A Light Novel danos Paradigma para uso em estudos de regeneração da retina em Zebrafish Adulto
24 de outubro de 2013
Vários protocolos de danos provocados pela luz têm sido descritas para fotorreceptores danos e, consequentemente, induzir uma resposta de regeneração da retina adulta em peixes-zebra. Este protocolo descreve um método melhorado, que pode ser utilizada em animais e pigmentados que danifica a grande maioria dos fotorreceptores cone e da haste ao longo de toda a retina.
O objetivo geral deste procedimento é combinar dois protocolos previamente descritos de degeneração retiniana induzida por luz, a fim de danificar tanto os fotorreceptores bastão quanto os cônicos em toda a retina. Isso é realizado primeiramente expondo peixes-zebra adultos adaptados à escuridão à luz ultravioleta por 30 minutos. O segundo passo consiste em transferir imediatamente os peixes tratados com UV para tanques cercados por quatro lâmpadas halógenas de 250 watts e expor os peixes à luz contínua por até quatro dias.
O passo final é eutanasiar o peixe e nucleotomizar os olhos para análises posteriores. Em última instância, a microscopia de imunofluorescência é utilizada para demonstrar a perda consistente dos fotorreceptores de bastonetes e cones em toda a retina. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o tratamento com luz UV ou com lâmpada de halogênio, é que a combinação desses dois métodos resulta na ablação dos fotorreceptores de bastonetes e cones em toda a retina.
A lesão nos fotorreceptores induz uma resposta proliferativa generalizada que, em última instância, resulta na regeneração dos fotorreceptores perdidos. Demonstrará esta técnica Jennifer Thomas, aluna de pós-graduação no meu laboratório. Para começar, utilize um recipiente de vidro de diâmetro de 15 centímetros em posição invertida como suporte e fixe-o à bancada com fita adesiva para exposição à luz ultravioleta.
Remova o filamento de luz UV do microscópio estéreo fluorescente. Em seguida, fixe com fita o filamento de luz UV acima da placa de Petri invertida, deixando cerca de dois milímetros da extremidade do filamento saliente em relação à placa de Petri. Depois disso, cubra metade das laterais inferiores e a parte traseira de um béquer de vidro de 250 mililitros com papel alumínio, garantindo que o lado brilhante do papel fique voltado para o interior do béquer.
Em seguida, encha o béquer com 100 mililitros de água do sistema da instalação para peixes. Coloque este béquer dentro de um béquer de quatro litros. Depois, encha o béquer de quatro litros com água até que o nível da água fique alinhado com a marca de 100 mililitros no béquer de 250 mililitros.
No máximo, coloque 10 peixes tratados no escuro no béquer de 250 mililitros e cubra o béquer de 250 mililitros com um pequeno pedaço de papel alumínio. Em seguida, posicione todo o conjunto do béquer imediatamente adjacente ao filamento de UV. O filamento deve estar tocando a parte externa do béquer de quatro litros e voltado para a porção exposta do béquer de 250 mililitros.
Certifique-se de que o béquer de 250 mililitros esteja centralizado na parte inferior do béquer de quatro litros. Em seguida, posicione uma tela opaca grande atrás do béquer de quatro litros, de modo que os animais sejam expostos, mas impeça qualquer membro da equipe do laboratório de ver a extremidade do filamento de UV. Em seguida, ligue a fonte de energia de UV.
Defina o temporizador para 30 minutos e coloque rótulos de advertência necessários para garantir que funcionários do laboratório desprevenidos não se exponham acidentalmente à radiação UV. Após 30 minutos, desligue a fonte de energia UV. Em seguida, remova o béquer de 250 mililitros com os peixes.
Neste procedimento, transfira o peixe do béquer de 250 mililitros para um aquário de acrílico transparente de 1,8 litro. Em seguida, encha o aquário até a marca de transbordamento para montar a área de tratamento com luz de lâmpada de halogênio. Posicione duas lâmpadas utilitárias de halogênio de 250 watts na mesma direção e a 29 centímetros de distância do aquário.
Em seguida, posicione os outros dois holofotes de maneira semelhante no lado oposto, deixando cerca de 73 centímetros entre os dois conjuntos de holofotes. Depois disso, coloque o ventilador a uma distância equidistante entre os dois conjuntos de holofotes, logo fora da área de tratamento luminoso. Posteriormente, posicione dois tanques de 1,8 litro cheios de água no centro da área de tratamento luminoso, equidistantes entre os dois conjuntos de holofotes.
Em seguida, coloque um aerador de oxigênio em cada tanque. Cubra cada tanque com tampas de acrílico transparente, deixando uma abertura de dois centímetros na extremidade mais próxima do ventilador. Posicione o ventilador de modo que ele sopre ar nessa abertura e coloque um termômetro em um ou ambos os tanques.
