Name: A Guide to Modern quantitativa fluorescente Western Blotting com estratégias de resolução de problemas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-20T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Aprenda a realizar Western blotting fluorescente quantitativo para análise de proteínas em amostras biológicas complexas. Este método oferece maior sensibilidade e precisão na detecção de proteínas solúveis e de membrana.

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Gostaríamos de agradecer a seguinte para o apoio financeiro: Instituto BBSRC Financiamento Programa Estratégico - CF &amp; TMW; Financiamento BBSRC Leste Bio DTP - LG; O Darwin Trust of Edinburgh - MLH. Gostaríamos também de agradecer o Dr. Barry McColl permissão para incluir a otimização TREM2 neste manuscrito.

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Os autores não têm nada a divulgar.

Consideração e planejamento Devido é essencial antes de qualquer experiência e pode, finalmente, determinar o sucesso da técnica utilizada. Os avanços na detecção de proteínas utilizando WB pode apresentar uma infinidade de potenciais obstáculos ao tentar escolher os anticorpos, métodos de transferência e visualização apropriado para uso. Felizmente, usando uma lista de verificação cuidadosa e medidas de controlo adequadas QFWB pode ser usado rotineiramente para determinar a presença de proteínas e diferenças de expressão cada vez mais sutis entre amostras. Este protocolo fornece um guia completo para transferência western quantitativa fluorescente, bem como algumas estratégias de resolução de problemas para evitar e / ou superar algumas das muitas armadilhas comuns associados. As etapas críticas empregadas para manter a sensibilidade e obter medições verdadeiramente quantificáveis ​​e comparáveis ​​incluem: 1) a extração de proteínas a partir de amostras de tecido robusto; 2) a preparação da amostra; 3) loadin proteína precisasg determinada por análise das proteínas totais; 4) transferência óptima de proteínas, utilizando I-Blot; 5) a preparação de anticorpos primários e secundários em tampão contendo 0,1% de Tween 20 de bloqueio, e 6) correcta visualização e de análise utilizando um gerador de imagens de infravermelhos e software associado. Detecção fluorescente no infravermelho é verdadeiramente quantitativa e proporciona maior sensibilidade em comparação com técnicas de detecção mais tradicionais ECL 3,11. Este sistema de detecção é multi facetada, e como tal não está limitado a QFWB. Este sistema é capaz de imagens de rotulagem imuno em baixa potência, permitindo a visualização e quantificação de seções inteiras de tecidos 12. Esta é uma área de desenvolvimento potencial futuro em termos de resolução, que podia ver imagens muito vermelho rivalizando com captura de imunofluorescência convencional com microscópios convencionais em termos de avaliação quantitativa. No entanto, com maior sensibilidade a mudanças sutis na protein expressão é fundamental para garantir a variabilidade é mantido a uma série de medidas mínimas e controle são rigorosos com os protocolos robustos. Isto começa com a extracção de proteínas rigorosa a partir da amostra de tecido seguido de produção de proteína total géis corados para proporcionar uma garantia de que o carregamento da amostra é uniforme, a optimização de anticorpos primários e secundários, a fim de determinar se a detecção é real e testando as orientações do fabricante no que diz respeito à transferência vezes para se obter a proteína de transferência eficiente. No entanto, mesmo quando são otimizadas condições para a WB, pode ainda problemas associados à execução westerns que podem não ter sido totalmente exploradas aqui. Estas incluem, mas não estão limitados a factores incluindo a solubilização e escolha de tampão de extracção de proteína. Alguns buffers possam interferir com os ensaios de concentração de proteína, e alguns tecidos são particularmente difíceis de solubilizar, exigindo técnicas mais robustos, tais como o uso de macera automatizadoting selados recipientes, como tubos M, juntamente com um Dissociator Macs. Além disso, medidas de controlo simples, para o armazenamento de material extraído e não extraído à temperatura de -80 ° C pode ser a diferença entre a obtenção de rotulagem óptimo imediatamente depois da extracção e tendo resultados pobres semanas mais tarde. Métodos QFWB modernos são provou ser mais sensível para captar sutis diferenças na expressão de proteínas e são mais versáteis permitindo dupla marcação simultânea 3 quando comparado às técnicas mais antigas, como ECL. É vital que os protocolos de transferência Western são robustos e facilmente reproduzíveis para a quantificação exata e análise estatística. Este protocolo é sensível e robusto o suficiente para ser usado rotineiramente para a detecção de proteínas através de uma variedade de amostras de tecido diferentes espécies e 3 e permite a quantificação de proteínas de baixa e alta abundância no interior da mesma QFWB, por conseguinte, reduzindo o uso de consumíveis, bem como o tempo por um experimento. 1 Além disso, o aumento da sensibilidade desta técnica permite a validação de cada vez mais popular - estudos econó- 9,14 porém a precisão é crucial e inclusão de medidas de controlo adequadas devem ser respeitados evitando assim a aquisição de dados errôneos.

