Drosophila melanogaster, são amplamente utilizados como um organismo modelo no desenvolvimento e reprodução do estudo. O progresso da Drosophila através de várias etapas de desenvolvimento em um processo conhecido como ciclo de vida e cada etapa fornece uma plataforma única para pesquisa de desenvolvimento. Neste vídeo, apresentaremos os fundamentos do desenvolvimento e reprodução de Drosophila, incluindo como criar uma cruz genética e discutir como essa pesquisa pode ser aplicada para entender processos que vão desde a cicatrização de feridas até o comportamento.
Primeiro, vamos discutir o ciclo de vida de Drosophila. O progresso da drosophila através de 4 estágios principais de desenvolvimento: embrião, larva, pupa e adulto.
O embrião é um óvulo fertilizado que tem cerca de 0,5 mm de comprimento e forma oval. Imediatamente após a fertilização, o embrião sofre rápida divisão mitótica sem crescimento. O núcleo zigolítico sofre nove rodadas de divisão nuclear, mas não sofre citocinese, formando uma célula multi-nucleada chamada blastoderme sinintita. Como todos os núcleos do blastoderme sinintital compartilham um citoplasma comum, as proteínas podem difundir livremente, formando gradientes de morfógenos, que são importantes para estabelecer o plano corporal e padronização de órgãos e tecidos individuais na mosca. Após a 10ª divisão nuclear, os núcleos migram para a periferia do blastoderm sinintítial. Após a 13ª rodada de divisão nuclear, que ocorre aproximadamente 3 horas após a fertilização, os 6000 núcleos na blastodermia sinintítial tornam-se individualizados formando o blastoderm celular. O blastoderme celular contém uma monocamada de células e é transformado em uma complexa estrutura multicamadas, em um processo conhecido como gastrusão. Durante a gastruação, as alterações de forma celular impulsionam as invaginações da monocamada, criando, em última análise, as camadas de endoderme, mesoderme e germe ectoderme. O endoderme dá origem ao intestino, o mesoderme dá origem aos músculos e coração, e o ectoderme dá origem à epiderme e ao sistema nervoso central. Depois de 24 horas, embriões eclodem como larvas.
Larvas são brancas com corpos segmentados semelhantes a vermes. Eles rastejam em torno de comida molhada comendo constantemente, levando a um rápido crescimento. Larvas avançam em três estágios: o primeiro instar por 24 horas, o segundo instar por mais 24 horas e o terceiro instar por 48 horas. A fusão ocorre entre cada etapa. Quando prontas para a pupação, as terceiras larvas instar saem de sua fonte de alimento e se prendem a uma superfície firme, como o lado de um frasco.
Pupa são imóveis e são inicialmente macias e brancas, mas eventualmente endurecem e ficam marrons. Durante um período de quatro dias, tecidos larvais degeneram e tecidos adultos se formam. A eclosão marca o fim do estágio pupal e as moscas emergem como adultas.
8 horas após o encerramento, os adultos se tornam sexualmente receptivos e começam a acasalar, começando o ciclo de vida novamente.
O ciclo de vida completo leva cerca de 10 dias a 25 °C, mas pode ser afetado pela temperatura. Por exemplo, a 18 °C o ciclo de vida é de cerca de 19 dias e a 29 °C, o ciclo de vida é de apenas 7 dias.
Ao longo do desenvolvimento, a cuidadosa regulação genética da formação de padrões estabelece o plano corporal e especifica tecidos e órgãos individuais. É importante ressaltar que o estabelecimento do eixo anterior-posterior define a orientação cabeça a cauda do organismo, e é regulado por diversos grupos de genes.
Em primeiro lugar, os genes de efeito materno são fornecidos no oócito e herdados da fêmea. Eles são importantes no blastoderm siníntial para estabelecer inicialmente o anterior e posterior do embrião. Em particular, o gene bicoide define o anterior do embrião, incluindo a cabeça e o tórax, enquanto o gene nanos define o posterior, incluindo o abdômen.
Em segundo lugar, os genes de segmentação, que são regulados por genes de efeito materno, incluem os genes de lacuna e os genes de regras de pares. Genes de lacuna estabelecem um plano corporal segmentado ao longo do eixo anterior-posterior, subdividindo amplamente o embrião. Os genes de regras par são expressos em um padrão listrado perpendicular ao eixo anterior-posterior, dividindo ainda mais o embrião em segmentos menores. Em seguida, os genes de polaridade do segmento, como engrailed começam a estabelecer destinos celulares dentro de cada segmento.
