Expressão da Funcionais recombinante hemaglutinina ea neuraminidase Proteínas do vírus Influenza H7N9 Novel usando a expressão Sistema de Baculovirus

O objetivo geral deste procedimento é gerar glicoproteína de superfície purificada corretamente dobrada para influenza, hemaglutinina e neuraminidase para ensaios imunológicos e experimentos de vacinação. Isso é feito primeiro clonando o BMid recombinante que carrega genes influenza, seguido pela geração de vírus baula recombinantes. O segundo passo é usar esses vírus baula recombinantes para expressar as proteínas hemaglutinina e neuraminidase em células de insetos.

Em seguida, as proteínas recombinantes são purificadas do sobrenadante da cultura de células usando cromatografia de afinidade. A etapa final é caracterizar essas proteínas para garantir boa qualidade e funcionalidade biológica. Em última análise, as proteínas recombinantes são usadas para investigar as respostas imunes às glicoproteínas de superfície do vírus influenza.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a expressão bacteriana do HA, por exemplo, é que os antígenos purificados são dobrados corretivamente e também permanecem biologicamente ativos, ao contrário do uso de preparações de vírus inteiros para ensaios imunológicos. Esses reagentes permitem medir as respostas imunes contra as proteínas hemaglutinina e não neuraminidase. Inicie este protocolo apenas com a geração do vírus baula recombinante conforme descrito no protocolo de texto trabalhando assepticamente em uma placa de capela de fluxo laminar, SF nove células de insetos em seis placas de poços a uma densidade de 200.000 células por centímetro quadrado.

E vamos sentar por 20 minutos em uma incubadora de 28 graus Celsius sem CO2. Em seguida, misture dois microgramas de recombinante back mid com 100 microlitros de Trico Leia formulação de meio de joelho HINK ou TNM fh. Em seguida, misture seis microlitros do agente de transfecção com 100 microlitros de meio de inseto TNM FH.

Combine os dois volumes, misture delicadamente e deixe a mistura de transfecção descansar por 20 minutos. À temperatura ambiente, inclua uma transfecção simulada como controle, que contém o reagente de transfecção, mas nenhum DNA. Remova o SNAT das nove células SF plaqueadas e substitua por dois mililitros de meio TNM FH livre de soro contendo solução de estreptomicina de penicilina a 1%.

Adicione o volume completo da mistura de transfecção às células e balance a placa de seis poços com cuidado por cinco segundos. Incubar em uma incubadora de 28 graus Celsius sem CO2 por seis horas. Substitua o meio por um novo meio TNM FH completo antes de incubar a placa nas mesmas condições por seis dias.

Verifique as células ocasionalmente ao microscópio. As células infectadas geralmente parecem maiores. Os núcleos mais redondos aumentaram e começam a se desprender.

Colher células seis dias após a transfecção por centrifugação a 2000 G por cinco minutos em temperatura ambiente. O sobrenadante contém o vírus baula recombinante e será usado para gerar estoques de trabalho imediatamente, ou pode ser armazenado a quatro graus Celsius por anos. Verificar a expressão proteica através da página SDS e western blot e preparar as matérias-primas de trabalho conforme descrito no protocolo de texto.

As células SF nove suportam muito bem o crescimento do vírus macular. No entanto, sua capacidade de secretar grandes quantidades de proteína recombinante é limitada. Portanto, usamos outra linha de células de insetos.

Cinco células para a expressão de proteínas recombinantes secretadas. Essas células não suportam o crescimento do vírus balo com altos títulos, mas têm uma capacidade secretora muito alta. Cultive cinco células em meio de cultura de células de insetos SFX em T 175 centímetro quadrado frascos de passagem a cada dois dias.

Dividindo-os em uma proporção de um para três. Cultive cinco frascos confluentes para uma cultura de expressão de 200 mililitros para colher e infectar as cinco células altas. Primeiro, desconecte as células high five batendo nos frascos.

Recolha a suspensão celular e transfira para tubos de centrifugação de 50 mililitros. Gire os tubos a 1200 G por sete minutos em temperatura ambiente. Retirar o sobrenadante por decantação e unir os pellets por resus, suspendendo-os em 15 mililitros de P três.

Deixe as células descansarem por 15 minutos na coifa. Transfira 200 mililitros de meio de cultura SFX de alto clone para um frasco agitador limpo e estéril de 1000 mililitros. Em seguida, transfira a suspensão de três células P para o selo do frasco agitador com papel alumínio estéril antes de agitar a 70 RPM e 28 graus Celsius por 72 a 96 horas.