Transferência de Western (WB) é uma técnica analítica desenvolvida originalmente na década de 1970 para determinar a presença ou ausência de uma proteína de interesse numa amostra biológica complexa, tal como um homogeneizado de tecido 1. Normalmente referido como o de imunomarcação de proteínas, devido à interacção anticorpo-antigénio chave, a metodologia consiste em 5 etapas distintas: 1) a separação electroforética das proteínas por seu ponto isoeléctrico; 2) a transferência para uma membrana de nitrocelulose ou de difluoreto de polivinilideno (PVDF) da membrana; 3) marcação usando um anticorpo primário específico para a proteína de interesse; 4) a incubação com um anticorpo secundário dirigido contra o anticorpo primário; e 5) de visualização. Metodologia Visualization evoluiu com o tempo para melhorar a segurança e sensibilidade. Alguns dos primeiros PEP foram realizadas utilizando rádio etiquetas marcadas que depois progrediram para colorimétrico e, em seguida, os mais amplamente utilizados quimioluminescência (ECL) métodos. Radioactivity foi marcado directamente para sondas para antigénios específicos enquanto que as metodologias colorimétricos e de ECL utilizar uma técnica de marcação indirecta com um repórter enzima, tal como fosfatase alcalina ou peroxidase de estreptavidina de rábano (HRP) 2. A intensidade de etiquetagem do produto cromagénio ou luminescente é medido por densitometria em que a intensidade do sinal, forte ou fraco, mais ou menos indica a presença da proteína de interesse na amostra. ECL é a metodologia mais sensível e, portanto, favorecido 2, mas todos os três métodos foram desenvolvidos inicialmente em filme de raios-x com técnicas de imagem digital mais sofisticadas posteriormente estabelecidas três. O avanço da imagem digital de WB não só é permitido um investigador para determinar a presença ou ausência da sua proteína de interesse, mas também permitiu uma inferência com o nível de expressão de uma proteína seleccionada, quando comparada com outras amostras e, portanto, pode ser referido como &quot;semi-quantitativa &amp; #8221 ;. Recentemente, uma tecnologia verdadeiramente quantitativo e mais sensível western blotting foi desenvolvida através do qual o nível de fluorescência medido está directamente relacionado com a quantidade e expressão de uma única proteína dentro de uma amostra: quantitativo fluorescente western blot (QFWB). Quando se compara com QFWB rotulagem de ECL, a utilização de um anticorpo secundário fluorescente gera um perfil linear de detecção 4. Isto está em contraste com as técnicas de ECL em que a linearidade do sinal geralmente ocorre com baixas cargas de proteínas inferiores a 5 pg e saturação de sinal directamente relacionadas com a expressão da proteína, ou seja, com ubiquamente expressos genes housekeeping 5,6. Esta disparidade é provavelmente causada por um maior número de locais de ligação disponíveis para um substrato de ECL avidina para se ligar a um secundário biotinilado, resultando em uma maior probabilidade de saturação de sinal potencial. Esta é uma das principais razões para a base de ECL immunoblotting sendo referido como only &quot;semi-quantitativa&quot; 7. O ponto de saturação de sinal é de importância crítica ao medir diferenças sutis nos níveis de expressão e pode levar a medições imprecisas. Nos últimos anos, o advento das técnicas de proteómica generalizados detalhando cada vez maior sensibilidade e identificação das diferenças subtis de expressão resultou em uma dependência crescente em western blotting verdadeiramente quantitativo para experiências de validação 8,9. A aplicação da metodologia sensível, robusto e verdadeiramente quantitativa é, portanto, crucial. Muitas metodologias de Western blotting &quot;otimizados&quot; têm sido utilizados por laboratórios independentes, que frequentemente provam difícil de configurar ou replicar devido a ajustes metodológicos sutis que podem não ser aparente em protocolos documentados formais. Este é um protocolo estabelecido e robusto para QFWB e, adicionalmente, fornece valiosas estratégias para solução de problemas comuns that podem surgir durante a implementação. Este protocolo foi originalmente otimizado para uso com homogeneizados de cérebro murino, mas desde então tem sido utilizada de forma eficaz em uma ampla gama de amostras de tecidos e espécies 4,9,10. Variações de protocolo potenciais necessários para a solução de problemas específicos estão incluídos.

