Name: Expressão da Funcionais recombinante hemaglutinina ea neuraminidase Proteínas do vírus Influenza H7N9 Novel usando a expressão Sistema de Baculovirus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-06T23:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Aprenda a expressar hemaglutinina e neuraminidase funcionais do vírus influenza H7N9 usando o sistema de baculovírus em células de inseto. Este método permite obter proteínas corretamente dobradas para ensaios imunológicos.

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Gostaríamos de agradecer a Patrick C. Wilson para monoclonal CR9114 anticorpo. Agradecemos também a Jennifer Debeauchamp e Richard Webby para os plasmídeos originais A/Anhui/1/13. Suporte parcial para este trabalho foi fornecido pelo Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas financiado Projeto Programa Bolsa AI097092-01A1 e CEIRS (Centros de Excelência para Pesquisa e Influenza Surveillance, HHSN26620070010C). FK foi apoiado por uma bolsa de Erwin Schrödinger (3232 J) do Fundo de Ciência Austríaco (FWF).

1. Geração de Baculovirus Recombinante <ol><li> A clonagem em baculovírus transferência plasmídeos <ol><li> Clone H7 HA e NA N9 ectodomínio (ou qualquer outro gene de HA ou NA), em plasmídeos de transferência pFastBac modificados (ver introdução). Vectores de HA contendo um domínio de trimerização C-terminal e uma etiqueta de hexa-histidina, assim como para NA contendo um domínio N-terminal de tetramerização e tag hexa-histidina, foram descritos 1,10,11,22 (Figura 1) e pode ser pedido a partir de os autores. Nota explicativa: ectodomínios HA expressas sem um domínio de trimerização vai ser dobrado de forma incorrecta, levando à perda de epítopos de neutralização conformacionais, em especial no domínio do talo. Da mesma forma, a função enzimática NA invoca tetramerização adequada. </li><li> Geração de bacmids Transformação de transferência plasmídeos de baculovírus contendo genes HA e NA nas bactérias DH10Bac acordo com uma expressão de baculovírussistema de acordo com as instruções do fabricante. Isolar e purificar bacmids usando um kit Midiprep de acordo com as instruções do fabricante (Figura 2). </li></ol></li><li> Resgate de baculovírus recombinante e verificação da expressão de proteínas Nota explicativa: Os seguintes passos têm de ser realizados assepticamente numa câmara de fluxo laminar. Execute este procedimento de forma independente para HA e NA (ou qualquer outro gene de interesse). As células de insecto são normalmente cultivadas a 28 ° C, sem CO2. Células Sf9 para este protocolo são cultivadas em meios completos de células de insecto TNM-FH suplementado com 10% FBS, 1% de Pen-Strep * e solução Pluronic F68 a 0,1%, se não for indicado de outra forma, e passadas a 1:04 duas vezes por semana. High Five de células são cultivadas em meio de soro livre SFX 1:15 e passadas duas vezes por semana. * A adição de antibióticos deve ser considerada opcional ao longo do protocolo e ajustado de acordo com as práticas utilizadas em cada laboratório. <ol><li> Placa de células de insecto Sf9 em placas de 6 poços a uma densidade de 2 x 10 5 células / cm 2 e deixar repousar durante 20 minutos, num incubador de 28 ° C (sem CO2). </li><li> Misture 2 mg (concentração de 0,5-2 mg / ul) de bacmídeo recombinante com 100 l de meio TNM-FH (sem soro, 1% Pen-Strep). Misture 6 l de agente de transfecção com 100 l de meio TNM-FH (soro livre, Pen-Strep). Combine os dois volumes, misture delicadamente e deixe descansar por 20 minutos em temperatura ambiente (mistura de transfecção). Incluir um pseudo-transfecção como controlo (Figura 3). </li><li> Remover o sobrenadante a partir de células Sf9 embutidas (células irá agora ficar com a placa) e substitua com 2 ml de meio isento de soro TNM-FH contendo Pen-Strep (1%). Adicionar o volume total da mistura de transfecção (a partir do passo 1.2.2) e agitar a placa de 6 poços cuidadosamente durante 5 segundos. Incubar numa incubadora de 28 ° C, sem CO 2 durante 6 horas (Figura 3). </li><li> Substitua wi mídiacompletas mídia TNM-FH fresco th (contendo 