Por fim, os genes homeóticos são responsáveis pela definição de estruturas anatômicas particulares, como asas e pernas. Curiosamente, a ordem dos genes no cromossomo reflete como eles são expressos ao longo do eixo anterior-posterior.
Drosophila são organismos extremamente férteis que podem produzir milhares de descendentes em toda a vida. As fêmeas depositam centenas de ovos por dia e continuam a fertilizar ovos bem depois que o acasalamento ocorreu.
Drosophila também são organismos sexualmente dimórficos, o que significa que as fêmeas são fenotipicamente distintas dos machos. Em particular, os machos são menores que as fêmeas e têm genitália externa de cor escura, bem como mais pigmento preto em seus abdômens inferiores. Os machos também têm um pedaço de cerdas em suas pernas dianteiras chamadas pentes sexuais usados para prender a fêmea durante a cópula. Essas diferenças fenotípicas distintas tornam muito fácil distinguir machos das fêmeas, o que é particularmente útil na criação de uma cruz genética.
Criar uma cruz com drosophila é uma técnica útil para estudar genética. Então vamos começar!
O primeiro passo para montar uma cruz é coletar fêmeas virgens do genótipo desejado, para que você possa controlar exatamente qual macho com quem ela acasalará. Drosophila não consegue acasalar durante as primeiras 8 horas após o encerramento, por isso coletar adultos muito jovens garante a virgindade. Para coletar fêmeas recém-fechadas, limpe o frasco para o necrotério para se livrar de todos os adultos. A cada 3-4 horas, verifique o frasco para adultos recém-eclosados, e colete as fêmeas em um novo frasco sem machos até estar pronto para uso. As fêmeas virgens são identificadas por sua cor corporal muito clara e uma mancha escura em seu abdômen, conhecido como mecônio.
Quando estiver pronto para começar a cruz, combine 4-6 machos com 4-6 fêmeas virgens de seus genótipos desejados em um frasco de comida datado, e armazene a 25° C e 60% de umidade. Após 3-4 dias, as larvas estarão presentes e os pais devem ser transferidos para um novo frasco, impedindo que os pais acasalem com a prole. Após aproximadamente 10 dias, novos descendentes surgirão e seus fenótipos podem ser examinados.
Uma ferramenta que os pesquisadores de Drosophila usam são cromossomos balanceador que previnem a recombinação genética e contêm marcadores genéticos como asas encaracoladas, que são úteis para determinar o genótipo correto de uma mosca. Se você queria moscas heterozidas para duas mutações diferentes, você pode cruzar um estoque com mutação #1 sobre o cromossomo balanceador CyO, para um segundo estoque com mutação #2 também equilibrado sobre CyO. Qualquer prole que emerge sem asas encaracoladas são heterozigous para ambas as mutações.
Outra ferramenta comumente usada na pesquisa de Drosophila é o sistema UAS-GAL4, que permite aos pesquisadores expressar ou derrubar um gene em um tecido específico. GAL4 é um fator de transcrição de levedura que é impulsionado por um promotor específico de tecido e uas é a sequência de ativação upstream, que controla a expressão do gene de interesse . Quando você cruza uma mosca com um transgene GAL4 específico de tecido para uma mosca com um transgene UAS com seu gene de interesse diretamente rio abaixo, a proteína GAL4 liga o UAS e impulsiona a expressão do seu gene desejado. Por exemplo, o UAS-GFP cruzou para apterous-GAL4, que é específico para os discos de asa em pupa, expressa GFP especificamente nessas células.
