A Light Novel danos Paradigma para uso em estudos de regeneração da retina em Zebrafish Adulto
24 de outubro de 2013
Vários protocolos de danos provocados pela luz têm sido descritas para fotorreceptores danos e, consequentemente, induzir uma resposta de regeneração da retina adulta em peixes-zebra. Este protocolo descreve um método melhorado, que pode ser utilizada em animais e pigmentados que danifica a grande maioria dos fotorreceptores cone e da haste ao longo de toda a retina.
O objetivo geral deste procedimento é combinar dois protocolos de degeneração retiniana induzida por luz descritos anteriormente, a fim de danificar os fotorreceptores de bastonetes e cones em toda a retina. Isso é feito expondo primeiro o peixe-zebra adulto adaptado ao escuro à luz ultravioleta por 30 minutos. O segundo passo é transferir imediatamente os peixes tratados com UV para tanques cercados por quatro lâmpadas halógenas de 250 watts e expor os peixes à luz contínua por até quatro dias.
A etapa final é sacrificar o peixe e nuclear os olhos para análise posterior. Em última análise, a microscopia de imunofluorescência é usada para mostrar perda consistente de fotorreceptores de bastonetes e cones em toda a retina. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como um tratamento com luz ultravioleta ou tratamento semelhante a uma lâmpada halógena, é que a combinação desses dois métodos resulta na ablação de fotorreceptores de bastonetes e cones em toda a retina.
Danos aos fotorreceptores induzem uma resposta de proliferação generalizada que, em última análise, resulta na regeneração dos fotorreceptores de perda. Demonstrando essa técnica estará Jennifer Thomas, uma estudante de pós-graduação em meu laboratório. Para começar, use uma placa de Petri de vidro invertida de 15 centímetros de diâmetro para usar como suporte e cole-a na bancada do laboratório para exposição à luz ultravioleta.
Remova o filamento de luz UV do microscópio estéreo fluorescente. Em seguida, cole o filamento de luz UV acima da placa de Petri invertida e deixe cerca de dois milímetros da extremidade do filamento pender sobre a placa de Petri. Depois disso, cubra metade dos lados inferiores e da parte de trás de um copo de vidro de 250 mililitros com papel alumínio e certifique-se de que o lado brilhante do papel alumínio esteja voltado para o interior do copo.
Em seguida, encha o béquer com 100 mililitros de água do sistema de instalação de peixes. Coloque este copo em um copo de quatro litros. Em seguida, encha o copo de quatro litros com água até que o nível da água esteja nivelado com a linha d'água de 100 mililitros no copo de 250 mililitros.
Com um máximo de 10 peixes tratados escuros para o copo de 250 mililitros, cobriu o copo de 250 mililitros com um pequeno pedaço de papel alumínio. Em seguida, coloque todo o aparelho do béquer imediatamente adjacente ao filamento UV. O filamento deve tocar a parte externa do copo de quatro litros e ficar voltado para a parte exposta do copo de 250 mililitros.
Certifique-se de que o copo de 250 mililitros esteja centralizado na parte inferior do copo de quatro litros. Depois, posicione uma grande tela opaca atrás do copo de quatro litros, o que permite que os animais sejam expostos, mas impede que qualquer pessoal do laboratório veja a ponta do filamento UV. Em seguida, ligue a fonte de alimentação UV.
Ajuste o cronômetro para 30 minutos e coloque as etiquetas de advertência necessárias para garantir que o pessoal do laboratório desavisado não se exponha acidentalmente à radiação UV. Após 30 minutos, desligue a fonte de alimentação UV. Em seguida, retire o copo de 250 mililitros com o peixe.
Neste procedimento, transfira o peixe do copo de 250 mililitros para um aquário de acrílico transparente de 1,8 litro. Em seguida, encha o tanque até a marca de transbordamento para configurar a área de tratamento de luz da lâmpada halógena. Coloque duas lâmpadas halógenas na mesma direção e a 29 centímetros de distância do tanque.
Em seguida, coloque as outras duas lâmpadas de maneira semelhante no lado oposto, deixando cerca de 73 centímetros entre os dois conjuntos de lâmpadas. Depois disso, coloque o ventilador equidistante entre os dois conjuntos de lâmpadas fora da área de tratamento de luz. Em seguida, coloque dois tanques de 1,8 litro cheios de água no centro da área de tratamento de luz, equidistantes entre os dois conjuntos de lâmpadas.
Em seguida, coloque um aerador de oxigênio em cada tanque. Cubra cada tanque com tampas de acrílico transparente, deixando um espaço de dois centímetros na extremidade mais próxima do ventilador. Organize o ventilador de forma que ele sopre ar nessa lacuna e coloque um termômetro em um ou ambos os tanques.
