Name: Produção de Coelhos Knockout apolipoproteína C-III, utilizando zinco Nucleases dedo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-18T21:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Aprenda a produzir coelhos knockout Apolipoproteína C-III utilizando nucleases dedo de zinco. Este método avança a pesquisa em doenças cardiovasculares humanas através de modelos animais geneticamente modificados.

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Este trabalho foi parcialmente financiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde (HL105114, HL088391, NS066652 e HL068878 para YEC), a American Heart Association (National Scientist Desenvolvimento 0835237N para JZ). YEC é apoiado financeiramente como dotado Frederick Huetwell Professor de Medicina Cardiovascular da Universidade de Michigan Medical Center (UMMC). Este trabalho utilizou Core Services suportados pelo Centro de Modelos Avançados para Ciências de translação e Terapêutica (CAMTraST) em UMMC.

Todos os procedimentos de manutenção dos animais, cuidado e uso foram analisados ​​e aprovados pelo Comitê da Universidade sobre o Uso e Cuidados de Animais da Universidade de Michigan. 1. ZFN Desenho e selecção <ol><li> Fornecer a informação sobre a sequência genómica do gene de interesse (por exemplo, coelho APOCIII) para o fabricante. Selecione ZFN conjunto (s) para os experimentos com base nas pontuações ZFN. </li></ol> 2. Coleção Coelho Embryo <ol><li> Superovulate sexualmente maduras (6-18 meses) Nova Zelândia Branco (NZW) coelhas por via subcutânea (sc) a injeção de FSH duas vezes / dia, com uma dosagem de 3 mg para as duas primeiras injeções, 5 mg para as próximas duas injeções e 6 mg para as duas últimas injeções. </li><li> Administrar uma única intravenosa (iv) a injecção de 200 IU de hCG, a 72 horas após a primeira injecção de FSH para induzir a ovulação. Companheiro as fêmeas superovuladas com um coelho macho imediatamente após a injeção de hCG. </li><li> Euthanize os coelhos doadores superovuladas com pentobarbital de sódio (150 mg / kg, iv) a 16-18 horas pós inseminação (psi). </li><li> Recuperar o ampolas oviduto cuidadosamente recolher o ovidutos e ovários inteiros estrutura. </li><li> Lavar cada oviduto com meio de 10 mL de tampão HEPES a manipulação TCM 199 suplementado com 10% de soro fetal bovino, através da injecção do meio a partir da extremidade do útero do oviduto. Recolher o meio de lavagem na abertura ovário-final do oviduto para uma placa de Petri. </li><li> Observar e identificar embriões recuperados no meio de lavagem, lave os embriões três vezes no meio da manipulação, mantê-los no meio de manipulação a 38,5 ° C no ar, e observá-los sob um microscópio estereoscópico para a ocorrência de fertilização. Prepare-se para microinjeção de embriões em estágio pronuclear 19-21 psi h </li></ol> 3. Preparação de mRNA de ZFN <ol><li> Purifica-se o ARNm, resultando antes de ressuspensão em RNAse-livre de 0,1 X TE (1 mM Tris-Cl pH8,0, EDTA 0,1 mM). Medir a concentração e armazenar o ARNm a -80 ° C até à sua utilização. </li><li> Preparar os mRNAs que codificam par ZFN (4-10 ng / mL em 1 mMTris-Cl, 0,1 mM de EDTA a pH 7,5), em aliquota de 10 ul frascos. Guarde-os a -80 º C até que esteja pronto para uso. Antes de microinjeção, descongelar o frasco (s) de RNA, e mantê-lo no gelo. </li></ol> 4. Embrião microinjeção <ol><li> Prepare a plataforma microinjecção, colocando uma gota de 5 ul de meio de manipulação de uma lâmina de câmara de 1-bem que tem a câmara de material removido. Cubra a gota média com óleo mineral e lugar no palco microscópio aquecida. </li><li> Coloque pipeta exploração (120 um de diâmetro) para o braço de suporte do micromanipulador e posicioná-la na gota de meio de manipulação. </li><li> Fabricar micropipetas de injeção através do aquecimento e puxando tubos capilares de vidro de borosilicato de um dispositivo extrator micropipeta. Carregar o mRNA a ser injectado na pipeta de injecção. </li><li>Ligue o fornecimento de ar comprimido que é conectado a um microinjetor. </li><li> Coloque pipeta de injeção no suporte a injeção, colocá-lo no micromanipulador e posicioná-lo para a gota de meio de manipulação. </li><li> Configuração microinjetor, com os seguintes parâmetros sugeridos: holdP = 2 psi, InjP = 20 psi, ClearP = 60 psi, Injtime = 1 seg, o que irá resultar em um volume de injecção de 1-5 pl. </li><li> Abra a ponta da pipeta de injecção batendo-a contra a pipeta de exploração. </li><li> Transferir embriões (30-50) para a queda de micromanipulação na plataforma. Utilizar a pipeta de exploração para capturar um embrião e alinhar a agulha de injecção, e o embrião pipeta de retenção ao longo do eixo-x. </li><li> Sob aumento de 400X, o avanço da pipeta de injeção através do embrião. Tenha cuidado para evitar o núcleo. Uma vez que a membrana plasmática