<table><tbody><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Fisher Scientific UK Ltd</td><td>10230544</td><td></td></tr><tr><td>M Tubos</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Pilha de Transferência iBlot, PVDF Regular</td><td>Life Technologies, Reino Unido</td><td>IB401001</td><td></td></tr><tr><td>MagicMark XP Western Protein Standard (20-220 kDa)</td><td>Life Technologies, UK</td><td>LC5602</td><td>Use em gel 1 para Western blotting</td></tr><tr><td>SeeBlue Pre-stained protein standard</td><td>Life Technologies, UK</td><td>LC5625&nbsp;</td><td>Uso no gel 2 Gel corado com proteína total</td></tr><tr><td>NuPAge LDS Sample buffer 4x</td><td>Life Technologies, UK</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer (apenas para Bis-Tris Gels) (20x)</td><td>Life Technologies, UK</td><td>NP0002</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1,0 mm, 12 poços</td><td>Life Technologies, UK</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>Comprimido de solução salina tamponada com fosfato</td><td>Sigma-Aldrich, UK</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA, Kit de Ensaio de Proteína</td><td>Fisher Scientific UK Ltd</td><td>10249133</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey tampão de bloqueio</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>P/N 927-40000</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD IgG anti-coelho de cabra (H+L), 0,5 mg</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-68071</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD IgG anti-rato de burro (H+L), 0,5 mg&nbsp;</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-68072</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW IgG anti-coelho de cabra (H + L), 0,5 mg</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-32211</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW IgG anti-cabra de burro (H + L), 0,5 mg</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-32214</td><td></td></tr><tr><td>ODYSSEY CL Infravermelho</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td></td><td>Pedir cotação</td></tr><tr><td>iBlot 7-Minute Blotting System</td><td>Life technologies, Reino Unido</td><td></td><td>Este modelo não está mais em produção</td></tr><tr><td>InstantBlue Protein stain</td><td>Expedeon, UK</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>Revitablot western blot stripping buffer&nbsp;</td><td>Rockland Imunoquímicos Inc.</td><td>MB-085-0050</td><td></td></tr></tbody></table>

a guide to modern quantitativa fluorescente western blotting com estratégias de resolução de problemas

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

O final da década de 1970 viu o primeiro relato do uso público do western blot, uma técnica para avaliar a presença e abundância relativa de proteínas específicas dentro de amostras biológicas complexas. Desde então, a metodologia blotting ocidental tornou-se um componente comum da biólogos moleculares repertório experimental. Uma pesquisa superficial da PubMed usando o termo &quot;western blot&quot; sugere que, em excesso de 220.000 manuscritos publicados têm feito uso desta técnica até o ano de 2014. É importante ressaltar que nos últimos dez anos temos visto avanços técnicos de imagem, juntamente com o desenvolvimento marcadores fluorescentes de sensíveis que melhoraram a sensibilidade e renderam ainda maiores gamas de detecção linear. O resultado é uma fluorescência agora verdadeiramente quantificáveis, com base Western Blot (QFWB) que permite que os biólogos para realizar análise de expressão comparativa com maior sensibilidade e precisão do que nunca. Muitos western blotting &quot;otimizado&quot;existem metodologias e são utilizados em diferentes laboratórios. Estes, muitas vezes revelar-se difícil de implementar devido à exigência de alterações processuais sutis, mas sem documentos. Este protocolo fornece uma descrição detalhada de um método QFWB estabelecida e robusta, com estratégias de resolução de problemas.