10% de FBS, 1% de Pen-Strep e 0,1% de Pluronic F68). Incubar numa incubadora de 28 ° C, sem CO 2 durante 6 dias. Verifique ocasionalmente células sob um microscópio. As células infectadas aparecem geralmente maior, mais redondo, ampliaram núcleos, e começar a separar (Figura 4). </li><li> Colheita das células e a confirmação da expressão da proteína <ol><li> Colheita de células 6 dias após a transfecção por centrifugação a 2000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. O sobrenadante contém o baculovirus recombinante - o que irá ser utilizado para gerar stocks de trabalho imediatamente, ou pode ser armazenado a 4 ° C durante anos. </li><li> Para verificar a expressão da proteína coletar pelotas e ressuspender em 500 mL de PBS. Misturar 50 ml da suspensão com 50 mL de tampão de carga de SDS-PAGE (contendo um agente de redução). Executar SDS-PAGE e efectuar uma análise de Western blot com um anticorpo anti-hexa-histidina para confirmar a expressão do gene. Incluir células do simuladotransfecção como controlos negativos (Figura 3). </li></ol></li><li> Elaboração de ações de trabalho <ol><li> Placa 5 x 10 5 células Sf9 / cm 2 em um frasco T175 cm 2 e deixe descansar por 20 min permitir que eles atribuem ao prato. Substitua completo mídia TNM-FH com a mídia TNM-FH contendo 3% FBS (e 1% Pen-Strep, 0,1% Pluronic F68). </li><li> Infectar as células com 100 ul do sobrenadante de resgate. Incubar numa incubadora de 28 ° C, sem CO 2, durante 6 dias e, ocasionalmente, se vá obter células infectadas (tal como descrito no passo 1.2.5.). </li><li> Gire a 2.000 xg à temperatura ambiente durante 5 minutos e recolher o sobrenadante. Este é agora o seu estoque P2. Este material pode ser armazenado indefinidamente a 4 ° C. Repita o procedimento de infecção usando 100 mL do estoque P2 para infectar as células. O material resultante é denominada P3 ou estoque de trabalho, que pode ser armazenado a 4 ° C ou utilizado directamente para a expressão da proteína. O estoque P3 geralmente contém 10 &lt;sup&gt; 7 a 10 9 unidades formadoras de placas / ml. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Protein Expression and Purification Nota explicativa: células Sf9 suportar o crescimento de baculovirus muito bem. No entanto, a sua capacidade para segregar grandes quantidades de proteína recombinante é limitada. Assim, utilizamos uma outra linha de células de insectos, células de High Five, para a expressão de proteínas recombinantes segregadas. Estas células não suportam a replicação de baculovírus para muito altos títulos 13, mas têm alta capacidade secretora. <ol><li> Crescendo High Five células Crescer High Five células em meio de cultura celular SFX inseto em T175 cm 2 frascos. Passagem a cada dois dias 01:03. Para uma cultura de 200 ml expressão que você vai precisar para crescer 5 frascos confluentes. </li><li> Colheita e infectar células High Five <ol><li> Retire High Five células de 5 cm 2 frascos T175 tocando os frascos com a mão. Recolher o suspe celularnsion e transferir para tubos de 50 ml de centrifugação. </li><li> Gire a 1.200 xg por 7 min à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante por decantação e unir as pelotas por ressuspensão em 15 ml de estoque P3. </li><li> Deixar repousar durante 15 minutos na câmara de fluxo (Figura 5). </li><li> Transferir 200 ml de Hyclone SFX meio de cultura em um, estéril 1000 ml frasco agitador limpo (sem Buffles, selado com folha de alumínio antes da autoclavagem, não deveria ter sido usado para culturas bacterianas antes). </li><li> Transferir a suspensão P3/cell para o balão agitador. Seal com folha de alumínio estéril e frasco de transferência num shaker. Agitar a 70 rpm a 28 ° C durante 72-96 horas. </li></ol></li><li> Colhendo proteína recombinante a partir de cinco altos sobrenadantes expressão celular <ol><li> 72-96 hr de transferência de sobrenadante de cultura de infecção pós em 500 ml baldes centrifugação. Gire a 5.500 xg por 20 min a 4 ° C. Entretanto lave os frascos shaker 3x com água bidestilada(DdH2O). </li><li> Transferência de 3 ml de resina Ni-lama para