é perfurado, pedal imprensa pé para injetar. Após a injeção, retirar a agulha, solte o embrião. Repita o processo para todos los restantebryos. </li><li> Lavar embriões injectados três vezes em meio de cultura de embrião, o qual é constituído por uma solução salina equilibrada de Earle (EBSS), suplementado com aminoácidos não essenciais (NEAA), aminoácidos essenciais (EAA), 1 mM de L-glutamina, piruvato de sódio 0,4 mM, e 10% FBS. </li><li> Incubar os embriões a 38,5 ° C em 5% de CO 2 em ar durante 1-2 horas, antes de serem transferidos para cirurgicamente os ovidutos de uma fêmea receptora sincronizado NZW coelho (ver passo 5.1). Alternativamente, a cultura dos embriões até atingirem o estágio de blastocisto, antes de serem usados ​​para a validação em vitro ou ensaios. </li></ol> 5. Transferência de Embriões <ol><li> Selecione um coelho fêmea NZW 5-12 meses de idade, com boa saúde, pesando aprox. 4,0-5,0 kg como destinatário dos animais. Administrar Hormona Libertadora de Gonadotropina (GnRH), por via intramuscular injecção (im, de 50 mcg / ml, 0,3 ml / animal) para o receptor ao mesmo tempo com que o ponto de injecção de hCG para o animal (s) doador (ver passo 2.2). </li&gt; <li> Após a conclusão da microinjeção, preparar o coelho destinatário para transferência de embriões (normalmente 16-24 horas após a injeção de GnRH). Anestesiar o coelho com 10-40 mg / kg de ketamina (im), e / ou isoflurano vaporizado (2-4%) por inalação. Proteger os olhos do coelho de secagem excessiva através da aplicação de uma pomada oftálmica estéril. Observar o animal até que ele é totalmente inconsciente, ie. não responde aos reflexos pedal; apertando a almofada do pé é usado para verificar se há falta de pedal de reflexo, que é uma indicação de anestesia adequada. </li><li> Raspar o abdômen do coelho, lave com esfoliante anti-séptico, seguido de solução anti-séptica, e limpe a área depilada com esponjas de gaze estéril. </li><li> Realizar a cirurgia sob condições estéreis, gravar os sinais vitais do coelho receptor aproximadamente a cada 15 min durante toda a cirurgia. </li><li> Transferir 10-25 embriões para um animal receptor, dependendo do número de embriões disponíveis. </li><li> No final doprocedimentos cirúrgicos, feche a camada muscular com fio absorvível revestido. Suturar a pele ou com uma sutura subcuticular usando sutura absorvível ou com simples suturas interrompidas usando sutura nonabsorable (por exemplo, de monofilamento de nylon ou semelhante). </li><li> Mantenha o animal aquecido e monitorá-lo até o seu decúbito esternal é atingido. </li><li> Monitorar o animal diariamente. Siga as instruções do veterinário para cuidar do animal. Administrar meloxicam (sc de 1,0 mg / kg) para aliviar a dor e / ou reduzir a febre pós operação diária, se necessário determinado pelo médico veterinário. </li><li> Remover suturas nonabsorable em cerca de 10-14 dias de operação post. </li></ol> 6. Detecção de ZFN Induced Gene Disruption <ol><li> Para a validação in vitro, realizar genotipagem nas in vitro de embriões em cultura. Lyse embriões individuais que se desenvolveram a fase de mórula / blastocisto em solução 5 mL NP40 (1% NP40 mais 1 ug / ml proteinase K em Taq Tampão) Durante 0,5-1 horas a 55 ° C, e 10 min a 95 ° C. </li><li> Para a genotipagem da prole, coletar amostras de pele de orelha de kits de recém-nascidos, extrair DNA genômico, e usá-los como modelos para PCR seqüenciamento. Aplicar Kwik-Stop para a área de amostragem após a coleta para parar a hemorragia e reduzir o desconforto. </li><li> Utilizar a lise do passo 6.2 ou 6.3 como molde para PCR utilizando-LA Taq e par de iniciadores de PCR, as quais estão localizadas a montante (5&#39;-TGAGGCCGGGAAGGGAGCAGTCG-3 &#39;) e a jusante (5&#39;-GCCAGGCCCACCCACGGAACAGC-3&#39;) do local alvo ZFN . </li><li> Purifica-se os produtos de PCR e sequenciar-los com o iniciador de sequenciação (5&#39;-TCTGCACGCTTGGGGCTGGAG-3 &#39;). </li><li> Identificar as amostras mutantes, olhando para a curva de casal no diagrama de sequência em torno do local segmentação. Identifique aqueles com curvas duplas como &quot;positivo&quot;. </li><li> Clonar os produtos &quot;positivos&quot; de PCR em vector de clonagem TA, pegar 10-20 clones, seqüência as inserções, e confirmar as mutações em torno da targeting local. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