Em seguida, ligue a energia dos ventiladores das luzes e dos aeradores. Mantenha o tratamento com luz por até quatro dias. Os peixes não devem ser alimentados durante o tratamento com luz, pois isso afetará a qualidade da água e resultará em maior estresse para os animais.
Monitore diariamente a temperatura e o nível da água e mantenha a temperatura entre 30 e 33 graus Celsius. Se necessário, ajuste a velocidade do ventilador e a distância entre os tanques e as luzes. Além disso, encha cada tanque com água do sistema diariamente.
48 horas após o início do tratamento com luz halógena, remova os peixes da área de tratamento. Em seguida, prepare etanol formal fresco para fixação e eutanizie os peixes-zebra com uma sobredosagem anestésica de etoxi-etanol. Depois disso, transfira os peixes-zebra eutanasiados para uma toalha de papel e, então, enucleie o olho utilizando um par de pinças curvas.
Mantenha os olhos nucleados e o fixador durante a noite a quatro graus Celsius para criopreservação. Proteja os olhos. Lave-os em sacarose 5% em PBS uma vez por 30 minutos à temperatura ambiente.
Em seguida, substitua-o por sacarose a 5% em PBS 1X fresco e mantenha os olhos por duas horas. Após duas horas, lave os olhos em sacarose a 30% em PBS 1X durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, lave os olhos em uma proporção de um para um de meio de congelamento e solução de sacarose a 30% em PBS 1X durante a noite a quatro graus Celsius.
Posteriormente, embutir os olhos em meio de congelamento para tecidos a 100%, orientados no eixo dorsal-ventral. Em seguida, armazená-los a menos 80 graus Celsius por pelo menos duas horas antes de realizar o corte criostático do tecido. Agora, realizar o corte criostático do tecido e colocá-lo em lâminas de vidro.
Em seguida, aqueça as lâminas por duas horas a 55 graus Celsius. Após isso, armazene as lâminas a menos 80 graus Celsius ou realize imediatamente a imuno-histoquímica padrão e visualize com microscopia fluorescente. Esta figura mostra as alterações na resposta de proliferação após diversos paradigmas de dano luminoso.
Aqui estão as seções da retina de um peixe-zebra albino adulto, imunomarcadas com PCNA para mostrar a proliferação celular indicada em vermelho nas metades dorsal e ventral da retina após diferentes paradigmas de dano luminoso em zero hora. A proliferação estava ausente na camada intercalar em 48 HLT. Células progenitoras únicas estavam presentes na LIN ao longo da retina dorsal e em uma pequena porção da retina ventral.
Em 48 HPUV. Colunas de células progenitoras estavam presentes na retina dorsal, enquanto apenas células progenitoras isoladas estavam presentes em uma pequena porção da retina ventral. Em UV mais 48, grandes colunas de células progenitoras estavam presentes em toda a retina dorsal e ventral.
Esta figura mostra a perda de fotorreceptores bastão e cone em peixes-zebra pigmentados após vários paradigmas de dano luminoso. Abaixo, cortes retinianos corados com Pro três para evidenciar os núcleos em azul e imunomarcados com zpr R três para mostrar os segmentos externos dos bastões em magenta ou com zpr R um para mostrar cones duplos em dourado, após cada um dos paradigmas de dano luminoso. Reduções significativas no número de núcleos de fotorreceptores bastão estavam presentes na retina dorsal em 48 HLT e nas regiões dorsal e ventral da retina em UV mais 48 HLT.
Embora os núcleos estivessem hipertrofiados na retina dorsal em 48 HPUV, não foram observadas diminuições significativas nos núcleos de cones duplos em 48 HLT ou 48 HPUV. Diminuições significativas nos núcleos estavam presentes nas regiões dorsal e ventral da retina em UB mais oito H lt. A combinação deste procedimento com outros métodos, como inibidores farmacológicos específicos para genes ou silenciamento de proteínas in vivo, pode revelar o papel de genes individuais na degeneração de fotorreceptores e na resposta subsequente de regeneração.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método aprimorado para induzir degeneração retiniana em peixes-zebra adultos, danificando os fotorreceptores bastonetes e cones. A técnica combina exposição à luz UV com tratamento contínuo de luz para provocar perda extensa de fotorreceptores em toda a retina.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Regeneração Retiniana
- Biologia dos Fotorreceptores
Antecedentes
- Os fotorreceptores são cruciais para a visão e seu dano pode levar a um comprometimento visual significativo.
- O peixe-zebra é um modelo valioso para o estudo da regeneração retiniana devido às suas capacidades regenerativas.
- Os métodos existentes para induzir dano retiniano apresentam limitações em sua eficácia.
- Este estudo tem como objetivo aprimorar os métodos para uma ablação mais eficaz dos fotorreceptores.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo confiável para induzir degeneração retiniana em peixes-zebra.
- Garantir danos aos fotorreceptores de bastonetes e cones.
- Facilitar análises adicionais dos mecanismos de regeneração retiniana.
