Name: Microfluidic On-chip Reação Capture-cicloadição para imobilizar reversível pequenas moléculas ou estruturas multi-componentes para aplicações de biossensores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-23T18:15:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: Aprenda a imobilizar reversivelmente pequenas moléculas e nanopartículas em chips de sensores para estudos de SPR usando química de cicloadição bioortogonal. Este método permite regeneração da superfície para múltiplos ciclos de análise.

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Reconhecemos financiamento do NIH (NHLBI Contrato n º HHSN268201000044C a RW, SH e SYS).

1. Preparação de GST e nanopartículas (NP) Conjugados <ol><li> GST-TCO preparação: <ol><li> Adicionar 8 mL de solução de TCO-NHS (50 mM em DMSO) a 100 ul de GST (1 mg / ml em PBS) e agitar a mistura temperatura ambiente durante 1 hora. </li><li> Retire o excesso de reagente, utilizando uma coluna de spin dessalinização Zeba. O filtrado recuperado contendo o conjugado de GST-TCO é armazenado a 4 ° C antes de usar. </li></ol></li><li> GST-Tz preparação: <ol><li> Adicionar 6 ml de solução-Tz-NHS (25 mM em DMF) a 75 ul de GST (1 mg / ml em PBS) e agitar a mistura temperatura ambiente durante 1 hora. </li><li> Dilui-se a mistura de reacção com 25 ul de PBS e purificar usando uma coluna de spin de dessalinização. O filtrado contendo o conjugado de GST-Tz é armazenado a 4 ° C antes de usar. </li></ol> Nota: análises Massa (MALDI-TOF) mostrou que, em média ~ 10 Tz ou TCO moléculas foram conjugado com GST. </li><li> NP-TCO preparação: <ol><li> Adicione 100 ml de solução TCO-NHS (50 mM em DMSO) para150 ul de nanopartículas aminada (NP-NH 2, 8,7 mg Fe / ml, em PBS, 3 nm núcleo de ferro Fe ~ 8000 / NP) e agitar a mistura temperatura ambiente durante 1 hora. </li><li> Remover o excesso de reagente por filtração em gel utilizando uma coluna NAP-10 eluída com tampão PBS. Recolher o faixa colorida que contém o produto NP-TCO. </li><li> Concentra-se o filtrado para um volume final de ~ 150 ul usando um dispositivo de filtro de centrífuga (100 k MWCO). </li><li> Adicionar 50 ul de anidrido succínico, (0,1 M em DMSO) para a solução de NP-TCO e agitar à TA durante 1 hora (anidrido reage com quaisquer aminas restantes para formar ácidos carboxílicos terminais. Isto evita interacções não específicas com a superfície de dextrano). </li><li> Purifica-se o produto NP-TCO utilizando uma coluna NAP-10, efectuando a eluição com PBS. Armazene a solução de NP-TCO a 4 ° C antes de usar. </li></ol></li></ol> 2. Preparação da superfície Todos os ensaios de ressonância de plasma de superfície são realizados num instrumento Biacore T100 (GE Healthcare) a25 ° C, utilizando um chip sensor CM5 e PBS-P como o tampão de corrida a menos que indicado de outra forma. Software de avaliação Biacore Controle e fornecido com o instrumento são empregados para a criação de experimentos e análise de dados. Dois modos de operação, assistentes de aplicativo e executar o manual será utilizado para elaboração e acompanhamento de superfície on-chip de captura de cicloadição. O modo de método construtor será usado para a criação de experiências de orientação de ligação inversa e para medir as taxas de reação de cicloadição. Os dados são o dobro referência subtraído e análises cinéticas são realizadas utilizando um modelo de ligação 01:01 Langmuir. <ol><li> Use o modelo assistente amina imobilização e selecione a imobilização das células de fluxo 1 (referência) e 2 (detecção). Modificar método amina para activar os grupos carboxílicos na superfície por injecção de uma solução 1:1 de EDC 0,4 M: 0,1 M de NHS para 480 segundos a uma taxa de fluxo de 10 mL / min. Definir a injeção de etanolamina para saciar restantes ésteres activados a 420 seg tempo de contato emuma taxa de fluxo de 10 mL / min. </li><li> Nome de entrada ligando, anti-GST (18 mg / ml em tampão acetato, pH 5,0) e ajustado para injectar para um tempo de contacto de 420 seg a uma taxa de fluxo de 10 mL / min. </li><li> Coloque os frascos de soluções exigidas em reagente cremalheira 2 certificando-se de combinar os cargos