No presente trabalho, cinco coelhos APOCIII KO foram gerados utilizando a tecnologia ZFN. Anteriormente, o único relato de produção de coelhos GTT também usou a tecnologia ZFN 18. O presente trabalho confirmou que ZFN é útil para direcionar efetivamente genes em coelhos. No presente estudo, a taxa de ratinhos transgénicos (kits positivo / total de nascidos) is23.8% (5/21), o que é comparável ao do relatório anterior ZFN em coelhos (30,8%, 16/52) 18, e os relatados de usar ZFN em outras espécies animais, incluindo peixe zebra 19, 20 camundongos, ratos e porcos 21 17. Esta taxa é de facto mais elevada do que as taxas de produção de muitos estudos coelho transgénico convencionais, que normalmente caem na gama de 5-20%. Por exemplo, num esforço para o produto APOCIII coelhos transgénicos através de microinjecção de ADN convencional, Ding et al. Obtido 3 fundadores positivos de 54 crias recém-nascidas (5,6%) 22. Consistente com os resultados anteriores, as mutações nos locais alvo são variáveis, incluindo deleções ou inserções consistem número diferente de bases (desde 1-21 em cinco coelhos KO). Com base na informação da sequência específica dos animais fundadores, prevê-se que pelo menos quatro (isto é. Aqueles contendo Δ1, 1, 1, ou Δ20 mutações) que tem perda de função de APOCIII. Animais R-16 com Δ21 poderá não apresentar perda funcional, já que esta mutação está previsto para apenas causar perda de sete aminoácidos, mas não uma mudança de quadro de leitura. Em última análise, ensaios fenótipo são necessários para determinar se esses animais fundadores realmente mostrar a perda de funções APOCIII. Nenhum dos cinco coelhos KO gerados no presente estudo contêm modificações bialélicos. Curiosamente, este é também o caso no relatório anterior coelho ZFN. Em contraste, quando ZFNs segmentação α1 ,3-galactosiltransferase foram aplicados ao porcoAs células, a frequência de direcionamento de um único alelo variou 7-46%, com cerca de um terço de mutações de um só passo, criando bialélico perfurações 23. Consistente com isto, quando TALEN foi aplicado a células de fibroblastos de porco, as modificações bialélicos foram encontrados em cerca de 15-40% do total de 14 clones positivos. É possível que o fracasso em gerar coelhos KO bialélicos no presente estudo pode indicar uma diferença de espécies (ou seja coelhos contra os porcos) para tal capacidade de gene nuclease baseada segmentação. É, no entanto, mais provável que este é simplesmente porque o número de coelhos KO gerados neste projecto é relativamente pequena. Acreditamos que ZFN é capaz de gerar mutações bialleic em coelhos, que devem ser considerados como uma outra vantagem potencial de produção de coelhos GTT baseado ZFN. São necessários mais estudos para confirmar essa capacidade de ZFN em coelhos. Em conclusão, o presente trabalho demonstra que a ZGene baseado FN visando abordagem é eficaz na produção de coelhos KO. Em particular, foram geradas cinco coelhos APOCIII KO com uma taxa satisfatória transgénico de 23,8%. Estes animais são acreditados para fornecer informações mais significativas sobre o papel desta proteína no metabolismo lipídico em humanos do que os modelos correspondentes do mouse. Prevemos direccionamento de genes com base ZFN, bem como outras tecnologias de base, tais como nucleases TALEN e RGEN, em animais nonmurine facilitará significativamente o desenvolvimento de novos modelos animais para o estudo de várias doenças humanas. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig1.jpg" width="500px" /> Figura 1. Fluxograma da produção de coelhos knockout utilizando a tecnologia ZFN. A produção de coelhos KO utilizando tecnologia ZFN começa com a selecção do gene de interesse. A informação é fornecida seqüência, conjuntos ZFN são projetados e subjected a levedura baseado validação interna. No ponto de verificação (CP) 1 (CP-1), apenas os conjuntos passaram na casa de validação (50% ou mais do controle interno positivo) será fornecido aos usuários para a seleção. Se nenhum conjunto de passar CP-1, sequência adicional pode ser necessária para a concepção de conjuntos ZFN eficazes. Uma validação embrião in vitro é seguido para assegurar o conjunto ZFN selecionado pode induzir mutações em locais selecionados (CP-2). ZFN conjunto (s) só será utilizado se passa CP-2 (&gt; = 10% de taxas de mutação em embriões in vitro). Falha no CP-2 exigirá um redesenho dos conjuntos ZFN. Doadoras de embriões serão preparados e embriões em estágio pronuclear será microinjeção com os conjuntos ZFN validadas. Estes embriões microinjectados serão transferidos para receptoras sincronizadas. Após o período de um mês de gestação, os recém-nascidos serão genotipados (CP-3). Se nenhum dos recém-nascidos são positivos, microinjecção adicional vai ser efectuada. Demora 2-3 meses do início do projeto para CP-2, assumindo que nfalha o durante o processo. Leva adicionais 2-3 meses de CP-2 a CP-3. Por isso, é possível gerar um coelho nocaute em um mês 4-6 período de tempo usando a tecnologia ZFN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig2.jpg" width="500px" /> Figura 2. Projeto ZFN. Três conjuntos ZFN (ajuste 1, 2 e 3) foram projetados visando diferentes seqüências em Exon 1 ou Exon 2 de coelho APOCIII (A). Todos os três conjuntos foram sujeitos a MEL-1 de ensaio repórter de