Métodos Utilizados
- Peixes-zebra adultos adaptados à escuridão são expostos à luz UV por 30 minutos.
- Em seguida, os peixes são transferidos para tanques com lâmpadas de halogênio para exposição contínua à luz por até quatro dias.
- Após a exposição, os peixes são eutanasiados e os olhos são enucleados para análise.
- A microscopia de imunofluorescência é empregada para avaliar a perda de fotorreceptores.
Principais Resultados
- Observou-se perda consistente dos fotorreceptores de bastonetes e cones em toda a retina.
- O método combinado de exposição à luz mostrou-se mais eficaz do que protocolos anteriores.
- Essa técnica permite uma análise abrangente da degeneração e regeneração retiniana.
- Os resultados apoiam o uso desse método em estudos futuros de biologia retiniana.
Conclusões
- O protocolo aprimorado danifica com sucesso ambos os tipos de fotorreceptores.
- Este método pode ser utilizado em diversos estudos relacionados à regeneração retiniana.
- Pesquisas futuras podem se basear nestes achados para explorar abordagens terapêuticas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo aborda um desafio fundamental na pesquisa de regeneração da retina ao permitir a ablação consistente dos fotorreceptores bastão e cone em peixes-zebra adultos, um modelo com alta relevância translacional para doenças retinianas humanas. A abordagem combinada de luz UV e halogênio melhora a confiança preditiva em estudos mecanicistas ao reduzir a variabilidade no grau de degeneração, apoiando uma validação de alvos mais confiável e a investigação de vias moleculares. Isso posiciona o método como uma ferramenta escalável para reduzir riscos nos esforços iniciais de descoberta em estratégias de reparo de fotorreceptores.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a indução de perda ampla e reprodutível de fotorreceptores para estudar mecanismos de regeneração.
- Valor Operacional: Fornece um paradigma padronizado de degeneração que permite a quantificação consistente da resposta de progenitores entre experimentos.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiança em estudos de engajamento de alvos ao garantir que tanto as vias de bastonetes quanto de cones sejam afetadas de maneira uniforme.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera uma leitura quantificável de degeneração-regeneração compatível com ensaios baseados em imunofluorescência de proliferação e marcadores de fotorreceptores.
- Valor Operacional: Apoia a padronização de ensaios por meio de parâmetros definidos de exposição à luz (30 min de UV + até 4 dias de halogênio), aplicáveis a linhagens pigmentadas e albinas.
- Escalabilidade: Elimina a necessidade de linhagens albinas transgênicas, permitindo o uso em fundos genéticos diversos ou modelos de doenças.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Relaciona a indução da degeneração com resultados mensuráveis de regeneração, apoiando a avaliação pré-clínica de compostos pró-regenerativos.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite a combinação com inibidores ou silenciamentos gênicos específicos para dissecar o papel individual de genes na degeneração e reparo.
- Confiabilidade Preditiva: Permite análise dependente de dose e tempo da proliferação de progenitores e da reorganização de fotorreceptores para otimização de compostos líderes.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se na fase inicial da descoberta, servindo como um modelo padronizado de lesão para iniciar estudos de regeneração antes de triagens de compostos ou esforços de validação de alvos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre vias de degeneração de fotorreceptores e ativação de progenitores mediada por gliócitos.
- Triagem: Gera resultados quantificáveis (por exemplo, progenitores PCNA+, perda de marcadores de fotorreceptores) para avaliação do efeito de compostos.
- Análises: Permite comparar a extensão da degeneração e a cinética de regeneração entre diferentes condições por meio de microscopia de imunofluorescência.
- Pesquisa Translacional: Relaciona-se com estudos pré-clínicos ao modelar processos de perda e reparo de fotorreceptores relevantes ao ser humano.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma de degeneração reutilizável, aplicável em múltiplos projetos voltados à reparação da retina.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista por meio da ablação consistente e pan-fotorreceptora.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio da padronização da exposição à luz e de controles ambientais (temperatura, qualidade da água, alimentação).
- Valor Estratégico: Aumenta a confiabilidade das decisões de avanço ou interrupção do projeto ao minimizar o ruído biológico nas leituras de regeneração.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos com base na eficácia de regeneração em um sistema validado e relevante para a doença.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em manejo de peixe-zebra, protocolos de segurança com luz e processamento de tecidos para crioseção.
- Necessita de fonte de luz UV, lâmpadas de halogênio, tanques com controle de temperatura e infraestrutura para microscopia de imunofluorescência.
- Exige padronização da adaptação à escuridão, duração da exposição à luz e monitoramento ambiental entre as equipes.
- Deve levar em conta a sensibilidade à luz específica da espécie ao adaptar-se a outros modelos.
- Limitado pela necessidade de adaptação à escuridão e configuração de equipamentos especializados, embora apoiado por orientações procedimentais detalhadas.