com a lista de conteúdos. Salvar e iniciar a imobilização. Nota: Executar o assistente de imobilização dessa maneira resulta em níveis de imobilização anti-GST na faixa de ~ 14.000 a 17.000 RU. </li><li> Edite o assistente de imobilização apenas injetar GST ligante solução (20 mg / ml) para 420 segundos a 5 mL / min ao longo da célula de fluxo de referência 1. </li></ol> 3. Monitoramento On-chip Capture-cicloadição de funcionalizados Moléculas <ol><li> Monitoramento on-chip de captura de cicloadição em tempo real (Figura 2). <ol><li> Coloque GST-TCO (20 ug / ml), Tz-BnNH 2 (10 uM) e regeneração (glicina 10 mM, pH = 2,0) em frascos de solução reagente prateleira 2. Selecione o homemmétodo run ual, defina a taxa de fluxo de 5 mL / min e fluxo caminho para célula de fluxo 2. </li><li> Injectar solução de GST-TCO para 420 seg. </li><li> Injectar solução de Tz-BnNH 2 para 600 seg. </li><li> Regenerar a superfície com duas injecções de 30 seg de solução de regeneração. </li></ol></li><li> Monitorização de montagem no chip de estruturas multi-componentes em tempo real (Figura 3): <ol><li> Coloque GST-Tz (20 ug / ml), NP-TCO (100 mg Fe / ml), Tz-BnNH 2 (10 uM) e regeneração (glicina 10 mM, pH = 2,0) em frascos de solução reagente prateleira 2. Selecione o instrumento método de execução manual, definir a taxa de fluxo de 5 mL / min eo caminho do fluxo de célula de fluxo 2. </li><li> Injetar uma solução de GST-Tz para 60 seg. </li><li> Injetar uma solução de NP-TCO para 60 seg. </li><li> Injetar uma solução de Tz-BnNH 2 para 60 seg. </li><li> Regenerar a superfície com duas injecções de 30 seg de solução de regeneração. </li></ol></li></ol> 4. MCOMPANHAMENTO Densidade Imobilização e Determinação de Preços Cycloaddition <ol><li> Caracterização de pequenas taxas de reação de cicloadição molécula (Figura 4). <ol><li> Selecione o método de entrada e novos parâmetros gerais. No painel passos de ensaio criar um novo passo e nomeie-Sample. Defina o Objetivo e Conecte configurações de base para amostra. </li><li> No painel Tipos Ciclo Crie uma nova etapa do ciclo e inserir os seguintes comandos; Capture, Sample, Regeneração 1 e Regeneração 2. </li><li> Seleccione o comando de captura; nome ligando de entrada (GST-TCO, 20 ug / ml), o tempo de contacto de 120 s a 5 mL / min e definir o caminho de fluxo para: Segunda. Selecione o comando Amostra; entrada 180 seg Tempo de contato, 60 seg tempo de dissociação, a taxa de fluxo de 30 mL / min e definir o caminho de fluxo para: Ambos. Selecione o comando Regeneração 1; nome solução de regeneração de entrada (10 mM de glicina-HCl pH 2,0), tempo de contato de 30 segundos a 30 mL / min e definir o caminho de fluxo para: Second. Repita o mesmo para Regeneração 2 de comando. &lt;/ Li&gt; <li> Selecione Executar Setup e definir o caminho de fluxo para: 2-1. Selecione ao lado e preencha lista de amostras com solução de analito (Tz-BnNH 2) e uma série de concentração (0,3-10 mM, 1:2 diluição). Selecione ao lado de rack painel posição. Local frascos de solução reagente em rack de 2 e série de diluição em placa de 96 poços certificando-se de combinar os cargos com a lista de conteúdos. Salve modelo método e começar a análise de ligação. Os dados de ligação e análise cinética são apresentados na Figura 4. </li></ol></li><li> Caracterização das taxas de reação de cicloadição NP (Figura 4). <ol><li> Abra o modelo de método salva por cima e alterar os seguintes parâmetros. Selecione o painel de captura; mudança de nome ligante para GST-Tz, 20 mg / ml. Selecione o painel Amostra; mudança tempo de contato de 120 segundos de tempo de contato e tempo de dissociação a 120 seg. </li><li> Selecione a lista de amostra; mudar analito a NP-TCO e séries concentração (7-224 nM, 1:2 diluição). Local frascos de solução em rack de reagente2 e série de diluição em placa de 96 poços certificando-se de combinar os cargos com a lista de conteúdos. Salve modelo método e começar a análise de ligação. Os dados de ligação e análise cinética são apresentados na Figura 4. </li></ol></li></ol> 5. Medir o Binding of FKBP12 para AP1497 Imobilizado Os estudos de ligação de inversão de