Como a sensibilidade QFWB ea faixa linear de detecção é maior do que a detecção ECL convencional, há uma série de medidas de controle que são cruciais para garantir que os dados precisos são coletadas, auxiliando, assim, a interpretação eficaz. Em primeiro lugar, a inclusão de amostras de controlo positivo, como mostrado na Figura 1. Em segundo lugar, a optimização da transferência para garantir a circulação equivalente de proteínas de alto e baixo peso molecular a partir do gel para a membrana como exibido na Figura 2. Em terceiro lugar, a optimização de anticorpos, especialmente secundário anticorpos cuja otimização é muitas vezes esquecido, mas que pode produzir não-específico de bandas capazes de interferir com a interpretação correta de proteína (s) de interesse. Ver Figura 3. Em quarto lugar, pode também ser o caso quando uma proteína que aparece indetectável mas espera-se estar presente, este também pode ser um problema de anticorpo secundário, que pode ser corrigido simplesmente usando um rais secundáriased em uma série de espécies diferentes. Ver Figura 4. Em quinto lugar, a rotulagem de proteína total e análise é um método muito mais robusta e quantificáveis, em comparação com a utilização de proteína única tradicional (s) que são ubiquamente expresso para os padrões internos de referência 3. Muitas destas proteínas individuais foram encontrados para ser diferencialmente expressos em modelos de doenças neurodegenerativas, bem como entre diferentes amostras de tecido e a uniformidade de expressão pode alterar dentro do mesmo tecido 3. Por conseguinte, a produção de um gel de controlo de carga irá confirmar a uniformidade da carga de amostra, quando combinada com uma análise de proteína total por comparação e quantificação da carga de proteína em cada pista em várias gamas de pesos moleculares medidos contra cada amostra para indicar o erro padrão como demonstrado na Figura 6 . É importante ressaltar que todas essas técnicas e controles de resolução de problemas são apenas tão eficazes quanto a sensibilidade e coerência da análise tools aplicadas pelo operador (Figura 5). Finalmente esta técnica presta-se a extracção e re-sondagem das membranas com mais flexibilidade do que a ECL devido a factores incluindo, mas não limitado a sensibilidade aumentada, reduzida fundo, detecção dupla de cor e a estabilidade da membrana em condições de armazenagem a longo prazo. Veja a Figura 7.

O avanço do western blotting usando fluorescência permitiu a detecção de mudanças sutis na expressão de proteínas, permitindo análises quantitativas. Aqui descrevemos uma metodologia robusta para detecção de uma variedade de proteínas em uma variedade de espécies e tipos de tecido. Uma estratégia para superar problemas técnicos comuns também é fornecida.

A Guide to Modern quantitativa fluorescente Western Blotting com estratégias de resolução de problemas