Em seguida, ligue a energia das luzes, ventilador e arejadores. Mantenha o tratamento leve por até quatro dias. Os peixes não devem ser alimentados durante o tratamento com luz, pois isso afetará a qualidade da água e resultará em mais estresse para os animais.
Monitore a temperatura e o nível da água diariamente e mantenha a temperatura entre 30 e 33 graus Celsius. Se necessário, ajuste a velocidade do ventilador a distância entre os tanques e as luzes. Encha também cada tanque com água do sistema diariamente.
48 horas após o início do tratamento com luz halógena, remova os peixes da área de tratamento. Em seguida, prepare etanol fresco formal para esconder fixador eutanasiar o peixe-zebra com uma overdose anestésica de tuen oxietanol. Depois disso, transfira o peixe-zebra sacrificado para uma toalha de papel e, em seguida, nuclee o olho usando uma pinça curva.
Mantenha os olhos nucleados e o fixador durante a noite a quatro graus Celsius para crio. Proteja os olhos. Lave-os em 5% de sacarose um XPBS por 30 minutos em temperatura ambiente.
Em seguida, substitua-o por um XPBS fresco de 5% de sacarose e mantenha os olhos por duas horas. Após duas horas, lave os olhos em sacarose a 30%, um XPBS durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, lave os olhos em um lenço um-para-um, meio de congelamento e 30% de sacarose, uma solução XPBS durante a noite a quatro graus Celsius.
Em seguida, incorpore os olhos em meio de congelamento de tecido 100% orientado no eixo ventral dorsal. Em seguida, armazene-os a 80 graus Celsius negativos por pelo menos duas horas antes de criosseccionar o tecido. Agora criocorte o tecido e coloque-o em lâminas de vidro.
Em seguida, aqueça as lâminas por duas horas a 55 graus Celsius. Depois disso, armazene as lâminas a menos 80 graus Celsius ou execute imediatamente a imuno-histoquímica padrão e a imagem com microscopia fluorescente. Esta figura mostra as mudanças na resposta à proliferação seguindo vários paradigmas de danos à luz.
Aqui estão as seções da retina de um peixe-zebra albino adulto, imunomarcado com PCNA para mostrar a proliferação celular indicada em vermelho nas metades dorsal e ventral da retina seguindo diferentes paradigmas de danos causados pela luz em zero horas. A proliferação estava ausente da camada interclear em 48 HLT. Células progenitoras únicas estavam presentes no INL através da retina dorsal e em uma pequena porção da retina ventral.
Em 48 HPUV. Colunas de células progenitoras estavam presentes na retina dorsal, enquanto apenas células progenitoras únicas estavam presentes em uma pequena porção da retina ventral. Em UV mais 48, grandes colunas de células progenitoras estavam presentes na retina dorsal e ventral.
Esta figura mostra a perda de fotorreceptores de bastonetes e cones em peixes-zebra pigmentados seguindo vários paradigmas de danos causados pela luz. Aqui estão as seções da retina coradas com para Pro três para mostrar os núcleos em azul e imunomarcadas com zpr R três para mostrar segmentos externos de bastonetes em magenta ou zpr R um para mostrar cones duplos em ouro seguindo cada um dos paradigmas de danos à luz. Diminuições significativas nos núcleos fotorreceptores de bastonetes estavam presentes na retina dorsal em 48 HLT e na retina dorsal e ventral em UV mais 48 HLT.
Embora os núcleos estivessem hipertrofiados na retina dorsal em 48 HPUV, nenhuma diminuição significativa nos núcleos de cone duplo estava presente em 48 HLT ou 48 HPUV. Diminuições significativas nos núcleos estavam presentes na retina dorsal e ventral em UB mais oito H lt. A combinação deste procedimento com outros métodos, como inibidores farmacológicos específicos de genes ou knockdown de proteínas in vivo, pode revelar o papel de genes individuais e a degeneração dos fotorreceptores e a subsequente resposta de regeneração.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método aprimorado para induzir degeneração retiniana em peixes-zebra adultos, danificando os fotorreceptores bastonetes e cones. A técnica combina exposição à luz UV com tratamento contínuo de luz para provocar perda extensa de fotorreceptores em toda a retina.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Regeneração Retiniana
- Biologia dos Fotorreceptores
Antecedentes
- Os fotorreceptores são cruciais para a visão e seu dano pode levar a um comprometimento visual significativo.
- O peixe-zebra é um modelo valioso para o estudo da regeneração retiniana devido às suas capacidades regenerativas.
- Os métodos existentes para induzir dano retiniano apresentam limitações em sua eficácia.
- Este estudo tem como objetivo aprimorar os métodos para uma ablação mais eficaz dos fotorreceptores.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo confiável para induzir degeneração retiniana em peixes-zebra.
- Garantir danos aos fotorreceptores de bastonetes e cones.
- Facilitar análises adicionais dos mecanismos de regeneração retiniana.