orientação empregar FKBP12 como o analito e AP1497 composto como ligando imobilizado (Figura 5). O método geral para este ensaio está configurado da seguinte forma utilizando a ferramenta método construtor: <ol><li> Selecione o método de entrada e novos parâmetros gerais. No painel etapas de ensaio e criar nome de captura, de amostra e regeneração passos. Selecione Finalidade correspondente e Conecte configurações de base. </li><li> Selecione o painel Tipos de ciclo e criar três etapas do ciclo: Capture, Sample e regeneração. </li><li> Insira o comando de captura duas vezes na etapa do ciclo de captura. Selecione a captura 1 painel e selecione solução de captura como variablE, o tempo de contacto definido para 300 segundos a uma taxa de fluxo de 5 mL / min e definir o caminho de fluxo para: Segunda. Selecione o painel de Captura 2 e selecione solução de captura como variáveis, definir o tempo de contato de 250 segundos a uma taxa de fluxo de 5 mL / min e definir o caminho de fluxo para: Second. </li><li> Insira o comando da Amostra segundo a etapa do ciclo de amostra. Selecione o painel Amostra; conjunto tempo de contato de 60 segundos, o tempo de dissociação a 200 segundos a uma vazão de 30 mL / min e definir o caminho de fluxo para: Ambos. </li><li> Insira o comando Regeneração duas vezes sob a etapa do ciclo de regeneração. Selecione o painel Regeneração 1; nome solução de regeneração de entrada (10 mM de glicina-HCl pH 2,0), tempo de contato de 30 segundos a 30 mL / min e definir o caminho de fluxo para: Second. Repita o mesmo para o painel de Regeneração 2. </li><li> Selecione Executar Setup e definir o caminho de fluxo para: 2-1. Selecione nomes de soluções de captura de próximos e de entrada (GST-TCO e AP1497-Tz), nome da amostra (FKBP12), série de concentração (0,020 a 5 mg / ml, 1:2 diluição) e MW (13.000). Local frascos de solução em reagent cremalheira 2 e série de diluição em placa de 96 poços certificando-se de combinar os cargos com a lista de conteúdos. Salve modelo método e começar a análise de ligação. Dados da análise cinética são apresentados na Figura 5. </li></ol> 6. Medir o Binding of FKBP12 para AP1497 Anexado ao Imobilizado PN O método geral para a imobilização de nanopartículas, pequena molécula derivação e FKBP12 ensaio de ligação é configurado da seguinte forma utilizando a ferramenta método construtor: <ol><li> Abra o modelo de método salvou de cima e modificar. Insira um comando adicional de captura na etapa do ciclo de captura. Selecione um painel de captação; desmarcar solução de captura como solução de captura variável e nome 1 (GST-Tz). Conjunto de tempo de contacto de 60 segundos a uma taxa de fluxo de 5 mL / min e definir o caminho de fluxo de Segunda. Selecione o painel de Captura 2; desmarcar solução de captura como solução de captura variável e nome 2 (NP-TCO). Tempo conjunto de contacto de 90 segundos a uma taxa de fluxo de 5 mL / min edefinir o caminho de escoamento para o segundo. Selecione o painel de Captura 3; desmarcar solução de captura como solução de captura variável e nome 3 (AP1497-Tz). Tempo conjunto de contacto de 180 seg a uma taxa de fluxo de 5 mL / min e definir o caminho de fluxo de Segunda. </li><li> Selecione Executar Setup e definir o caminho de fluxo para: 2-1. Selecione ao lado duas vezes. Local frascos de solução reagente em rack de 2 e série de diluição em placa de 96 poços certificando-se de combinar os cargos com a lista de conteúdos. Salve modelo método e começar a análise de ligação. Dados da análise cinética são apresentados na Figura 5. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O método de captura-cicloadição descrita aqui permite a rápida imobilização, reversível de nanopartículas modificadas e pequenas moléculas para a interação baseada em chip sem rótulo e estudos cinéticos. O protocolo de imobilização pode ser realizada em minutos, que requerem &lt;10 uM concentrações de ligandos de pequenas moléculas. Modulando concentração de ligante e densidades de imobilização tempo de contato pode ser rigorosamente controlado. Nossos dados mostram que no chip reações bioorthogonal preservar a capacida...