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

O objetivo deste procedimento é detectar e quantificar com precisão a abundância relativa de proteínas específicas dentro de uma amostra biológica complexa usando torção e blotting quantitativos e fluorescentes. Isso é feito pela primeira eletrofluorescência separando extratos de proteínas usando um gel de gradiente pré-moldado. Na segunda etapa, a carga de proteína equivalente é verificada em todas as pistas de amostra por meio da aplicação de uma coloração de proteína total e, em seguida, o sistema de transferência rápida semi-seco do bloqueio ocular é usado para transferir as amostras para a membrana APVDF.Finalmente, as proteínas são sondadas com anticorpos primários específicos, seguidos pelo anticorpo secundário marcado com fluorescência apropriado para facilitar sua detecção sensível, robusta e linear em comprimentos de onda infravermelhos e vermelhos distantes. Em última análise, o florescimento ocidental fluorescente quantitativo pode ser usado para detectar, visualizar e quantificar com precisão um grande número de proteínas solúveis e ligadas à membrana em uma ampla gama de amostras de tecido. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a imagem baseada em ECL, é que ela permite uma maior sensibilidade com maior precisão em uma ampla escala linear para uma leitura verdadeiramente quantitativa Comece macerando manualmente a amostra de tecido, seguida de homogeneização em tampão de extração recém-preparado em aproximadamente um a 10 pesos de tecido por volume de tampão até que um homogeneizado consistente e liso seja produzido.Em seguida, centrifugue o lisado celular por 20 minutos a 20.000 vezes G a quatro graus Celsius. Em seguida, transfira o sato contendo as proteínas solubibilizadas para um tubo de microcentrífuga limpo e armazene as frações do pellet e do sobrenadante S a 80 graus Celsius negativos até que seja necessário. Depois de determinar a concentração proteica do supinato, transferir 15 microgramas de proteína por amostra para novos tubos de microcentrífuga.Em seguida, traga o volume final de cada amostra para 10 microlitros com água destilada e adicione cinco microlitros de buffer de carregamento Forex. Agite completamente as soluções celulares por vórtice e, em seguida, aqueça as amostras a 98 graus Celsius por dois minutos para desnaturar as proteínas. Após a desnaturação, adicione três microlitros de um padrão de peso molecular apropriado no primeiro poço de cada um dos géis experimentais e de controle de carga.Depois disso, carregue 10 microlitros de cada amostra nos poços subsequentes apropriados após a eletroforese. Use uma faca de gel para liberar os géis do e remova os poços e o pé do gel. Marque o gel para ajudar na orientação posterior.Em seguida, para determinar a carga de proteína equivalente, decantar aproximadamente 30 mililitros de mancha de proteína em uma placa de Petri quadrada de 12 por 12 centímetros e colocar o gel de controle de carga na mancha, garantindo que a solução cubra todo o gel. Agite suavemente o gel por no mínimo uma hora em temperatura ambiente e, em seguida, descarte a mancha de proteína e lave o gel três vezes em água destilada antes da visualização do bloqueio ocular. Transferência rápida de proteínas duas semi-secas Após a eletroforese, prepare a pilha de transferência inferior removendo a tampa da folha e pré-umedecendo a membrana com tampão de corrida diretamente do tanque de gel.Umedeça novamente o papel de filtro com água destilada também neste momento. Em seguida, amarre o gel experimental na pilha de transferência inferior preparada e, em seguida, coloque o papel de filtro pré-trabalho sobre o gel e enrole os dois para garantir que nenhuma bolha fique presa entre as camadas. Coloque a pilha superior em cima do papel de filtro e da pilha inferior.Em seguida, enrole o sanduíche da pilha de transferência para eliminar quaisquer bolhas de ar. Insira a esponja do kit de pilha de transferência na almofada absorvente e coloque o sanduíche da pilha de transferência no espaço dedicado. Em seguida, feche a tampa com segurança e inicie o bloco I dois, transferindo as proteínas por sete minutos no programa três.Quando o programa estiver concluído, remova a pilha de transferência da máquina de bloqueio de olhais e retire a pilha de transferência superior e as camadas de papel de filtro expondo o gel na pilha de transferência inferior. Use um bisturi para cortar ao redor do gel, tendo o cuidado de fazer um corte triangular para fins de orientação na membrana após o corte da membrana para verificar