Existem muitas aplicações que podem ser usadas para estudar o desenvolvimento e a reprodução de Drosophila. Uma aplicação são análises comportamentais - especificamente comportamento de namoro. Durante o namoro, o macho se orienta em direção à fêmea e a segue enquanto a bate com suas pernas dianteiras. Se a fêmea é receptiva, ela permite que o macho a monte. O macho enrola seu abdômen e transfere fluido seminal para a fêmea, um processo conhecido como cópula. As análises desses comportamentos de namoro em vários mutantes dão uma visão do controle genético do comportamento
O desenvolvimento da drosophila é um processo extremamente dinâmico que inclui muitos movimentos celulares e mudanças de forma, que podem ser estudadas através de imagens ao vivo. Por exemplo, o fechamento dorsal durante a embriogênese é quando uma lacuna no epitélio é fechada de forma semelhante a um zíper envolvendo a coordenação de muitos tipos de células. O fechamento dorsal durante o desenvolvimento é frequentemente usado como modelo para estudar o fechamento de feridas, o que pode ter implicações clínicas.
Uma terceira aplicação usada para entender processos durante o desenvolvimento de Drosophila é a interferência de RNA, que derruba a atividade de genes individuais e pode ser usada em telas genéticas reversas em larga escala. Por exemplo, o dsRNA pode ser injetado em embriões, e o impacto da derrubada genética no desenvolvimento de órgãos, por exemplo, pode ser avaliado. Aqui, a interferência do RNA revelou um gene importante para a fusão durante o desenvolvimento traqueal.
Você acabou de assistir a introdução do JoVE à reprodução e desenvolvimento de Melanogaster de Drosophila. Neste vídeo revisamos: o ciclo de vida de Drosophila, incluindo detalhes sobre cada etapa de desenvolvimento. Também aprendemos a usar as capacidades reprodutivas do Drosophila para estudar genética e criar uma cruz. Finalmente, aprendemos como o desenvolvimento e a reprodução da Drosophila são úteis para a compreensão de processos complexos como comportamento, fechamento de feridas e desenvolvimento de órgãos.
Uma das muitas razões que fazem do Drosophila um organismo extremamente valioso é que os fundamentos moleculares, celulares e genéticos do desenvolvim…
Drosophila melanogaster, são amplamente utilizados como um organismo modelo no desenvolvimento e reprodução do estudo. O progresso da Drosophila através de várias etapas de desenvolvimento em um processo conhecido como ciclo de vida e cada etapa fornece uma plataforma única para pesquisa de desenvolvimento. Neste vídeo, apresentaremos os fundamentos do desenvolvimento e reprodução de Drosophila, incluindo como criar uma cruz genética e discutir como essa pesquisa pode ser aplicada para entender processos que vão desde a cicatrização de feridas até o comportamento.
Primeiro, vamos discutir o ciclo de vida de Drosophila. O progresso da drosophila através de 4 estágios principais de desenvolvimento: embrião, larva, pupa e adulto.
O embrião é um óvulo fertilizado que tem cerca de 0,5 mm de comprimento e forma oval. Imediatamente após a fertilização, o embrião sofre rápida divisão mitótica sem crescimento. O núcleo zigolítico sofre nove rodadas de divisão nuclear, mas não sofre citocinese, formando uma célula multi-nucleada chamada blastoderme sinintita. Como todos os núcleos do blastoderme sinintital compartilham um citoplasma comum, as proteínas podem difundir livremente, formando gradientes de morfógenos, que são importantes para estabelecer o plano corporal e padronização de órgãos e tecidos individuais na mosca. Após a 10ª divisão nuclear, os núcleos migram para a periferia do blastoderm sinintítial. Após a 13ª rodada de divisão nuclear, que ocorre aproximadamente 3 horas após a fertilização, os 6000 núcleos na blastodermia sinintítial tornam-se individualizados formando o blastoderm celular. O blastoderme celular contém uma monocamada de células e é transformado em uma complexa estrutura multicamadas, em um processo conhecido como gastrusão. Durante a gastruação, as alterações de forma celular impulsionam as invaginações da monocamada, criando, em última análise, as camadas de endoderme, mesoderme e germe ectoderme. O endoderme dá origem ao intestino, o mesoderme dá origem aos músculos e coração, e o ectoderme dá origem à epiderme e ao sistema nervoso central. Depois de 24 horas, embriões eclodem como larvas.
Larvas são brancas com corpos segmentados semelhantes a vermes. Eles rastejam em torno de comida molhada comendo constantemente, levando a um rápido crescimento. Larvas avançam em três estágios: o primeiro instar por 24 horas, o segundo instar por mais 24 horas e o terceiro instar por 48 horas. A fusão ocorre entre cada etapa. Quando prontas para a pupação, as terceiras larvas instar saem de sua fonte de alimento e se prendem a uma superfície firme, como o lado de um frasco.