um tubo de 50 ml com 45 ml de PBS (uma necessária por 200 ml de cultura). Agitar bem e girar a 3000 xg à temperatura ambiente durante 10 min. Decantar o PBS e manter o sedimento. Mistura-se o sobrenadante de células de insecto com o sedimento de Ni-resina e transferir para os frascos de agitação já lavadas. Incubar a 4 ° C durante 2-4 horas, enquanto se agita (Figura 6). </li><li> Monte 10 ml coluna de polipropileno em um grampo em um suporte de apoio. Remova as duas tampas e coloque um copo abaixo da coluna para coletar o fluxo através (resíduos). Tomar o agitador rotativo para fora do agitador e começar a transferir a mistura do sobrenadante / pasta na coluna, que irá reter o Ni-resina e apenas o sobrenadante irá fluir. Passar todo o volume ao longo da coluna (Figura 7). </li><li> Lavar as resinas com 4x 15 ml de tampão de lavagem (50 mM de Na 2 HCO 3, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, pH 8). Vamos todos a fuga tampão de lavagema partir da coluna e fechá-lo com a tampa (lado inferior). </li><li> Adicionar 2 ml de tampão de eluição (50 mM de Na 2 HCO 3, NaCl 300 mM, 300 mM de imidazol, pH 8) e deixar repousar durante 5 min. Abra coluna e recolher o eluído. Repetir este procedimento mais três vezes (com um total de 8 ml de tampão de eluição). O eluato que contém elevadas concentrações de proteína apresenta tipicamente espuma quando agitadas (Figura 7). Mantenha eluato no gelo molhado sempre que possível. </li></ol></li><li> Troca e concentração do tampão <ol><li> Prespin 15 ml unidades de centrifugação (de ultrafiltração de 30 kDa de corte para HA / NA, mas pode variar dependendo do tamanho da proteína purificada) com PBS (pH 7,4-7,6) a 3000 xg, a 4 ° C durante 20 min. Descartar fluir através de e carga eluído na coluna rodada. Encha-se com 5 ml de estéril, gelada PBS e centrifugação por 60 minutos a 3.000 xg, a 4 ° C. </li><li> Fluxo de descarga através de novo, encha com 15 ml de PBS gelado e rotação por 60 minutos a 3.000 xg, a 4 ° C. Repita este procedimentoDure mais uma vez. </li><li> Tome a coluna girar fora da centrífuga e recolher o tampão trocado concentrado (tipicamente 200 mL). Isto é altamente concentrada de proteína recombinante. Lavar a coluna de spin com 400 l de estéril gelada PBS e adicione ao concentrado. Manter o concentrado em gelo em todos os momentos. </li></ol></li></ol> 3. Caracterização e Controle de Qualidade <ol><li> Medição de concentração de proteínas Tome uma alíquota do concentrado e medi-la usando o método de quantificação de proteínas de escolha. Definir a concentração de proteína a 1 mg / ml por adição de PBS e congelar pequenas alíquotas a -80 ° C. Ciclos de descongelamento Congelar prejudicar a estrutura da proteína e pode levar à agregação. </li><li> SDS-PAGE e coloração com Coomassie Executar 500 ng de sua proteína numa SDS-PAGE e efectuar uma coloração com Coomassie. Para a coloração rápida e conveniente utilizar o reagente de Coomassie, em combinação com um protocolo de micro-ondas. Proteínas HA normalmente aparecem em 64kDa enquanto que as proteínas de NA devem funcionar com um tamanho de cerca de 56 kDa (Figuras 8A e B). Usando o protocolo descrito você não deve ver qualquer produto de degradação. Se ocorrer a degradação é geralmente um sinal de contaminação por fungos / fúngico durante a expressão. Neste caso, repita o procedimento e certifique-se de manter tudo estéril. </li><li> Western blot / ELISA A fim de verificar a identidade da proteína recomendamos fazer para um Western blot ou ensaio ELISA com um anticorpo específico. Idealmente, ensaios de ELISA são efectuadas com um anticorpo que se liga aos epítopos conformacionais (por exemplo, anticorpos anti-HA haste 1). Usando um tal anticorpo o enrolamento correcto da proteína pode ser confirmada (Figura 8C). </li><li> Medindo NA atividade Enrolamento correcto da NA virai também podem ser determinados medindo a actividade de NA. Sugerimos realizar este teste usando o ensaio NA * STAR comercialmente disponível (apenas seguir as orientações do usuário). </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