a corante de proteína de eficiência de transferência, o gel como acabamos de demonstrar e, em seguida, moveu rapidamente a membrana para um tubo limpo de 50 mililitros contendo cinco mililitros de PBS para o primeiro de três, Lavagens de cinco minutos em um rolo mecânico. Após a terceira lavagem, descarte o tampão de lavagem e incube a membrana em tampão de bloqueio não diluído por um mínimo de 30 minutos à temperatura ambiente.Em seguida, incubar a membrana em anticorpo primário diluído em cinco mililitros de tampão bloqueador e 0,1 entre 20 durante a noite a quatro graus Celsius com agitação constante. Na manhã seguinte, após descartar a solução primária de anticorpos, lave a membrana seis vezes por cinco minutos em PBS, conforme demonstrado. Em seguida, incube a membrana no escuro com anticorpo secundário marcado com fluorescência, dilatado em cinco mililitros de tampão de bloqueio e 0,1% entre 20 com agitação constante, seguido por seis lavagens de PBS de cinco minutos para todas as imagens.Primeiro, faça login no computador e no gerador de imagens. Em seguida, abra o software de imagem para obter imagens da mancha ocidental. Primeiro, abra a tampa do gerador de imagens e despeje uma pequena quantidade de PBS no copo.No canto inferior esquerdo do gerador de imagens, coloque a membrana na parte superior do PBS, certificando-se de que ela esteja alinhada com o eixo do gerador de imagens e que haja uma lacuna de um centímetro entre a membrana e o eixo da grade. Role a membrana para garantir que nenhuma bolha fique presa entre o vidro e a membrana e, em seguida, conte o número de quadrados que a membrana ocupa nos eixos x e y. Em seguida, feche a tampa do gerador de imagens e insira o número de quadrados no software do computador.Selecione o canal infravermelho apropriado e a intensidade apropriada e inicie a varredura para visualizar a coloração total da proteína do gel de controle de carga. Repare o gel e o gerador de imagens conforme demonstrado para a membrana experimental e, em seguida, selecione o canal 700. Defina a intensidade para cinco e inicie a varredura.Para quantificar os dados de digitalização. Comece ajustando os botões de brilho e contraste do arquivo digitalizado para produzir a melhor qualidade de imagem, girando as imagens necessárias para obter a orientação desejada. Em seguida, selecione um retângulo no menu de formas e use-o para desenhar um retângulo ao redor de toda a raia.Na pista de amostra um. Copie e cole a forma ao redor da raia um para obter uma amostra da raia dois. Depois de confirmar que a medição de fundo não incorpora um sinal na próxima faixa, desenhe um retângulo ao redor de cada pista para o restante das faixas de amostra.Em seguida, exiba o sinal para a tabela de formas para cada retângulo desenhado em unidades fluorescentes arbitrárias e salve a imagem como uma bile tiff. Há uma série de medidas de controle que são cruciais para garantir que dados precisos sejam coletados durante o Western blotting fluorescente quantitativo. Por exemplo, é desejável incluir amostras de controlo positivo.Em segundo lugar, é importante otimizar o tempo de transferência para garantir um movimento equivalente de proteínas de alto e baixo peso molecular do gel para a membrana. Em terceiro lugar, as diluições de anticorpos primários e secundários apropriadas devem ser determinadas para evitar a interpretação incorreta das proteínas de interesse devido a bandas não específicas, conforme ilustrado nessas imagens. Em quarto lugar, é importante considerar se um anticorpo secundário criado em uma espécie hospedeira diferente pode ser necessário, particularmente nos casos em que uma banda de proteína esperada não é detectada.Quinto, a produção de um gel de controle de carga pode confirmar a uniformidade da carga da amostra. Quando combinado com uma análise de proteína total, o gel pode ser usado para comparar e quantificar a carga de proteína em cada pista em várias faixas de peso molecular, conforme medido em relação a cada amostra. Finalmente, esta técnica se presta à remoção e resondagem de membranas com mais flexibilidade do que a luminescência kemi devido a fatores que incluem, mas não se limitam a, uma sensibilidade aumentada, um fundo reduzido, detecção de cor dupla e estabilidade da membrana sob condições de armazenamento de longo prazo.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar a plotagem ocidental fluorescente quantitativa para detectar e quantificar com precisão as proteínas de interesse, bem como solucionar problemas comuns que podem ocorrer ao executar essa técnica.