Colher proteína recombinante de sobrenadantes de expressão celular high five 72 a 96 horas após a infecção. Transfira os sobrenadantes da cultura para baldes de centrifugação de 500 mililitros. Gire a 5.500 G por 20 minutos a quatro graus Celsius.

Entretanto, lavar o balão agitador três vezes com água bidestilada Próxima pipeta. Três mililitros de pasta de resina de níquel em um tubo de 50 mililitros com 45 mililitros de PBS por 200 mililitros de cultura.

Agite bem antes de centrifugar por 10 minutos a 3000 G e temperatura ambiente após centrifugação. Transvase o PBS e guarde o pellet. Misturar o sobrenadante de células de insectos com o sedimento de resina de níquel e transferir para os balões agitadores já lavados.

Incube a quatro graus Celsius por duas a quatro horas enquanto agita. Em seguida, monte uma coluna de polipropileno de 10 mililitros em uma braçadeira em um suporte de suporte. Remova as duas tampas e coloque um béquer abaixo da coluna para coletar o fluxo.

Após a incubação do balão agitador, começar a transferir a mistura de pasta sobrenadante para a coluna. Ele reterá a resina de níquel e apenas o sobrenadante fluirá. Passe todo o volume sobre a coluna.

Lave a resina quatro vezes com 15 mililitros de tampão de lavagem. Deixe o tampão de lavagem escorrer da coluna e feche o lado inferior com a tampa. Adicione dois mililitros de tampão eluciano e vamos descansar por cinco minutos.

Abra a coluna e recolha o eit, mantendo-o em gelo úmido sempre que possível. Repita isso mais três vezes. Um EIT que contém altas concentrações de proteína normalmente mostra espuma quando agitado para trocar o tampão e concentrar a proteína primeiro, unidades de centrifugação de ultrafiltração de 15 mililitros de rotação livre com PBS a 3000 G e quatro graus Celsius por 20 minutos.

Rejeitar o fluxo e colocar o EIT na coluna de centrifugação. Encha a coluna com cinco mililitros de PBS gelado estéril antes de girar nas mesmas condições por 60 minutos. Descarregue o fluxo novamente, reabasteça com 15 mililitros de PBS gelado e gire por mais 60 minutos.

Repita este procedimento mais uma vez e, em seguida, colete o concentrado trocado por tampão que representa a proteína recombinante altamente concentrada. Mantenha o foco no gelo o tempo todo. Enxágue a coluna giratória com 400 microlitros de PBS gelado estéril e adicione ao concentrado.

A proteína pode então ser caracterizada conforme descrito no protocolo de texto. As proteínas HA e NA expressas pelas cepas ENUE e Shanghai apresentaram níveis moderados de expressão variando de 0,2 miligramas por litro de cultura para influenza A coletada em Xangai a 0,7 miligramas por litro para influenza. A coletado em moléculas de enue, neuraminidase ou NA de ambas as cepas mostrou níveis moderados de expressão variando de 0,2 miligramas por litro de cultura para influenza A coletada em Xangai a 0,7 miligramas por litro para influenza A coletada em enue.

Todas as quatro preparações proteicas tinham muito pouca ou nenhuma impureza, sendo o ha de maior pureza do que o nas, o que pode ser explicado pelo nível de expressão. A gripe A coletada em Shanghai HA foi posteriormente analisada usando ELI SA com o anticorpo monoclonal humano reativo CR 9 1 1 4 amplamente neutralizante. Como mostrado aqui em azul, este anticorpo monoclonal se liga a um epítopo de confirmação sensível no domínio de estoque e é usado aqui como uma sonda para o dobramento correto deste domínio.

O anticorpo mostra boa ligação, como evidenciado pelo aumento da absorbância em 490 nanômetros, o que dá confiança de que o HA está realmente dobrado corretamente. Um segundo, Eliza com anti-hemaglutinina do soro policlonal de camundongo subtipo sete foi realizado para confirmar a identidade da proteína obtida como hemaglutinina de origem do subtipo sete. Depois de assistir a este vídeo, você tem uma boa compreensão de como expressar o vírus influenza recombinante, a hemaglutinina e as proteínas neuraminidase em seu laboratório.

Este processo também pode ser útil para a expressão de outras proteínas virais ou de membrana celular. Desejo-lhe boa sorte com seus experimentos.