Fluxo de trabalho livre de manchas V3 para um controle prático, conveniente e confiável de carregamento total de proteínas em blotting ocidental

O BioRad V three Workflow fornece aos pesquisadores quantificação mais confiável e confiança no processo de Western blotting. Isso é feito primeiro usando géis livres de manchas TGX para separar e visualizar amostras de proteínas. Após a separação, as proteínas são transferidas para uma membrana usando o sistema de transferência rápida blot turbo, que permite a verificação da qualidade e eficiência da transferência.

Após a verificação da transferência, a membrana é bloqueada e sondada com anticorpos primários e secundários para as proteínas-alvo. Finalmente, os níveis de proteína-alvo são normalizados usando a medição de proteína total sem manchas como controle de carga. O fluxo de trabalho V três traz conveniência e transparência ao processo de western blotting, proporcionando aos pesquisadores confiança em todas as etapas, desde a separação até a transferência e quantificação.

A principal vantagem do fluxo de trabalho V three Western sobre o Western blotting tradicional é que a tecnologia sem manchas oferece um controle prático, conveniente e confiável da carga total de proteínas para normalizar os sinais da proteína-alvo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave relacionadas à confiabilidade das metodologias de controle de carga para a técnica de Western blotting que envolvem a supersaturação dos sinais de proteínas de manutenção e os níveis de expressão diferencial de proteínas de manutenção sob condições experimentais variadas. Descobrimos que as proteínas ativadas em géis sem coloração também podem ser visualizadas em blos sem coloração adicional, permitindo que sejam usadas como uma alternativa às colorações convencionais de proteínas totais, bem como controles de carga de proteínas de manutenção.

Nos próximos minutos, demonstraremos o fluxo de trabalho completo do V três usando fluorescência multiplex. O mesmo procedimento também pode ser usado para quimioluminescência após a preparação de amostras de proteínas de acordo com o protocolo de texto. Usando um gel pré-moldado de criterion TGX sem manchas de qualquer gel pré-moldado KD, remova o pente e a fita da parte inferior do.

Coloque o no aparelho de gel e encha ambos os reservatórios com tampões de corrida. Carregue os padrões de proteína e amostras. Em seguida, execute o gel por 20 minutos a 300 volts.

Após a conclusão da eletroforese, use a ferramenta de abertura de de gel na tampa da Criterion Cell para abrir o. Em seguida, aplique alguns mililitros de água no transiluminador UV do gerador de imagens Chemi Dock MP. Levante cuidadosamente o gel do e coloque-o no software UV Trans Illuminator Launch Image Lab e configure um novo protocolo de canal único para géis sem manchas usando o tempo de ativação de gel padrão de um minuto, selecione o tipo de gel apropriado e a otimização automática padrão para bandas intensas.

Em seguida, clique em executar protocolo. Quando a captura da imagem estiver concluída, visualize a separação e a qualidade da amostra. Em seguida, prossiga imediatamente para a etapa de transferência.

Para realizar a transferência de proteínas, abra um pacote de transferência trans block turbo MIDI PVDF. Coloque a pilha inferior no centro da base do. Remova o gel do gerador de imagens.

Alinhe o gel na parte superior da membrana. Use suavemente o rolo de borrão para remover bolhas de ar entre o gel e a membrana. Em seguida, alinhe a pilha superior na parte superior do gel.

Depois de remover quaisquer bolhas de ar, coloque a tampa do na base. Pressione a tampa para baixo com firmeza, gire o botão no sentido horário para travar e insira o em um dos dois compartimentos do mata-borrão. Na tela inicial, selecione o protocolo turbo.

Escolha os dois mini ou um mini gel e pressione o botão de execução para o compartimento apropriado. A transferência será concluída em sete minutos. Remova o do compartimento.

Desbloqueie o e desmonte o sanduíche mata-borrão. Coloque o gel pós-transferência no transiluminador UV do gerador de imagens Chemi dock MP e coloque imediatamente a membrana em água deionizada. Configure um novo protocolo de canal único para géis sem manchas sem tempo de ativação.

Selecione o tipo de gel apropriado e defina manualmente o tempo de exposição para o gel de pré-transferência e clique em executar protocolo. Assim que a captura de imagem estiver concluída. Verifique a eficiência da transferência comparando as intensidades da banda de amostra entre os géis pré e pós-transferência.

Remova o gel da bandeja de amostras, pois não é mais necessário e descarte. Para verificar, transfira para o borrão. Coloque a membrana na bandeja de amostra e configure um novo protocolo de canal único.

