois.

Selecione a solução de captura como uma variável. Defina o tempo de contato para 250 segundos a uma taxa de fluxo de cinco microlitros por minuto e defina o caminho do fluxo para segundo. Em seguida, insira o comando sample na etapa do ciclo de sample.

Selecione o painel de amostra e defina o tempo de contato para 60 segundos. O tempo de dissociação para 200 segundos a uma taxa de fluxo de 30 microlitros por minuto e definir o caminho do fluxo para ambos. Insira o comando de regeneração duas vezes na etapa do ciclo de regeneração, selecione o painel de regeneração e insira a solução de regeneração.

Nomeie um tempo de contato de 30 segundos a 30 microlitros por minuto e defina o caminho do fluxo como segundo. Repita o mesmo procedimento para a regeneração. Dois painéis selecionam configurar, executar e definir o caminho do fluxo para dois traços, um selecione em seguida e insira G-S-T-T-C-O e teraz AP 1, 497 conjugado como a solução de captura nomeia FKBP 12 como o nome da amostra e 1,5 a 96 nano molar em uma diluição de um a dois como a série de concentração.

Depois de colocar os frascos de solução no suporte de reagente dois e a série de diluição em uma placa de 96 poços, salve o modelo do método e inicie o ensaio de ligação. A imobilização reversível eficiente de pequenas moléculas bioativas com controle sobre orientação e densidade desempenha um papel fundamental no desenvolvimento de novas aplicações de biossensores. Aqui é mostrado o monitoramento em tempo real da imobilização de benjoim terazzine.

Uma solução de G-S-T-T-C-O é injetada sobre uma superfície anti-GST pré-imobilizada, resultando em um aumento de aproximadamente 400 R RU. Em resposta, uma segunda injeção com Teraz zine Benzo Lamine mostra um rápido aumento de 15 RU em resposta. Nenhuma dissociação do antígeno dert foi observada após a mudança para o tampão de corrida, fornecendo evidências de estabilidade da estrutura.

A superfície foi regenerada na última etapa do ciclo para permitir vários ciclos de edição de ciclo de captura. Usando este procedimento e substituindo a porção tetra zina, benzil lamina pelo conjugado teraz zine AP 1, 497 gera uma superfície bioativa, que é usada para estudos de interação com seu alvo. A interrupção do FK BP 12 da interação antígeno do anticorpo regenera a superfície anti GST, permitindo que um novo conjunto molecular seja construído.

Nesse caso, uma injeção de zine GST TERAZ é seguida por uma injeção de NPTC, imobilizando efetivamente a nanopartícula na superfície do sensor. Grupos TCO não reagidos nas nanopartículas estão disponíveis para edição ciclográfica com teraz zine benzo lamina injetado. Alternativamente, o conjugado TET INE AP 1, 497 é usado para monitorar as interações funcionalizadas da nanopartícula FK BP 12.

Nenhuma dissociação das estruturas multicomponentes foi observada, fornecendo evidências de estabilidade da estrutura e bioatividade com recursos para monitoramento de reação de imobilização em tempo real e regeneração de superfície. A caracterização direta da taxa de associação KA é realizada como mostrado aqui. O conhecimento da cinética da reação fornece diretrizes para controlar a densidade de imobilização e parâmetros importantes para ensaios de biossensores.

A injeção de concentrações crescentes de teraz BELAMINE ou NPTCO em duplicata sobre as superfícies de teraz zine GST ou GST, respectivamente, gera os dados de ligação. Os dados de ligação para duas amostras de analito sequencial da mesma concentração na mesma superfície são quase super impossíveis, refletindo uma perda mínima da capacidade de ligação de anticorpos. Devido aos vários ciclos de edição e regeneração do ciclo de captura, o software de avaliação fornece a análise cinética de melhor ajuste para as taxas de reação da edição do ciclo.

Desenvolvemos uma abordagem que utiliza a captura de antígenos de anticorpos, juntamente com reações rápidas e altamente específicas de edição de ciclo entre terazzine e transciclina que permitem a imobilização rápida e reversível de pequenas moléculas. Para estudos baseados em chip SPR, o método de edição do ciclo de captura requer tempos de contato curtos com menos de 10 concentrações micromolares de ligantes de moléculas pequenas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como imobilizar pequenas moléculas ou estruturas multicomponentes em uma superfície de sensor usando o método de edição de ciclo de captura.

Para conseguir isso, é importante usar reagentes de boa qualidade para reações de conjugação e configurar adequadamente os parâmetros do ensaio no instrumento SPR.