Pupa são imóveis e são inicialmente macias e brancas, mas eventualmente endurecem e ficam marrons. Durante um período de quatro dias, tecidos larvais degeneram e tecidos adultos se formam. A eclosão marca o fim do estágio pupal e as moscas emergem como adultas.
8 horas após o encerramento, os adultos se tornam sexualmente receptivos e começam a acasalar, começando o ciclo de vida novamente.
O ciclo de vida completo leva cerca de 10 dias a 25 °C, mas pode ser afetado pela temperatura. Por exemplo, a 18 °C o ciclo de vida é de cerca de 19 dias e a 29 °C, o ciclo de vida é de apenas 7 dias.
Ao longo do desenvolvimento, a cuidadosa regulação genética da formação de padrões estabelece o plano corporal e especifica tecidos e órgãos individuais. É importante ressaltar que o estabelecimento do eixo anterior-posterior define a orientação cabeça a cauda do organismo, e é regulado por diversos grupos de genes.
Em primeiro lugar, os genes de efeito materno são fornecidos no oócito e herdados da fêmea. Eles são importantes no blastoderm siníntial para estabelecer inicialmente o anterior e posterior do embrião. Em particular, o gene bicoide define o anterior do embrião, incluindo a cabeça e o tórax, enquanto o gene nanos define o posterior, incluindo o abdômen.
Em segundo lugar, os genes de segmentação, que são regulados por genes de efeito materno, incluem os genes de lacuna e os genes de regras de pares. Genes de lacuna estabelecem um plano corporal segmentado ao longo do eixo anterior-posterior, subdividindo amplamente o embrião. Os genes de regras par são expressos em um padrão listrado perpendicular ao eixo anterior-posterior, dividindo ainda mais o embrião em segmentos menores. Em seguida, os genes de polaridade do segmento, como engrailed começam a estabelecer destinos celulares dentro de cada segmento.
Por fim, os genes homeóticos são responsáveis pela definição de estruturas anatômicas particulares, como asas e pernas. Curiosamente, a ordem dos genes no cromossomo reflete como eles são expressos ao longo do eixo anterior-posterior.
Drosophila são organismos extremamente férteis que podem produzir milhares de descendentes em toda a vida. As fêmeas depositam centenas de ovos por dia e continuam a fertilizar ovos bem depois que o acasalamento ocorreu.
Drosophila também são organismos sexualmente dimórficos, o que significa que as fêmeas são fenotipicamente distintas dos machos. Em particular, os machos são menores que as fêmeas e têm genitália externa de cor escura, bem como mais pigmento preto em seus abdômens inferiores. Os machos também têm um pedaço de cerdas em suas pernas dianteiras chamadas pentes sexuais usados para prender a fêmea durante a cópula. Essas diferenças fenotípicas distintas tornam muito fácil distinguir machos das fêmeas, o que é particularmente útil na criação de uma cruz genética.
Criar uma cruz com drosophila é uma técnica útil para estudar genética. Então vamos começar!
O primeiro passo para montar uma cruz é coletar fêmeas virgens do genótipo desejado, para que você possa controlar exatamente qual macho com quem ela acasalará. Drosophila não consegue acasalar durante as primeiras 8 horas após o encerramento, por isso coletar adultos muito jovens garante a virgindade. Para coletar fêmeas recém-fechadas, limpe o frasco para o necrotério para se livrar de todos os adultos. A cada 3-4 horas, verifique o frasco para adultos recém-eclosados, e colete as fêmeas em um novo frasco sem machos até estar pronto para uso. As fêmeas virgens são identificadas por sua cor corporal muito clara e uma mancha escura em seu abdômen, conhecido como mecônio.
Quando estiver pronto para começar a cruz, combine 4-6 machos com 4-6 fêmeas virgens de seus genótipos desejados em um frasco de comida datado, e armazene a 25° C e 60% de umidade. Após 3-4 dias, as larvas estarão presentes e os pais devem ser transferidos para um novo frasco, impedindo que os pais acasalem com a prole. Após aproximadamente 10 dias, novos descendentes surgirão e seus fenótipos podem ser examinados.