Para manchas sem manchas. Selecione o tipo de gel apropriado e a otimização automática padrão para bandas intensas. Em seguida, clique em executar protocolo.

Quando a captura da imagem estiver concluída, verifique a transferência para a membrana. Remova a membrana de blot do iluminador UV trans e coloque-a em um tampão de bloqueio para western blotting. Depois de incubar a membrana à temperatura ambiente por uma hora, incube-a com anticorpos primários de camundongos e coelhos durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte.

Despeje a solução de anticorpos e use 50 mililitros de TBST para lavar a mancha por cinco minutos. Incube a mancha com anticorpos secundários conjugados fluorescentes, antimusa e anticoelho por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, use TBST para lavar a mancha cinco vezes por cinco minutos cada.

Para obter a imagem do borrão, coloque-o no iluminador UV trans do gerador de imagens Chemi doc MP no software de laboratório de imagens. Configure um novo protocolo multicanal. Configure o canal um selecionando dite six 50 em aplicativos de blot e use a otimização automática padrão para bandas intensas.

Repita essas etapas para configurar os canais dois e três para DITE 5 49 e mancha sem manchas, respectivamente. Selecione o tipo de gel apropriado e clique em executar protocolo. Para definir as raias, selecione a faixa e as faixas da imagem de mancha sem manchas.

Em seguida, localizador automático de faixa para quantificação precisa. Certifique-se de que os perfis de fundo em cada pista de amostra sejam semelhantes, ajustando o tamanho do disco rolante para 70. Confirme a uniformidade do fundo examinando todos os perfis de pista para definir bandas nos canais dite six 50 e 5 49.

Use a ferramenta de localização de banda para detectar bandas usando as configurações de sensibilidade padrão. Para designar o canal de normalização, retorne à caixa de ferramentas de análise. Clique em normalização e escolha mancha sem manchas, garantindo que a proteína total da pista seja selecionada.

Para atribuir as pistas padrão de peso molecular à caixa de ferramentas de análise, clique em Ferramentas de análise MW e marque a caixa na pista apropriada. Por fim, para exibir as intensidades normalizadas da banda de proteína, clique na tabela de análise na barra de ferramentas. O software gerará automaticamente uma tabela que contém intensidades de volume, fatores de normalização e volumes normalizados.

Os volumes normalizados devem ser usados para análise de dados e relatórios. A tabela pode ser exportada. Para uma análise mais aprofundada, demonstramos o fluxo de trabalho completo de V três Western blotting.

Agora mostraremos resultados representativos de um experimento real. Os lisados de culturas de células de linfoblastos controle e irradiados foram analisados usando o fluxo de trabalho V three Western blot. O sinal de proteína total sem manchas aparece em azul.

A proteína-alvo M CM seven é mostrada em vermelho, e o controle de carga de proteína de manutenção validado GA DH é mostrado em verde. O GA DH foi validado como um controle de carga adequado, avaliando sua linearidade usando as condições experimentais descritas neste vídeo. Os sinais de proteína total sem manchas para cada faixa na mancha foram medidos usando um software de laboratório de imagem.

MCM sete intensidades de sinal foram normalizadas usando os sinais de proteína total e GA DH. Os sete volumes de banda de proteína MCM normalizados por ambos os métodos revelaram níveis de expressão 25% reduzidos nas amostras irradiadas em relação às amostras de controle antes da normalização precisa. A proteína de manutenção requer validação confirmando sua faixa linear e níveis de expressão consistentes entre as amostras sem validação.

Os controles de carga de proteínas de manutenção não garantem uma normalização precisa. Por outro lado, a normalização total da proteína não requer validação. Assim, o sinal de proteína total sem manchas obtido pelo fluxo de trabalho V três oferece um controle de carga prático, conveniente e mais confiável ao tentar este procedimento.

Lembre-se de que a tecnologia sem manchas permite a visualização fluorescente de amostras de proteínas por meio de uma modificação covalente induzida por UV dos resíduos de triptofano disponíveis. Somente em casos raros essa modificação afetará significativamente as aplicações downstream, como imunodetecção ou espectrometria de massa. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar o fluxo de trabalho V três Western e a normalização da proteína total sem manchas.

Embora tenhamos demonstrado esse fluxo de trabalho para Western blotting fluorescente multiplex, a tecnologia sem manchas também pode ser usada para normalização total de proteínas com Western blots luminescentes.