Embora a expressão de proteínas do vírus da influenza, HA e NA em células de insecto utilizando o sistema de expressão de baculovírus é geralmente para a frente, existem diversos pontos importantes a considerar. É importante, como apontado na introdução, que ectodomínios da HA e NA são expressos em fusão com trimerização ou tetramerização domínios, respectivamente. Estes domínios de assegurar a correcta dobragem das moléculas normalmente assistida por o domínio transmembranar, o que não está presente apenas se o ectodom...

Como uma primeira resposta ao recente surgimento do romance H7N9 estirpe do vírus da gripe na China, adquirimos plasmídeos que transportam as seqüências genômicas para a hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) genes dos dois primeiros isolados. Usando estes plasmídeos fomos capazes de construir rapidamente os vectores de expressão de baculovírus recombinante para a produção de HA e NA em células de insetos. Este sistema de expressão é bem estabelecida em nosso laboratório e provou crucial para muitos dos nossos projectos de investigação em curso 1-8. Células de insetos são capazes de dobrar corretamente e após a tradução modificar proteínas complexas. Essas modificações incluem a glicosilação N-ligada, o que é importante para muitas glicoproteínas virais. Como tal, não é surpreendente que o sistema de baculovirus é bem estabelecida para a expressão de antigénios de superfície de vírus da gripe. De facto, muitas das estruturas cristalinas de HA e de NA foram resolvidos utilizando células de insecto expressaram proteínas 9-11. Outra vantagem dosistema encontra-se em seus rendimentos de alta proteína confiáveis ​​de até 30 mg de HA / L de cultura de células (com base na nossa experiência com mais de 50 proteínas diferentes de HA) - uma conseqüência da infecção pelo vírus da expressão expulsos do forte promotor da poliedrina. A remoção do domínio transmembranar e endodomínio de proteínas HA e NA permite a expressão de versões secretável, solúveis das proteínas e, assim, facilita muito o processo de purificação. Além disso, estes ectodomínios hexahistidina são marcados e podem, portanto, ser purificado usando a cromatografia de afinidade usando Ni 2 +-resina. Os domínios transmembranares de proteínas HA e NA contribuir para homotrímero e formação homotetrâmero, respectivamente. A fim de preservar estes oligomerizations, que adiciona um domínio de trimerização C-terminal para a HA-, e um domínio N-terminal de tetramerização à AN construções (Figura 1). Temos mostrado de forma conclusiva que um tal domínio de trimerização estabiliza funcional, conserved epítopos conformacionais na haste do domínio de HA 1. O tetramerização correta do NA também pode contribuir para corrigir dobrável e função NA 10. Seqüências e vetores de transferência de baculovírus abrigando trimerização ou tetramerização domínios podem ser solicitadas aos autores ou de outros laboratórios no campo, 9,10,12. Um outro problema importante para a expressão de proteínas secretadas em células de insectos é a escolha da linha de células para a direita. Enquanto Spodoptera frugiperda derivadas de células Sf9 suporte à replicação de baculovírus muito bem e são geralmente utilizados para resgate e propagação de vírus, eles têm a capacidade de secretar grandes quantidades de proteína limitado. Trichoplusia ni derivado BTI-TN-5B1-4 células (vulgarmente conhecido como High Five) têm uma capacidade maior secreção e são a linha de células de escolha para a expressão neste protocolo 13,14. Além disso, é útil para reduzir ou até mesmo eliminar soro fetal bovino (FBS) a partir de culturas de expressão. Nós, portanto, usar a mídia com reduzida (3%) conteúdo FBS para o cultivo das ações de trabalho do vírus, e realizar a expressão da proteína em meio livre de soro. Proteínas HA e NA recombinantes que são usados ​​para muitas técnicas imunológicas. Talvez o mais comum é em ensaios de ELISA para medir a soroconversão após a vacinação em humanos ou animais 4,6,7,15. HAs e AEs são também utilizados em ensaios ELISPOT de ambas as moléculas estimuladoras e reagentes de detecção de células secretoras de anticorpos 16. A sua utilização como iscas moleculares permite classificar especificamente para plasmablasts ou outros tipos de células-B, que podem então ser utilizados para isolar os anticorpos monoclonais (terapêutico) (mAbs). Moléculas de HA e NA recombinantes que são posteriormente usados ​​para a caracterização destes mAbs 8. Outros exemplos incluem o estudo da estabilidade do pH ou especificidade do receptor de expressou por diferentes isolados de vírus, ou quantitativamente avaliar enzimática NA específicaactividade ou resistência a inibidores. Por outro lado, recombinante, purificada de HA pode ser utilizada para padronizar o conteúdo de HA de vacinas inactivadas do vírus da gripe. Importante, rHA (e até certo ponto NA) candidatos a vacinas estão sendo testadas em modelos animais e ensaios clínicos em humanos com um candidato a vacina que está sendo licenciada pelo FDA em 2013 2,17-19. A vantagem destes novos vacinas é de que, devido à natureza recombinante destas proteínas, o processo de trabalho intensivo de geração de vírus de crescimento elevadas reassortant poderia ser evitado. Talvez ainda mais relevante é o fato de que seu rendimento HA é alto e reproduzível de estirpe para estirpe. Além disso, uma vez que essas vacinas são produzidas em um sistema de livre-ovo, eles não contêm contaminantes de proteínas que são problemáticos para indivíduos com alergias ao ovo. Aqui nós escolhemos para expressar as proteínas HA e NA de dois isolados do romance chinês do vírus da gripe H7N9, A / Anhui/1/13 e A/Shanghai/1/13 20,21. Estes são exemplos oportunos, mas o protocolo descrito pode ser usado para a expressão de qualquer vírus influenza A e B proteínas HA ou NA e pode ser adaptado para expressar quaisquer outras proteínas virais ou celulares segregados. Proteínas transmembranares triméricos ou tetraméricos pode ser clonado em cassetes de expressão utilizados para HA e NA, respectivamente. No entanto, as proteínas celulares secretados mais solúveis, como interferons, por exemplo, não precisa de um domínio adicional para a estabilização e pode ser expresso apenas com uma marca de hexa-histidina C-terminal.