Uma ferramenta que os pesquisadores de Drosophila usam são cromossomos balanceador que previnem a recombinação genética e contêm marcadores genéticos como asas encaracoladas, que são úteis para determinar o genótipo correto de uma mosca. Se você queria moscas heterozidas para duas mutações diferentes, você pode cruzar um estoque com mutação #1 sobre o cromossomo balanceador CyO, para um segundo estoque com mutação #2 também equilibrado sobre CyO. Qualquer prole que emerge sem asas encaracoladas são heterozigous para ambas as mutações.
Outra ferramenta comumente usada na pesquisa de Drosophila é o sistema UAS-GAL4, que permite aos pesquisadores expressar ou derrubar um gene em um tecido específico. GAL4 é um fator de transcrição de levedura que é impulsionado por um promotor específico de tecido e uas é a sequência de ativação upstream, que controla a expressão do gene de interesse . Quando você cruza uma mosca com um transgene GAL4 específico de tecido para uma mosca com um transgene UAS com seu gene de interesse diretamente rio abaixo, a proteína GAL4 liga o UAS e impulsiona a expressão do seu gene desejado. Por exemplo, o UAS-GFP cruzou para apterous-GAL4, que é específico para os discos de asa em pupa, expressa GFP especificamente nessas células.
Existem muitas aplicações que podem ser usadas para estudar o desenvolvimento e a reprodução de Drosophila. Uma aplicação são análises comportamentais - especificamente comportamento de namoro. Durante o namoro, o macho se orienta em direção à fêmea e a segue enquanto a bate com suas pernas dianteiras. Se a fêmea é receptiva, ela permite que o macho a monte. O macho enrola seu abdômen e transfere fluido seminal para a fêmea, um processo conhecido como cópula. As análises desses comportamentos de namoro em vários mutantes dão uma visão do controle genético do comportamento
O desenvolvimento da drosophila é um processo extremamente dinâmico que inclui muitos movimentos celulares e mudanças de forma, que podem ser estudadas através de imagens ao vivo. Por exemplo, o fechamento dorsal durante a embriogênese é quando uma lacuna no epitélio é fechada de forma semelhante a um zíper envolvendo a coordenação de muitos tipos de células. O fechamento dorsal durante o desenvolvimento é frequentemente usado como modelo para estudar o fechamento de feridas, o que pode ter implicações clínicas.
Uma terceira aplicação usada para entender processos durante o desenvolvimento de Drosophila é a interferência de RNA, que derruba a atividade de genes individuais e pode ser usada em telas genéticas reversas em larga escala. Por exemplo, o dsRNA pode ser injetado em embriões, e o impacto da derrubada genética no desenvolvimento de órgãos, por exemplo, pode ser avaliado. Aqui, a interferência do RNA revelou um gene importante para a fusão durante o desenvolvimento traqueal.
Você acabou de assistir a introdução do JoVE à reprodução e desenvolvimento de Melanogaster de Drosophila. Neste vídeo revisamos: o ciclo de vida de Drosophila, incluindo detalhes sobre cada etapa de desenvolvimento. Também aprendemos a usar as capacidades reprodutivas do Drosophila para estudar genética e criar uma cruz. Finalmente, aprendemos como o desenvolvimento e a reprodução da Drosophila são úteis para a compreensão de processos complexos como comportamento, fechamento de feridas e desenvolvimento de órgãos.
Drosophila melanogaster, são amplamente utilizados como um organismo modelo no desenvolvimento e reprodução do estudo. O progresso da Drosophila através de várias etapas de desenvolvimento em um processo conhecido como ciclo de vida e cada etapa fornece uma plataforma única para pesquisa de desenvolvimento. Neste vídeo, apresentaremos os fundamentos do desenvolvimento e reprodução de Drosophila, incluindo como criar uma cruz genética e discutir como essa pesquisa pode ser aplicada para entender processos que vão desde a cicatrização de feridas até o comportamento.
Primeiro, vamos discutir o ciclo de vida de Drosophila. O progresso da drosophila através de 4 estágios principais de desenvolvimento: embrião, larva, pupa e adulto.