levedura para determinar as actividades de ZFN. De acordo com os protocolos do fabricante, que mostram actividades ZFNs&gt; 50% da do controlo positivo interno do fabrico, são considerados úteis para o in vitro e em experiências in vivo edição genoma.As atividades ZFN foram 224,2% para o conjunto 1, 196,9% para o Conjunto 2 e 177,8% para o conjunto de 3 (B), portanto, Conjunto 1 foi selecionado no presente estudo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig3.jpg" width="500px" /> Figura 3. Validação in vitro de embriões de ZFN. O ARNm (5 ug / ml) do Conjunto 1 foi microinjectada no citoplasma de embriões de coelho 35 pronuclear fase (A). Embriões eliminado sem tratamento microinjeção (n = 31) foram utilizados como grupo controle. A taxa de desenvolvimento BL foi de 77,4% no grupo controle. No grupo de micro-injectados, a taxa de BL foi de 51,4%. Das 16 BLs submetidos a PCR de seqüenciamento, 8 (50%) foram consideradas positivas, indicando Set 1 é um conjunto ZFN eficaz para induzir mutações no targelocal ting (B, apoc3wt.seq, black-box) de APOCIII em coelhos. Os LB contendo mutações são BL # apoc-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, e (sublinhado B, vermelho) 17. Os restantes BLs (# apoc-2, 6, 9, 10, 12, 14 e 16) não possuem mutações no local segmentação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig4.jpg" width="500px" /> Figura 4. Produção de coelhos APOCIII KO. Cento e quarenta e cinco embriões microinjetados com ZFN grupo 1 mRNAs foram transferidos para receptoras 7 coelhos pseudo-grávida (A). Embriões recém-liberadas (n = 75) sem ZFN microinjeção foram transferidos para receptoras (n = 6), como o grupo de controle. A taxa de prazo calculado como kits prazo total / total de embriões no grupo experimental é de 140,5% (21/145), enquanto que a taxa é de 29,3% (22/75) no grupo de controle (A). Dos 21 kits nascidos no grupo microinjectado, cinco (R1, R9, R11, R12 e R16) foram identificados como positivos kits KO após sequenciação de PCR (B). Os indels no local segmentação incluem duas inserções (+1 para ambos R9 e R11) e três deleções (Δ1, Δ 20 Δ 21 para R1, R12 e R16, respectivamente). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> .

A apolipoproteína (apo) C-III (APOCIII) é uma pequena proteína de secreção-O glicosilada que é sintetizada principalmente no fígado e no intestino. Reside na superfície de quilomicron no plasma (CM), lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL) e as lipoproteínas de alta densidade (HDL). APOCIII tem sido reconhecida como um fator de risco para a doença cardiovascular 1. Os pacientes com deficiência hereditária de APOCIII têm baixa de triglicérides plasmáticos (TG) e reduziu aterosclerose coronariana subclínica 2,3. Nível APOCIII elevada no plasma, por outro lado, muitas vezes, se correlaciona com a resistência à insulina, obesidade, hipertrigliceridemia e (HTG) 4,5. Gene nocaute (KO) é um meio poderoso para estudar a função de um gene. De acordo com as observações em populações mutantes humanos, nocaute do gene APOCIII em camundongos levou a uma redução de plasma TG e proteção contra HTG pós-prandial 6. Esse papel positivo de APOCIII apareceupara ser independente de apolipoproteína E (ApoE), como ratinhos deficientes de ApoE e ambos APOCIII também são protegidos de hiperlipidemia pós-prandial 7. Embora estes modelos APOCIII KO rato forneceram informação valiosa sobre as possíveis funções de APOCIII em seres humanos, é de notar que o metabolismo de colesterol de lipoproteína de ratinhos é diferente daquela dos seres humanos em muitos aspectos. Por exemplo, rato carece de colesterol de proteínas de plasma de transferência de éster (CETP), uma enzima importante envolvida no transporte de VLDL, LDL, HDL e 8. Por conseguinte, é necessário o desenvolvimento de um modelo animal apropriado para entender melhor o papel fisiológico de APOCIII in vivo. O coelho é um modelo clássico espécies animais 9-11. Ele tem um período de gestação de curta duração (30-31 dias), grande tamanho de leitegada (4-12/litter) e podem ser alojados convenientemente em uma instalação interior. Em comparação com ratos, coelhos são filogeneticamente mais estreita 10 para os seres humanos. Importante, como huhomem, mas ao contrário de ratos, coelhos são mamíferos ricos em LDL e têm níveis substanciais de CETP 10,12. Além disso, eles são susceptíveis a aterosclerose induzida por dieta rica em colesterol com as lesões semelhantes aos observados na aterosclerose humana 13. Por estas razões, temos a hipótese de que os coelhos APOCIII KO pode servir como um modelo melhor do que suas contrapartes do rato para investigar os papéis de ApoCIIIplay no metabolismo lipídico e aterosclerose em humanos. Produção de gene transgênico alvo (GTT) coelhos tem sido um desafio. Isto é principalmente devido à falta de transmissão