A Guide to Modern quantitativa fluorescente Western Blotting com estratégias de resolução de problemas

O objetivo deste procedimento é detectar e quantificar com precisão a abundância relativa de proteínas específicas dentro de uma amostra biológica complexa usando torção e blotting quantitativos e fluorescentes. Isso é feito pela primeira eletrofluorescência separando extratos de proteínas usando um gel de gradiente pré-moldado. Na segunda etapa, a carga de proteína equivalente é verificada em todas as pistas de amostra por meio da aplicação de uma coloração de proteína total e, em seguida, o sistema de transferência rápida semi-seco do bloqueio ocular é usado para transferir as amostras para a membrana APVDF.

Finalmente, as proteínas são sondadas com anticorpos primários específicos, seguidos pelo anticorpo secundário marcado com fluorescência apropriado para facilitar sua detecção sensível, robusta e linear em comprimentos de onda infravermelhos e vermelhos distantes. Em última análise, o florescimento ocidental fluorescente quantitativo pode ser usado para detectar, visualizar e quantificar com precisão um grande número de proteínas solúveis e ligadas à membrana em uma ampla gama de amostras de tecido. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a imagem baseada em ECL, é que ela permite uma maior sensibilidade com maior precisão em uma ampla escala linear para uma leitura verdadeiramente quantitativa Comece macerando manualmente a amostra de tecido, seguida de homogeneização em tampão de extração recém-preparado em aproximadamente um a 10 pesos de tecido por volume de tampão até que um homogeneizado consistente e liso seja produzido.

Em seguida, centrifugue o lisado celular por 20 minutos a 20.000 vezes G a quatro graus Celsius. Em seguida, transfira o sato contendo as proteínas solubibilizadas para um tubo de microcentrífuga limpo e armazene as frações do pellet e do sobrenadante S a 80 graus Celsius negativos até que seja necessário. Depois de determinar a concentração proteica do supinato, transferir 15 microgramas de proteína por amostra para novos tubos de microcentrífuga.

Em seguida, traga o volume final de cada amostra para 10 microlitros com água destilada e adicione cinco microlitros de buffer de carregamento Forex. Agite completamente as soluções celulares por vórtice e, em seguida, aqueça as amostras a 98 graus Celsius por dois minutos para desnaturar as proteínas. Após a desnaturação, adicione três microlitros de um padrão de peso molecular apropriado no primeiro poço de cada um dos géis experimentais e de controle de carga.

Depois disso, carregue 10 microlitros de cada amostra nos poços subsequentes apropriados após a eletroforese. Use uma faca de gel para liberar os géis do e remova os poços e o pé do gel. Marque o gel para ajudar na orientação posterior.

Em seguida, para determinar a carga de proteína equivalente, decantar aproximadamente 30 mililitros de mancha de proteína em uma placa de Petri quadrada de 12 por 12 centímetros e colocar o gel de controle de carga na mancha, garantindo que a solução cubra todo o gel. Agite suavemente o gel por no mínimo uma hora em temperatura ambiente e, em seguida, descarte a mancha de proteína e lave o gel três vezes em água destilada antes da visualização do bloqueio ocular. Transferência rápida de proteínas duas semi-secas Após a eletroforese, prepare a pilha de transferência inferior removendo a tampa da folha e pré-umedecendo a membrana com tampão de corrida diretamente do tanque de gel.

Umedeça novamente o papel de filtro com água destilada também neste momento. Em seguida, amarre o gel experimental na pilha de transferência inferior preparada e, em seguida, coloque o papel de filtro pré-trabalho sobre o gel e enrole os dois para garantir que nenhuma bolha fique presa entre as camadas. Coloque a pilha superior em cima do papel de filtro e da pilha inferior.

Em seguida, enrole o sanduíche da pilha de transferência para eliminar quaisquer bolhas de ar. Insira a esponja do kit de pilha de transferência na almofada absorvente e coloque o sanduíche da pilha de transferência no espaço dedicado. Em seguida, feche a tampa com segurança e inicie o bloco I dois, transferindo as proteínas por sete minutos no programa três.