Métodos Utilizados
- Peixes-zebra adultos adaptados à escuridão são expostos à luz UV por 30 minutos.
- Em seguida, os peixes são transferidos para tanques com lâmpadas de halogênio para exposição contínua à luz por até quatro dias.
- Após a exposição, os peixes são eutanasiados e os olhos são enucleados para análise.
- A microscopia de imunofluorescência é empregada para avaliar a perda de fotorreceptores.
Principais Resultados
- Observou-se perda consistente dos fotorreceptores de bastonetes e cones em toda a retina.
- O método combinado de exposição à luz mostrou-se mais eficaz do que protocolos anteriores.
- Essa técnica permite uma análise abrangente da degeneração e regeneração retiniana.
- Os resultados apoiam o uso desse método em estudos futuros de biologia retiniana.
Conclusões
- O protocolo aprimorado danifica com sucesso ambos os tipos de fotorreceptores.
- Este método pode ser utilizado em diversos estudos relacionados à regeneração retiniana.
- Pesquisas futuras podem se basear nestes achados para explorar abordagens terapêuticas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo aborda um desafio fundamental na pesquisa de regeneração da retina ao permitir a ablação consistente dos fotorreceptores bastão e cone em peixes-zebra adultos, um modelo com alta relevância translacional para doenças retinianas humanas. A abordagem combinada de luz UV e halogênio melhora a confiança preditiva em estudos mecanicistas ao reduzir a variabilidade no grau de degeneração, apoiando uma validação de alvos mais confiável e a investigação de vias moleculares. Isso posiciona o método como uma ferramenta escalável para reduzir riscos nos esforços iniciais de descoberta em estratégias de reparo de fotorreceptores.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a indução de perda ampla e reprodutível de fotorreceptores para estudar mecanismos de regeneração.
- Valor Operacional: Fornece um paradigma padronizado de degeneração que permite a quantificação consistente da resposta de progenitores entre experimentos.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiança em estudos de engajamento de alvos ao garantir que tanto as vias de bastonetes quanto de cones sejam afetadas de maneira uniforme.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera uma leitura quantificável de degeneração-regeneração compatível com ensaios baseados em imunofluorescência de proliferação e marcadores de fotorreceptores.
- Valor Operacional: Apoia a padronização de ensaios por meio de parâmetros definidos de exposição à luz (30 min de UV + até 4 dias de halogênio), aplicáveis a linhagens pigmentadas e albinas.
- Escalabilidade: Elimina a necessidade de linhagens albinas transgênicas, permitindo o uso em fundos genéticos diversos ou modelos de doenças.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Relaciona a indução da degeneração com resultados mensuráveis de regeneração, apoiando a avaliação pré-clínica de compostos pró-regenerativos.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite a combinação com inibidores ou silenciamentos gênicos específicos para dissecar o papel individual de genes na degeneração e reparo.
- Confiabilidade Preditiva: Permite análise dependente de dose e tempo da proliferação de progenitores e da reorganização de fotorreceptores para otimização de compostos líderes.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se na fase inicial da descoberta, servindo como um modelo padronizado de lesão para iniciar estudos de regeneração antes de triagens de compostos ou esforços de validação de alvos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre vias de degeneração de fotorreceptores e ativação de progenitores mediada por gliócitos.
- Triagem: Gera resultados quantificáveis (por exemplo, progenitores PCNA+, perda de marcadores de fotorreceptores) para avaliação do efeito de compostos.
- Análises: Permite comparar a extensão da degeneração e a cinética de regeneração entre diferentes condições por meio de microscopia de imunofluorescência.
- Pesquisa Translacional: Relaciona-se com estudos pré-clínicos ao modelar processos de perda e reparo de fotorreceptores relevantes ao ser humano.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma de degeneração reutilizável, aplicável em múltiplos projetos voltados à reparação da retina.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista por meio da ablação consistente e pan-fotorreceptora.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio da padronização da exposição à luz e de controles ambientais (temperatura, qualidade da água, alimentação).
- Valor Estratégico: Aumenta a confiabilidade das decisões de avanço ou interrupção do projeto ao minimizar o ruído biológico nas leituras de regeneração.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos com base na eficácia de regeneração em um sistema validado e relevante para a doença.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em manejo de peixe-zebra, protocolos de segurança com luz e processamento de tecidos para crioseção.
- Necessita de fonte de luz UV, lâmpadas de halogênio, tanques com controle de temperatura e infraestrutura para microscopia de imunofluorescência.
- Exige padronização da adaptação à escuridão, duração da exposição à luz e monitoramento ambiental entre as equipes.
- Deve levar em conta a sensibilidade à luz específica da espécie ao adaptar-se a outros modelos.
- Limitado pela necessidade de adaptação à escuridão e configuração de equipamentos especializados, embora apoiado por orientações procedimentais detalhadas.