Reações de conjugação eficientes são ferramentas valiosas para a fixação de moléculas bioativas em superfícies para uma variedade de aplicações biotecnológicas. Recentemente, o bioorthogonal muito rápido [4 +2] de reacção de cicloadição entre trans-cicloocteno (TCO) e 1,2,4,5-tetrazina (Tz) tem sido utilizado para marcar as superfícies das células, estruturas subcelulares, anticorpos e nanopartículas 1. - 7 Aqui, usamos o [4 +2] reação de cicloadição em combinação com captura de antígeno / anticorpo (GST / anti-GST) para síntese reversível on-chip de estruturas multi-componentes para a superfície Plasmon Resonance (SPR) análise da interação e monitorar o processo em tempo real (Figura 1). 8,9 Notavelmente, a estratégia de captura de cicloadição permite a regeneração da superfície utilizando um protocolo estabelecido. 8 Consequentemente, a montagem de superfícies de sensores estáveis ​​com controlo sobre a orientação e densidade de ligando para a variedade de ensaio novo formatos é agora possível. Utilizaçãoesta estratégia que demonstram a imobilização de moléculas pequenas TCO / Tz derivatizados e caracterizar as taxas de cicloadição de uma variedade de condições de tampão. Escolhemos a interacção conhecida entre FKBP12 e AP1497 uma molécula que se liga a FKBP12 10-12 por exemplo, para verificar se a estratégia de captura de cicloadição preserva a capacidade da molécula pequena de interagir com o seu alvo, quer directamente, quando ligado a antigénios GST imobilizadas ou nanopartículas imobilizadas (NPS). Este método proporciona várias vantagens. Em primeiro lugar, a imobilização reversível de pequenas moléculas em chips sensores agora é possível. Em segundo lugar, TCO / Tz imobilização de pequenas moléculas também permite estudos de interacção livre de rótulo que revertem a orientação de estudos SPR canônicas, e pode fornecer uma visão complementar de uma interação de ligação. Em terceiro lugar, este método permite a síntese de microfluidos de nanopartículas alvo, e a avaliação imediata da sua bindinpropriedades g. Este promete melhorar a eficiência da avaliação ou triagem nanopartículas alvo, e também diminuir as quantidades requeridas de nanopartículas. 13-15 Em quarto lugar, esta abordagem pode medir a cinética de reacção de reacções de cicloadição bioorthogonal em tempo real, sob fluxo contínuo. Finalmente, a imobilização química do TCO / Tz é robusta na presença de soro. Tomados em conjunto, prevemos que esta abordagem versátil amplamente facilitar a construção de superfícies estáveis ​​sensores para uma grande variedade de estudos microfluídicos com relevância para a in vitro e em aplicações celulares in vivo.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagente</td></tr><tr><td>Chip Sensor CM5</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1005-30</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de acoplamento de amina</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1000-50</td><td>;</td></tr><tr><td>Kit de captura de GST</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1002-23</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Colunas NAP-10</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0854-01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>GST, liofilizado em 1X PBS</td><td>Genscript</td><td>Z02039</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>rhFKBP12</td><td>R& D Systems</td><td>3777-FK</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Surfactante P-20</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1000-54</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glicina 2.0</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1003-55</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Coluna de dessalinização giratória Zeba</td><td>Thermo</td><td>89882</td><td>7 K MWCO</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 4</td><td>Filtro centrífugo</td><td></td><td>Fisher UFC810096</td> 100 K</tr><tr><td>TCO-OH</td><td>Ref. 8</td><td></td><td>Sintetizado internamente</td></tr><tr><td>TCO-NHS</td><td>Ref. 8</td><td></td><td>Sintetizado internamente, *Disponível comercialmente na Click Chemistry Tools # 1016-25</td></tr><tr><td>Tz-BnNH2</td><td>Ref. 8</td><td></td><td>Sintetizado internamente</td></tr><tr><td>Tz-NHS</td><td>Ref. 8</td><td>764701</td><td>Sintetizado internamente, *Disponível comercialmente na Sigma Aldrich # 764701</td></tr><tr><td>NP-NH2 = CLIO-NH2</td><td>Ref. 8</td><td></td><td>Sintetizado internamente</td></tr><tr><td>AP1497, AP1497-Tz</td><td>Ref. 8</td><td></td><td>Sintetizado internamente</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>SPR Biosensor</td><td>GE Biacore</td><td>T100</td><td></td> de saúde</tr></tbody></table>