Quando o programa estiver concluído, remova a pilha de transferência da máquina de bloqueio de olhais e retire a pilha de transferência superior e as camadas de papel de filtro expondo o gel na pilha de transferência inferior. Use um bisturi para cortar ao redor do gel, tendo o cuidado de fazer um corte triangular para fins de orientação na membrana após o corte da membrana para verificar a corante de proteína de eficiência de transferência, o gel como acabamos de demonstrar e, em seguida, moveu rapidamente a membrana para um tubo limpo de 50 mililitros contendo cinco mililitros de PBS para o primeiro de três, Lavagens de cinco minutos em um rolo mecânico. Após a terceira lavagem, descarte o tampão de lavagem e incube a membrana em tampão de bloqueio não diluído por um mínimo de 30 minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, incubar a membrana em anticorpo primário diluído em cinco mililitros de tampão bloqueador e 0,1 entre 20 durante a noite a quatro graus Celsius com agitação constante. Na manhã seguinte, após descartar a solução primária de anticorpos, lave a membrana seis vezes por cinco minutos em PBS, conforme demonstrado. Em seguida, incube a membrana no escuro com anticorpo secundário marcado com fluorescência, dilatado em cinco mililitros de tampão de bloqueio e 0,1% entre 20 com agitação constante, seguido por seis lavagens de PBS de cinco minutos para todas as imagens.

Primeiro, faça login no computador e no gerador de imagens. Em seguida, abra o software de imagem para obter imagens da mancha ocidental. Primeiro, abra a tampa do gerador de imagens e despeje uma pequena quantidade de PBS no copo.

No canto inferior esquerdo do gerador de imagens, coloque a membrana na parte superior do PBS, certificando-se de que ela esteja alinhada com o eixo do gerador de imagens e que haja uma lacuna de um centímetro entre a membrana e o eixo da grade. Role a membrana para garantir que nenhuma bolha fique presa entre o vidro e a membrana e, em seguida, conte o número de quadrados que a membrana ocupa nos eixos x e y. Em seguida, feche a tampa do gerador de imagens e insira o número de quadrados no software do computador.

Selecione o canal infravermelho apropriado e a intensidade apropriada e inicie a varredura para visualizar a coloração total da proteína do gel de controle de carga. Repare o gel e o gerador de imagens conforme demonstrado para a membrana experimental e, em seguida, selecione o canal 700. Defina a intensidade para cinco e inicie a varredura.

Para quantificar os dados de digitalização. Comece ajustando os botões de brilho e contraste do arquivo digitalizado para produzir a melhor qualidade de imagem, girando as imagens necessárias para obter a orientação desejada. Em seguida, selecione um retângulo no menu de formas e use-o para desenhar um retângulo ao redor de toda a raia.

Na pista de amostra um. Copie e cole a forma ao redor da raia um para obter uma amostra da raia dois. Depois de confirmar que a medição de fundo não incorpora um sinal na próxima faixa, desenhe um retângulo ao redor de cada pista para o restante das faixas de amostra.

Em seguida, exiba o sinal para a tabela de formas para cada retângulo desenhado em unidades fluorescentes arbitrárias e salve a imagem como uma bile tiff. Há uma série de medidas de controle que são cruciais para garantir que dados precisos sejam coletados durante o Western blotting fluorescente quantitativo. Por exemplo, é desejável incluir amostras de controlo positivo.

Em segundo lugar, é importante otimizar o tempo de transferência para garantir um movimento equivalente de proteínas de alto e baixo peso molecular do gel para a membrana. Em terceiro lugar, as diluições de anticorpos primários e secundários apropriadas devem ser determinadas para evitar a interpretação incorreta das proteínas de interesse devido a bandas não específicas, conforme ilustrado nessas imagens. Em quarto lugar, é importante considerar se um anticorpo secundário criado em uma espécie hospedeira diferente pode ser necessário, particularmente nos casos em que uma banda de proteína esperada não é detectada.

Quinto, a produção de um gel de controle de carga pode confirmar a uniformidade da carga da amostra. Quando combinado com uma análise de proteína total, o gel pode ser usado para comparar e quantificar a carga de proteína em cada pista em várias faixas de peso molecular, conforme medido em relação a cada amostra. Finalmente, esta técnica se presta à remoção e resondagem de membranas com mais flexibilidade do que a luminescência kemi devido a fatores que incluem, mas não se limitam a, uma sensibilidade aumentada, um fundo reduzido, detecção de cor dupla e estabilidade da membrana sob condições de armazenamento de longo prazo.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar a plotagem ocidental fluorescente quantitativa para detectar e quantificar com precisão as proteínas de interesse, bem como solucionar problemas comuns que podem ocorrer ao executar essa técnica.