da linha germinativa de células-tronco embrionárias (ESC) ea baixíssima eficiência da transferência nuclear de células somáticas (TNCS) em coelhos. ESC é a principal ferramenta para gerar camundongos GTT, enquanto e TNCS tem sido aplicado com sucesso para gerar animais KO em espécies falta CES transmissão germinativas, incluindo suínos, ovinos e bovinos, mas não coelhos. Recentemente Zinc Finger Nuclease (ZFN), Trancrição Activator-Like Effector Nuclease (TALEN) 14, e RNA Endonuclease Guiada (RGEN) 15 surgiu como meios poderosos para edição genoma. Estas nucleases, assim chamados de &quot;tesoura molecular&quot;, são eficazes na geração de quebras de cadeia dupla (DSB) no genoma que pode levar a um KO funcional do gene alvo ou utilizadas para integrar uma sequência de ADN num local específico no genoma de um número de espécies de 16. Em 2011, entre os primeiros a adaptação da tecnologia ZFN, geramos peroxisome receptor gama ativado por proliferador (PPAR), as células de suíno KO através desta abordagem e porcos PPAR KO gerados com sucesso depois de usar estas células para TNCS 17. No mesmo ano, a interrupção do gene da imunoglobulina eficiente e substituição alvo em coelhos também usando ZFN foi relatada 18. No presente estudo, cinco coelhos APOCIII KO foram gerados como foi confirmado por PCR seqüenciamento, utilizando ZFN Set 1 (veja a Figura 1 </strong&gt;. fluxograma para a ilustração). Estes animais são novos recursos para estudar os papéis de APOCIII no metabolismo de lipídios.

<table><tbody><tr><td>APOC3-ZFN</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CSTZFNY-1KT</td><td>Gene Alvo: APOC3, Número do Lote: 12201118MN</td></tr><tr><td>kit mMESSAGE</td><td>Invitrogen</td><td>AM1344M</td><td>síntese de mRNA</td></tr><tr><td>MEGAclear Kit&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>AM1908M</td><td>purificação de mRNA</td></tr><tr><td>Hormônio folículo-estimulante</td><td>Bioniche Life Sciences</td><td>Folltropin-V</td><td>Tratamento de coelhos doadores de embriões</td></tr><tr><td>Gonadotrofina coriônica humana</td><td>Intervet</td><td>Chorulon</td><td>Tratamento de coelhos doadores de embriões</td></tr><tr><td>Hormônio liberador de gonadotrofina</td><td>Prospecbio</td><td>HOR-255</td><td>Tratamento de coelhos receptores de</td></tr> <tr><td>embriõesSolução salina balanceada de Earle (EBSS)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30029.02</td><td>Cultura de embriões, meio base</td></tr><tr><td>MEM (aminoácido não essencial)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7145</td><td>Cultura de embriões, suplementos</td></tr><tr><td>Solução de aminoácidos BME</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6766</td><td>Cultura de embriões, suplementos</td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-149</td><td>Cultura de embriões, suplementos</td></tr><tr><td>Piruvato de sódio&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>Cultura de embriões, suplementos</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12003C</td><td>Cultura de embriões, suplementos</td></tr><tr><td>HEPES tamponado TCM 199&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12350039</td><td>Meio de manipulação de embriões</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Eppendorf</td><td>Galaxy 170</td><td>Equipamento de cultura de embriões</td></tr><tr><td>Micromanipulador&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>TransferMan NK 2</td><td>Equipamento de manipulação de embriões</td></tr><tr><td>Extrator de micropipetas</td><td>Sutter Instruments Inc.</td><td>P-1000</td><td>Equipamento de manipulação de embriões</td></tr><tr><td>Microinjetor&nbsp;</td><td>Equipamento de manipulação de embriões</td><td>MINJ-D</td> <td>da Tritech Research</td></tr><tr><td>Tubos capilares de vidro borosilicato&nbsp;</td><td>Instrumentos de precisão mundiais, Inc.</td><td>TW100F-6</td><td>Fornecimento de manipulação de embriões</td></tr><tr><td>Euthasol (pentobarbitol sódico)</td><td>Virbac AH, Inc.</td><td>ANADA#200-071</td><td>Eutanásia de coelhos doadores de embriões</td></tr></tbody></table>

produção de coelhos knockout apolipoproteína c-iii, utilizando zinco nucleases dedo

Production of Apolipoprotein C-III Knockout Rabbits using Zinc Finger Nucleases