O embrião é um óvulo fertilizado que tem cerca de 0,5 mm de comprimento e forma oval. Imediatamente após a fertilização, o embrião sofre rápida divisão mitótica sem crescimento. O núcleo zigolítico sofre nove rodadas de divisão nuclear, mas não sofre citocinese, formando uma célula multi-nucleada chamada blastoderme sinintita. Como todos os núcleos do blastoderme sinintital compartilham um citoplasma comum, as proteínas podem difundir livremente, formando gradientes de morfógenos, que são importantes para estabelecer o plano corporal e padronização de órgãos e tecidos individuais na mosca. Após a 10ª divisão nuclear, os núcleos migram para a periferia do blastoderm sinintítial. Após a 13ª rodada de divisão nuclear, que ocorre aproximadamente 3 horas após a fertilização, os 6000 núcleos na blastodermia sinintítial tornam-se individualizados formando o blastoderm celular. O blastoderme celular contém uma monocamada de células e é transformado em uma complexa estrutura multicamadas, em um processo conhecido como gastrusão. Durante a gastruação, as alterações de forma celular impulsionam as invaginações da monocamada, criando, em última análise, as camadas de endoderme, mesoderme e germe ectoderme. O endoderme dá origem ao intestino, o mesoderme dá origem aos músculos e coração, e o ectoderme dá origem à epiderme e ao sistema nervoso central. Depois de 24 horas, embriões eclodem como larvas.
Larvas são brancas com corpos segmentados semelhantes a vermes. Eles rastejam em torno de comida molhada comendo constantemente, levando a um rápido crescimento. Larvas avançam em três estágios: o primeiro instar por 24 horas, o segundo instar por mais 24 horas e o terceiro instar por 48 horas. A fusão ocorre entre cada etapa. Quando prontas para a pupação, as terceiras larvas instar saem de sua fonte de alimento e se prendem a uma superfície firme, como o lado de um frasco.
Pupa são imóveis e são inicialmente macias e brancas, mas eventualmente endurecem e ficam marrons. Durante um período de quatro dias, tecidos larvais degeneram e tecidos adultos se formam. A eclosão marca o fim do estágio pupal e as moscas emergem como adultas.
8 horas após o encerramento, os adultos se tornam sexualmente receptivos e começam a acasalar, começando o ciclo de vida novamente.
O ciclo de vida completo leva cerca de 10 dias a 25 °C, mas pode ser afetado pela temperatura. Por exemplo, a 18 °C o ciclo de vida é de cerca de 19 dias e a 29 °C, o ciclo de vida é de apenas 7 dias.
Ao longo do desenvolvimento, a cuidadosa regulação genética da formação de padrões estabelece o plano corporal e especifica tecidos e órgãos individuais. É importante ressaltar que o estabelecimento do eixo anterior-posterior define a orientação cabeça a cauda do organismo, e é regulado por diversos grupos de genes.
Em primeiro lugar, os genes de efeito materno são fornecidos no oócito e herdados da fêmea. Eles são importantes no blastoderm siníntial para estabelecer inicialmente o anterior e posterior do embrião. Em particular, o gene bicoide define o anterior do embrião, incluindo a cabeça e o tórax, enquanto o gene nanos define o posterior, incluindo o abdômen.
Em segundo lugar, os genes de segmentação, que são regulados por genes de efeito materno, incluem os genes de lacuna e os genes de regras de pares. Genes de lacuna estabelecem um plano corporal segmentado ao longo do eixo anterior-posterior, subdividindo amplamente o embrião. Os genes de regras par são expressos em um padrão listrado perpendicular ao eixo anterior-posterior, dividindo ainda mais o embrião em segmentos menores. Em seguida, os genes de polaridade do segmento, como engrailed começam a estabelecer destinos celulares dentro de cada segmento.
Por fim, os genes homeóticos são responsáveis pela definição de estruturas anatômicas particulares, como asas e pernas. Curiosamente, a ordem dos genes no cromossomo reflete como eles são expressos ao longo do eixo anterior-posterior.
Drosophila são organismos extremamente férteis que podem produzir milhares de descendentes em toda a vida. As fêmeas depositam centenas de ovos por dia e continuam a fertilizar ovos bem depois que o acasalamento ocorreu.