<table><tbody><tr><td>Nome do Material/Equipamento</td><td>Número de catálogo da empresa</td><td></td><td>Comentários/Descrição</td></tr><tr><td>Sistema de expressão de Baculovírus Bac-to-Bac</td><td>Invitrogen</td><td>10359-016</td><td>Siga as instruções do fabricante</td></tr><tr><td>Meio de inseto TNM-FH</td><td>Gemini Bioproducts</td><td>600-311</td><td></td></tr><tr><td>HyClone SFX-Insect</td><td>Thermo Fisher</td><td>SH30278.02</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin II Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>P/N58760</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F68</td><td>Sigma</td><td>1000702664</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose</td><td>Qiagen</td><td>1018240</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Centrigual filtros Ultracel 30K</td><td>Millipore</td><td>UFC902024</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Colunas de polipropileno (5 ml)</td><td>Qiagen</td><td>34964</td><td></td></tr><tr><td>Eficiência máxima Bactérias DH10Bac</td><td>Invitrogen</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de plasmídeo PureLink HiPure Kit Midiprep</td><td>Invitrogen</td><td>K210015</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399-100G</td><td>para tampões de eluição e lavagem</td></tr><tr><td>Células Sf9</td><td>ATCC</td><td><a href="http://www.atcc.org/Products/All/CRL-1711.aspx" target="_blank">CRL-1711</a></td><td></td></tr><tr><td>High Five cells</td><td>Invitrogen</td><td>B85502</td><td></td></tr></tbody></table>