A apolipoproteína (apo) C-III (APOCIII) reside na superfície de quilomicron no plasma (CM), lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL) e as lipoproteínas de alta densidade (HDL). Tem sido reconhecido que os elevados níveis de plasma APOCIII factor de risco constitutea para doenças cardiovasculares (DCV). Nível APOCIII plasmáticos elevados, muitas vezes se correlaciona com a resistência à insulina, obesidade e hipertrigliceridemia. Valiosos conhecimentos sobre os papéis de ApoCIIIin metabolismo de lípidos e doenças cardiovasculares tem sido obtido a partir de modelos de ratinhos transgénicos, incluindo knockout (KO) APOCIII, no entanto, é de notar que o metabolismo das lipoproteínas em ratinhos é diferente daquela dos seres humanos em muitos aspectos. Não se sabe até agora se plasma elevado APOCIII é diretamente aterogênica. Nós trabalhamos para desenvolver coelhos APOCIII KO no presente estudo com base na hipótese de que os coelhos podem servir como um reasonablemodelfor estudar o metabolismo lipídico humano e aterosclerose. Coelho dedo de zinco nuclease (ZFN) conjuntos visando ApoCIIIgene foram submetidos a validação in vitro antes da microinjecção de embriões. O mRNA foi injectada para o citoplasma de 35 embriões de coelho fase pronuclear, e avaliadas as taxas de mutação no estado de blastocisto. Dos dezasseis blastocistos que foram testadas, uma taxa satisfatória de 50% mutação (8/16) no sítio de direccionamento foi alcançado, suportando a utilização de um Conjunto para experiências in vivo. Em seguida, microinjeção 145 embriões com Set 1 mRNA, e transferiu esses embriões de coelhos 7 receptores. Depois de 30 dias de gestação, 21 kits nasceram, dos quais cinco foram confirmados como coelhos APOCIII KO após PCR ensaios de sequenciamento. A taxa de animais KO (# kits KO / total de nascidos) foi de 23,8%. A eficiência global de produção é de 3,4% (5 kits/145 embriões transferidos). O presente trabalho demonstrou que ZFN é um método altamente eficiente para a produção de coelhos KO. Estes coelhos APOCIII KO são novos recursos para estudar os papéis de APOCIII no metabolismo de lipídios.

Na validação in vitro de pares ZFN Dezesseis pares ZFN foram inicialmente projetados. A sequência de ruptura direccionada do Conjunto 1 está localizada no exão 2 de coelho APOCIII (Figura 2A). Três pares (grupo 1, 2, e 3, Figura 2A) foram seleccionados e sujeitos a levedura MEL-1 ensaio de repórter para determinar as actividades de ZFN (Figura 2B). Conjunto 1 tem uma pontuação ZFN de 224,2%, mais elevada do que aqueles do Conjunto 2 (196,9%) e do Conjunto 3 (177,8%) e muito mais elevado do que o limiar de selecção (ou seja, 50% do controlo positivo interno). Portanto Set 1 foi selecionado para experimentos in vitro de validação. Um conjunto particular deve resultar em taxas positivas nos embriões de 10% ou mais elevada para passar a validação in vitro de embriões, com base nos critérios de validação interna. O ARNm (5 ug / ml) do Conjunto 1 foi microinjectada no citoplasma de embriões de coelho 35 pronuclear fase (Figura 3A &lt;/ Strong&gt;). Embriões eliminado sem tratamento microinjeção (n = 31) foram utilizados como grupo controle. Dezoito embriões do grupo microinjectados desenvolveram para a fase de BL em D5, das quais dezasseis foram sequenciados, e oito (BL # apoc-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, 17, Figura 3B, sublinhado vermelho) exibido mutado seqüências no local de segmentação (black-box, Figura 2B, linha superior, apoC3wt.seq). A taxa de BL do grupo microinjectado (51,4%) é mais baixa do que a do grupo de controlo (77,4%), indicando a capacidade de desenvolvimento de embriões ligeiramente prejudicada microinjectados. A taxa de mutação positiva dos embriões microinjectados é de 50,0% (8/16), muito mais elevada do que o limiar de selecção (por exemplo, 10%). Estes resultados revelaram que Set 1 é um conjunto ZFN eficaz para induzir mutações no local segmentação de APOCIII coelho. Portanto Set 1 foi escolhido para produção in vivo de coelhos APOCIII KO. Produção de coelhos APOCIII KO O ARNm of ZFN Conjunto 1 foi microinjectada no citoplasma de embriões de coelho fase pronuclear, e transferidos 145 embriões microinjectados 7 coelhos receptoras pseudo-grávido (Figura 4A). Embriões recém-liberadas (n = 75) sem ZFN microinjeção foram transferidos para receptoras (n = 6), como o grupo de controle. Depois de 30 dias de gestação, 21 kits nasceram no grupo microinjeção. PCR sequenciação identificados cinco (APOC3-R1, R9, R11, R12 e R16) como kits KO positivos (Figura 4B). A taxa de prazo calculado como kits total de prazo / embriões totais é de 14,5% (21/145), enquanto que a taxa é de 29,3% (22/75) no grupo de controle. A taxa de KO calculado como kits totais KO / prazo total é de 23,8% (5/21). Um kit KO (PACO-R16) morreu cinco dias pós-parto (20,0%, 1/5). O indelsat local direccionamento incluem duas inserções e três deleções, eles areΔ1, 1, 1, Δ20 e Δ21, para coelhos # R1, R9, R11, R12, e R16, respectivamente, (Figura 4B). Bianálise oinformatics foi utilizada para identificar potencial ZFN off-alvos com 7 ou menos incompatibilidades para definir uma seqüência, como descrito anteriormente 17. Apenas um possível local previsto fora do alvo, localizado no cromossomo 14, foi identificado com 7 bps incompatíveis. Ensaio de PCR detectados eventos fora do alvo, em qualquer um dos animais fundadores.