Drosophila também são organismos sexualmente dimórficos, o que significa que as fêmeas são fenotipicamente distintas dos machos. Em particular, os machos são menores que as fêmeas e têm genitália externa de cor escura, bem como mais pigmento preto em seus abdômens inferiores. Os machos também têm um pedaço de cerdas em suas pernas dianteiras chamadas pentes sexuais usados para prender a fêmea durante a cópula. Essas diferenças fenotípicas distintas tornam muito fácil distinguir machos das fêmeas, o que é particularmente útil na criação de uma cruz genética.
Criar uma cruz com drosophila é uma técnica útil para estudar genética. Então vamos começar!
O primeiro passo para montar uma cruz é coletar fêmeas virgens do genótipo desejado, para que você possa controlar exatamente qual macho com quem ela acasalará. Drosophila não consegue acasalar durante as primeiras 8 horas após o encerramento, por isso coletar adultos muito jovens garante a virgindade. Para coletar fêmeas recém-fechadas, limpe o frasco para o necrotério para se livrar de todos os adultos. A cada 3-4 horas, verifique o frasco para adultos recém-eclosados, e colete as fêmeas em um novo frasco sem machos até estar pronto para uso. As fêmeas virgens são identificadas por sua cor corporal muito clara e uma mancha escura em seu abdômen, conhecido como mecônio.
Quando estiver pronto para começar a cruz, combine 4-6 machos com 4-6 fêmeas virgens de seus genótipos desejados em um frasco de comida datado, e armazene a 25° C e 60% de umidade. Após 3-4 dias, as larvas estarão presentes e os pais devem ser transferidos para um novo frasco, impedindo que os pais acasalem com a prole. Após aproximadamente 10 dias, novos descendentes surgirão e seus fenótipos podem ser examinados.
Uma ferramenta que os pesquisadores de Drosophila usam são cromossomos balanceador que previnem a recombinação genética e contêm marcadores genéticos como asas encaracoladas, que são úteis para determinar o genótipo correto de uma mosca. Se você queria moscas heterozidas para duas mutações diferentes, você pode cruzar um estoque com mutação #1 sobre o cromossomo balanceador CyO, para um segundo estoque com mutação #2 também equilibrado sobre CyO. Qualquer prole que emerge sem asas encaracoladas são heterozigous para ambas as mutações.
Outra ferramenta comumente usada na pesquisa de Drosophila é o sistema UAS-GAL4, que permite aos pesquisadores expressar ou derrubar um gene em um tecido específico. GAL4 é um fator de transcrição de levedura que é impulsionado por um promotor específico de tecido e uas é a sequência de ativação upstream, que controla a expressão do gene de interesse . Quando você cruza uma mosca com um transgene GAL4 específico de tecido para uma mosca com um transgene UAS com seu gene de interesse diretamente rio abaixo, a proteína GAL4 liga o UAS e impulsiona a expressão do seu gene desejado. Por exemplo, o UAS-GFP cruzou para apterous-GAL4, que é específico para os discos de asa em pupa, expressa GFP especificamente nessas células.
Existem muitas aplicações que podem ser usadas para estudar o desenvolvimento e a reprodução de Drosophila. Uma aplicação são análises comportamentais - especificamente comportamento de namoro. Durante o namoro, o macho se orienta em direção à fêmea e a segue enquanto a bate com suas pernas dianteiras. Se a fêmea é receptiva, ela permite que o macho a monte. O macho enrola seu abdômen e transfere fluido seminal para a fêmea, um processo conhecido como cópula. As análises desses comportamentos de namoro em vários mutantes dão uma visão do controle genético do comportamento
O desenvolvimento da drosophila é um processo extremamente dinâmico que inclui muitos movimentos celulares e mudanças de forma, que podem ser estudadas através de imagens ao vivo. Por exemplo, o fechamento dorsal durante a embriogênese é quando uma lacuna no epitélio é fechada de forma semelhante a um zíper envolvendo a coordenação de muitos tipos de células. O fechamento dorsal durante o desenvolvimento é frequentemente usado como modelo para estudar o fechamento de feridas, o que pode ter implicações clínicas.
Uma terceira aplicação usada para entender processos durante o desenvolvimento de Drosophila é a interferência de RNA, que derruba a atividade de genes individuais e pode ser usada em telas genéticas reversas em larga escala. Por exemplo, o dsRNA pode ser injetado em embriões, e o impacto da derrubada genética no desenvolvimento de órgãos, por exemplo, pode ser avaliado. Aqui, a interferência do RNA revelou um gene importante para a fusão durante o desenvolvimento traqueal.