microfluidic on-chip reação capture-cicloadição para imobilizar reversível pequenas moléculas ou estruturas multi-componentes para aplicações de biossensores

Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications

Métodos para a rápida imobilização superfície de pequenas moléculas bioativas com controle sobre orientação e densidade de imobilização são altamente desejáveis ​​para aplicações de biossensores e microarray. Neste estudo, nós usamos um covalente bioorthogonal altamente eficiente [4 +2] reação de cicloadição entre trans-cicloocteno (TCO) e 1,2,4,5-tetrazina (Tz) para permitir a imobilização microfluídicos de moléculas TCO / Tz-derivados . Nós monitoramos o processo em tempo real, em condições de fluxo contínuo, utilizando ressonância plasmônica de superfície (SPR). Para permitir a imobilização reversível e estender o intervalo experimental de a superfície do sensor, que combinam um componente de captura de antígeno-anticorpo não-covalente com a reacção de cicloadição. Ao apresentar alternadamente TCO ou Tz metades à superfície do sensor, vários processos de captura de cicloadição são agora possíveis em uma superfície do sensor para montagem on-chip e interação estudos de uma variedade de estruturas multi-componentes. Nós illustrate este método com duas experiências diferentes de imobilização sobre um chip de biossensor; uma molécula pequena, AP1497, que liga a proteína de ligação de FK506 12 (FKBP12), e a mesma molécula pequena, como parte de uma nanopartícula funcionalizado situ imobilizada e em.

Os dados e valores foram adaptados de referência 8. Imobilização reversível eficiente de moléculas pequenas bioactivos com controlo sobre a orientação e densidade desempenha um papel chave no desenvolvimento de novas aplicações de biossensores. Utilizando a reacção bioorthogonal rápido entre TCO e Tz, nós descrevemos um processo para a montagem de forma gradual e, a regeneração da superfície de ligandos, com retenção da actividade biológica. Figura 2 mostra a monitorização e...

Nós apresentamos um método para a rápida imobilização, reversível de moléculas pequenas e montagens de nanopartículas funcionalizadas para a superfície Plasmon Resonance (SPR) estudos, usando seqüencial on-chip química cicloadição bioorthogonal e antígeno-anticorpo de captura.

Microfluidic On-chip Reação Capture-cicloadição para imobilizar reversível pequenas moléculas ou estruturas multi-componentes para aplicações de biossensores

Methods  for rapid surface immobilization of bioactive small molecules with control over  orientation and immobilization density are highly desirable for ...

O objetivo geral do seguinte experimento é demonstrar uma estratégia rápida e generalizável para imobilizar de maneira reversível moléculas pequenas e nanopartículas funcionalizadas na superfície de chips sensores. Isso é alcançado primeiramente imobilizando anticorpos anti-GST em uma superfície sensora. Como segundo passo, o aprisionamento do antígeno GST.Funcionalizada com grupos trans ciclo, octina ou tetrazina, fornece uma superfície reativa para reações subsequentes de cicloadição com derivados de pequenas moléculas de tetrazina ou conjugados de nanopartículas com trendociclooctano, que posteriormente são funcionalizados com derivados de pequenas moléculas de tetrazina. Em seguida, a superfície funcionalizada pode ser utilizada para análise de interação com um alvo solubilizado de interesse. Na última etapa, a superfície é regenerada, permitindo ciclos subsequentes de captura por cicloadição. Os resultados de ligação demonstram que reações bioortogonais em chip preservam a capacidade de pequenas moléculas imobilizadas ou nanopartículas funcionalizadas in situ de interagir com o alvo FKBP12 e ilustram como essa abordagem pode ampliar o espectro de aplicações da SPR.A principal

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Microfluidic On-chip Reação Capture-cicloadição para imobilizar reversível pequenas moléculas ou estruturas multi-componentes para aplicações de biossensores

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