Desenvolvimento recente no gene ferramentas que visam torna a produção de knockout (KO) coelhos possível. No presente trabalho, geramos cinco coelhos apolipoproteína (Apo) C-III KO usando Nucleases dedo de zinco (ZFN). Este trabalho demonstrou que ZFN é um método altamente eficiente para a produção de coelhos KO.

Produção de Coelhos Knockout apolipoproteína C-III, utilizando zinco Nucleases dedo

Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) resides on the surface of plasma chylomicron (CM), very low density lipoprotein (VLDL) and high density lipoproteins ...

O objetivo geral deste procedimento é desenvolver novos modelos de coelhos para o estudo de doenças cardiovasculares humanas. Isso é realizado primeiramente projetando e sintetizando nucleases de dedo de zinco que visam o gene de interesse. O segundo passo do procedimento é microinjetar os RNAs das ZFNs no citoplasma de embriões em estágio pronuclear.O terceiro passo é transferir cirurgicamente os embriões para uma coelha receptora. O passo final é genotipar os recém-nascidos para identificar os animais transgênicos. No geral, o direcionamento gênico por meio de ZFN é altamente eficaz e é demonstrado aqui pela criação de um coelho com inativação do gene A OC três.Essa técnica é um marco na engenharia genética, pois é a primeira a permitir a produção de coelhos sem código. As implicações dessa técnica estendem-se à terapia de muitas doenças humanas, como doenças cardiovasculares. Está se tornando cada vez mais evidente que modelos animais de grande porte são necessários para imitar melhor a fisiologia e a patologia humanas.Tivemos pela primeira vez a ideia deste método ao ler o artigo que descrevia o direcionamento gênico bem-sucedido utilizando nucleases significativas em vermelho em 2009. Em geral, as pessoas familiarizadas com este método enfrentarão dificuldades, pois ele envolve a microinjeção citoplasmática de um construto. Embora este método possa fornecer informações sobre o direcionamento gênico em coelhos, ele também poderia ser aplicado a outros sistemas, como suínos.Inicie com a superovulação de coelhos brancos da Nova Zelândia sexualmente maduros, utilizando uma injeção subcutânea de FSH duas vezes ao dia durante um período de três dias, aumentando a dosagem diariamente. Após 72 horas da última injeção de FSH, administre 200 UI de HCG por via intravenosa para induzir a ovulação, acasalando imediatamente após as fêmeas superovuladas. Neste momento, um animal receptor também deve ser preparado.16 a 18 horas após a inseminação, eutanizar as coelhas doadoras superovuladas com pentobarbital de sódio. Recuperar o TCU cuidadosamente coletando todo o útero. Estruturas de TCOs e ovários: lavar cada TCU com 10 mililitros de meio de manipulação, injetando o meio pela extremidade do útero do TCU.Colete o meio lavado na extremidade do ovário do TCU em uma placa de Petri. Os embriões recuperados são encontrados no meio lavado. Em seguida, lave os embriões três vezes com meio de manipulação.Em seguida, incubar os embriões no meio de manipulação a 38,5 graus Celsius em ar ambiente. De 19 a 21 horas após a inseminação, selecionar os embriões utilizando um microscópio estereoscópico.Colete cerca de 30 embriões em estágio de núcleo pronuclear para cada condição de injeção, esperando-se de 30 a 40 embriões desse estágio por fêmea superovulada. Com antecedência, obtenha conjuntos de ZFN para o gene de interesse de um fornecedor.Selecionar aqueles com as melhores pontuações de ZFN. Neste exemplo, o gene de interesse é A OC three. Para preparar o mRNA de ZFN, primeiro transcreva in vitro a RNA mensageira de ZFN e poliadenile os transcritos.Em seguida, purifique o mRNA resultante e o ressuspenda. Suspenda-o em RNA spree 0,1 xte E. Em seguida, meça a concentração de RNA utilizando um espectrofotômetro e prepare alíquotas dos mRNA que codificam pares de ZFN em concentrações de quatro a 10 nanogramas por microlitro em frascos de 10 microlitros para armazenamento. Inicie aquecendo o estágio de microinjeção a 38 graus Celsius.Para preparar a plataforma de microinjeção, primeiro remova a câmara de meio de um lâmina com poço único, então adicione uma gota de cinco microlitros do meio de manipulação sobre a lâmina e cubra com óleo mineral. Coloque a lâmina preparada sobre a platina aquecida do microscópio.Em seguida, fixe uma pipeta de retenção com diâmetro de 120 micrômetros a um micromanipulador e posicione a pipeta na gota de meio sobre a plataforma. Agora, descongele os RNAm a serem injetados em gelo. Carregue-os em uma pipeta de injeção, confeccionada a partir de um tubo capilar de vidro borossilicato utilizando um puxador de micropipetas.Em seguida, ligue o suprimento de ar comprimido conectado ao microinjetor. Depois, fixe a pipeta de injeção em seu suporte e conecte-o a um segundo micromanipulador. Posicione também essa