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Este artigo técnico descreve um procedimento de western-blotting usando o padrão disponível comercialmente NuPAGE sistema de eletroforese Mini-Gel da Invitrogen.

Western Blotting Usando o Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western blotting é uma técnica analítica usada para detectar proteínas específicas em uma dada amostra de homogeneizado de tecido ou extrato.

Western Blotting: Preparação de amostras para detecção

O vídeo demonstra uma técnica de western blotting baseada em normalização total de proteínas para quantificar a expressão da proteína-alvo em uma amostra. Ao utilizar a coloração de proteína total da amostra, uma análise raciométrica é realizada para determinar o nível de expressão relativa da proteína alvo.

Western blotting quantitativo para estimar os níveis de expressão de proteínas

Este vídeo descreve o western blotting baseado em quimioluminescência de lisados imunoprecipitados. A técnica ajuda a determinar o processamento e a ativação de proteínas. O sinal quimioluminescente detectado é proporcional ao nível de processamento da proteína durante sua ativação.

Ensaio de Western Blot Quimioluminescente para Processamento de Proteínas

V3 workflow é um procedimento de mancha ocidental usando géis livres de manchas. A tecnologia sem manchas permite aos pesquisadores visualizar a qualidade da separação de proteínas, verificar a eficiência da transferência e, o mais importante, validar a mudança na proteína de interesse usando a quantificação total da proteína como um controle de carregamento confiável.

Fluxo de trabalho livre de manchas V3 para um controle prático, conveniente e confiável de carregamento total de proteínas em blotting ocidental

Este protocolo explora os mais recentes avanços na realização de análises de Western blot. Estas novas modificações empregar um sistema de gel de Bis-Tris com uma electroforese em tempo de execução de 35 minutos, uma seco do sistema de transferência de mancha de 7 min, e a detecção da proteína fluorescente no infravermelho e de imagem que gera uma maior resolução, qualidade, sensibilidade, e precisão melhorada de dados ocidentais.

O mais rápido na Cidade Ocidental: um toque contemporâneo na Análise clássico Western Blot

Nós descrevemos o uso de immunoblotting quantitativa para validar a histologia de imunofluorescência, juntamente com a análise de imagens como meio de quantificar uma proteína de interesse em amostras de tecido fixada em formol, parafina (FFPE). Nossos resultados demonstram a utilidade da histologia de imunofluorescência para determinar a quantidade relativa de proteínas biomarcador em amostras de biópsia de rotina.

Immunoblotting quantitativa de linhas celulares como um padrão para validar a imunofluorescência para quantificar proteínas biomarcador em amostras de tecido de rotina

Este método descreve uma abordagem robusta e reprodutível para a comparação dos níveis de proteína nos tecidos diferentes e em diferentes momentos do desenvolvimento, utilizando uma abordagem de mancha ocidental quantitativa padronizada.

Robusta comparação dos níveis de proteína através de tecidos e durante todo o desenvolvimento usando mancha ocidental quantitativa padronizada

Uma técnica de mancha ocidental de ultra-alta velocidade é desenvolvida melhorando a cinética da ligação antígeno-anticorpo através da tecnologia de drenagem e reposição cíclica (CDR) em conjunto com um agente de aumento de imunoreaction.

Blot ocidental de alta velocidade usando tecnologia de aprimoramento de imunoreaction

Usando a tecnologia Luminex Corporation microesfera xMAP, desenvolvemos o imunoensaio multiplexado fluorométrico (MFIA) para serovigilância de várias espécies de animais de laboratório. O MFIA é um microarray de suspensão onde o antigénio controlo de tecido, ou imunoglobulinas são ligados covalentemente a um código de cores de poliestireno microesferas. O método de ensaio MFIA, bem como vários tópicos de resolução de problemas é abordada.

Multiplexados Metodologia de Testes de imunoensaio fluorimétrico e solução de problemas

Aprenda a realizar Western blotting fluorescente quantitativo para análise de proteínas em amostras biológicas complexas. Este método oferece maior sensibilidade e precisão na detecção de proteínas solúveis e de membrana.

A Guide to Modern quantitativa fluorescente Western Blotting com estratégias de resolução de problemas

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