Você acabou de assistir a introdução do JoVE à reprodução e desenvolvimento de Melanogaster de Drosophila. Neste vídeo revisamos: o ciclo de vida de Drosophila, incluindo detalhes sobre cada etapa de desenvolvimento. Também aprendemos a usar as capacidades reprodutivas do Drosophila para estudar genética e criar uma cruz. Finalmente, aprendemos como o desenvolvimento e a reprodução da Drosophila são úteis para a compreensão de processos complexos como comportamento, fechamento de feridas e desenvolvimento de órgãos.
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Q1: What are the four main stages of the Drosophila life cycle?
Drosophila progress through four developmental stages: embryo, larva, pupa, and adult. The embryo is a fertilized egg about 0.5 mm long that undergoes rapid nuclear division. Larvae are white, worm-like segmented organisms that eat constantly and progress through three instars over about 96 hours. Pupae are immobile stages where larval tissues degenerate and adult tissues form over four days. Adults emerge through eclosion and become sexually receptive within 8 hours.
Q2: How does the syncytial blastoderm contribute to Drosophila body patterning?
The syncytial blastoderm forms when nine rounds of nuclear division occur without cytokinesis, creating a multi-nucleate cell where all nuclei share common cytoplasm. This shared cytoplasm allows proteins to diffuse freely, forming morphogen gradients essential for establishing the body plan and patterning individual organs and tissues. After the 13th nuclear division, nuclei individualize into the cellular blastoderm, which then undergoes gastrulation to form the three primary germ layers.
Q3: What roles do maternal effect genes and segmentation genes play in anterior-posterior axis formation?
Maternal effect genes, supplied in the oocyte, initially establish the anterior and posterior regions of the embryo. The bicoid gene defines the anterior including the head and thorax, while the nanos gene defines the posterior including the abdomen. Segmentation genes, regulated by maternal effect genes, include gap genes that broadly subdivide the embryo and pair rule genes expressed in striped patterns that further divide it into smaller segments.
Q4: How do you collect virgin female Drosophila for setting up a genetic cross?
Drosophila cannot mate during the first 8 hours after eclosion, so collecting newly eclosed adults guarantees virginity. Clear the vial of all adults, then check every 3-4 hours for newly eclosed flies and collect females in a new vial without males. Virgin females are identified by their light body color and a dark spot on their abdomen called the meconium. Combine 4-6 males with 4-6 virgin females of desired genotypes in a dated food vial at 25°C.
Q5: What is the UAS-GAL4 system and how does it enable tissue-specific gene expression?
The UAS-GAL4 system allows researchers to express or knockdown genes in specific tissues. GAL4 is a yeast transcription factor driven by a tissue-specific promoter, while UAS is the Upstream Activating sequence controlling the gene of interest. When crossing a fly with tissue-specific GAL4 to one with a UAS transgene, GAL4 protein binds UAS and drives expression of the desired gene. For example, UAS-GFP crossed to apterous-GAL4 expresses GFP specifically in wing disc cells.
Q6: How can dorsal closure during Drosophila development inform wound healing research?
Dorsal closure is a dynamic developmental process where a gap in the epithelium closes in a zipper-like manner involving coordination of many cell types. This process involves numerous cell movements and shape changes that can be studied through live imaging. Dorsal closure during embryogenesis serves as a model system to study wound closure mechanisms, which has potential clinical implications for understanding and treating wound healing in higher organisms.
Q7: What makes Drosophila an ideal model organism for studying development?
Drosophila melanogaster is valuable because the molecular, cellular, and genetic foundations of development are highly conserved between flies and higher eukaryotes such as humans. The complete life cycle takes only about 10 days at 25°C, and Drosophila are extremely fertile, producing thousands of progeny in a lifetime. These characteristics, combined with the ability to use techniques like RNA interference and live imaging, make Drosophila an excellent platform for developmental research applicable to understanding processes in other organisms.
Chapters in this video
0:00
Overview
0:49
The Drosophila Life Cycle
4:23
Genetic Regulation of Pattern Formation
6:14
Drosophila Reproduction
7:11
How to Set Up a Genetic Cross
10:22
Applications
12:08
Summary
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