pipeta na gota de meio.Agora configure o microinjetor para um volume de injeção de um a cinco picolitros. Para abrir a ponta da pipeta de injeção, toque-a suavemente contra a pipeta de retenção.Usando uma pipeta de vidro, transfira 30 a 50 embriões para a plataforma de micro-manipulação. Em seguida, sob magnificação de 100 x.Use a pipeta de contenção para capturar um embrião. Alinhe a pipeta de contenção e o embrião com a agulha de injeção agora em 400 x. Avance a pipeta de injeção através do embrião.Tenha cuidado para evitar o núcleo. Após a punção da membrana plasmática, pressione o pedal para injetar o mRNA; após a injeção, retire a agulha e libere o embrião. Repita o processo para todos os embriões restantes.Uma vez que todos sejam injetados, lave os embriões três vezes no meio de cultura embrionária, com 30 segundos por lavagem. Em seguida, incube os embriões a 38,5 graus Celsius com ar contendo 5% de dióxido de carbono por uma a duas horas antes de transferir os embriões para a receptora sincronizada.Fêmea de coelho. Para cultivar os embriões até a fase de blastocisto, o incubador deve ter ar umidificado. Selecione uma fêmea de coelho NZW com idade entre cinco e doze meses, que esteja em boas condições de saúde e pese entre quatro e cinco quilos.Prepare o animal receptor administrando primeiro gonadotrofina por via intramuscular. De 16 a 24 horas após a injeção do hormônio, anestesie o coelho com cetamina e ou isoflurano vaporizado. Quando o coelho estiver completamente inconsciente, não apresentará reflexos plantares.Quando o coxim for pressionado antes da cirurgia, proteja os olhos com pomada oftálmica e prepare o abdômen. Durante a cirurgia, registre os sinais vitais do coelho. A cada 15 minutos, inicie fazendo uma incisão de aproximadamente 2,5 centímetros através da pele e, em seguida, ao longo da camada muscular.Exponha cada ovário juntamente com o cornu uterino correspondente, segurando um ovário entre o polegar e o indicador. Transfira os embriões para o oviduto por meio de uma pipeta estéril inserida cuidadosamente. Geralmente, de 10 a 25 embriões de cada 30 embriões injetados são viáveis, e todos podem ser transferidos para um único receptor.Complete a cirurgia fechando a camada muscular com um fio absorvível revestido. Suture a pele com um fio subcuticular absorvível ou com pontos simples interrompidos não absorvíveis na pele. Em seguida, mantenha o animal aquecido e monitore-o até que esteja em posição esternal.Recumbente é alcançado. Inicialmente, 16 pares de ZFN foram projetados. A sequência de interrupção direcionada do conjunto um está localizada no éxon dois de um OC três conjuntos.Um, dois e três foram selecionados e submetidos ao ensaio repórter MEL em levedura para determinar as atividades das ZFN. O conjunto um apresentou uma pontuação de ZFN de 224,2%, superior à dos conjuntos dois e três e muito acima do limiar de seleção, que é 50% do controle interno positivo. Portanto, o conjunto um foi selecionado para experimentos de validação in vitro; o RNA mensageiro do conjunto um foi microinjetado em 35 embriões de coelho.A taxa de BL do grupo microinjetado pareceu menor em comparação com os que não foram microinjetados, indicando uma competência de desenvolvimento ligeiramente prejudicada. Dezoito embriões do grupo microinjetado desenvolveram-se até a fase de BL no quinto dia, dos quais 16 foram sequenciados. A frequência de quatro mutações no local-alvo foi muito maior que o limite de seleção, revelando que o par de ZFN definido foi eficaz em um total de 145 embriões.Coelhos microinjetados com o conjunto um de mRNA de ZFN foram transferidos para sete coelhas pseudográvidas receptoras. Embriões recém-lavados sem microinjeção de ZFN foram transferidos para receptoras como grupo controle após 30 dias de gestação. Vinte e uma crias nasceram no grupo microinjetado.O sequenciamento por PCR identificou cinco como knockouts positivos. As inserções e deleções no local de direcionamento incluíram duas inserções e três deleções. A análise bioinformática foi utilizada para identificar possíveis alvos fora do alvo dos ZFN com sete ou menos incompatibilidades em relação à sequência definida um; apenas um possível local fora do alvo foi identificado, e a PCR não detectou eventos nesse local em nenhum dos animais fundadores.Assista a este vídeo. Você deverá ter um bom entendimento de como produzir coelhos knockout por meio da microinjeção de nucleotídeos de zinco.Uma vez dominada a coleta de embriões, a microinjeção e a transferência podem ser realizadas em quatro horas, se forem executadas corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o material de injeção é RNA, o que exige precaução adicional. Após este procedimento, será realizada a fenotipagem para compreender as regras biológicas dos genes-alvo.

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