expressão da funcionais recombinante hemaglutinina ea neuraminidase proteínas do vírus influenza h7n9 novel usando a expressão sistema de baculovirus

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

O sistema de expressão de baculovírus é uma ferramenta poderosa para a expressão de proteínas recombinantes. Aqui vamos usá-lo para produzir versões dobradas corretamente e glicosiladas da vírus influenza A glicoproteínas da superfície - a hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA). Como um exemplo, nós escolhemos as proteínas HA e NA expressas pelo novo vírus H7N9, que surgiu recentemente na China. No entanto, o protocolo pode ser facilmente adaptado para proteínas HA e NA expressas por qualquer outro vírus influenza A e estirpes de vírus B. Proteínas recombinantes HA (rHA) e NA (ARN) são reagentes importantes para ensaios imunológicos, tais como ELISPOT e ELISA, e também são largamente utilizados para a padronização da vacina, a descoberta de anticorpos, o isolamento e caracterização. Além disso, as moléculas de NA recombinante pode ser usada para o rastreio de inibidores de moléculas pequenas e que são úteis para a caracterização da actividade enzimática do NA, bem como a sua sensibilidade para os antivirais. Proteínas HA recombinantes também são being testado como vacinas experimentais em modelos animais, e de uma vacina baseada na HA recombinante foi recentemente licenciada pela FDA para utilização em seres humanos. O método que descrevemos aqui para produzir essas moléculas é direto e pode facilitar a pesquisa nos laboratórios da gripe, uma vez que permite a produção de grandes quantidades de proteínas rápidas e de baixo custo. Embora aqui se concentrar em glicoproteínas da superfície do vírus da gripe, este método também pode ser usado para produzir outras proteínas de superfície virais e celulares.

Moléculas de HA e de A/Shanghai/1/13 A/Anhui/1/13 expressa bem com rendimentos de cerca de 20 mg / L de cultura. Moléculas de NA de ambas as estirpes apresentaram níveis moderados de expressão variam entre 0,2 mg / L de cultura para A/Shanghai/1/13 a 0,7 mg / L para A/Anhui/1/13. Todas as quatro preparações de proteína teve muito pouco ou nenhum impurezas (Figuras 8A e B) com vem sendo de pureza mais elevada do que o AN, que pode ser explicado por o nível de expressão. A/Shanghai/1/13 H...

Aqui nós descrevemos uma forma de expressar antígenos de superfície do vírus da influenza corretamente dobradas e funcionais decorrentes do novo vírus H7N9 chinês em células de insetos. A técnica pode ser adaptado para expressar ectodomínios de quaisquer proteínas de superfície virais ou celulares.

Expressão da Funcionais recombinante hemaglutinina ea neuraminidase Proteínas do vírus Influenza H7N9 Novel usando a expressão Sistema de Baculovirus

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar glicoproteína de superfície purificada corretamente dobrada para influenza, hemaglutinina e neuraminidase para ensaios imunológicos e experimentos de vacinação. Isso é feito primeiro clonando o BMid recombinante que carrega genes influenza, seguido pela geração de vírus baula recombinantes. O segundo passo é usar esses vírus baula recombinantes para expressar as proteínas hemaglutinina e neuraminidase em células de insetos.Em seguida, as proteínas recombinantes são purificadas do sobrenadante da cultura de células usando cromatografia de afinidade. A etapa final é caracterizar essas proteínas para garantir boa qualidade e funcionalidade biológica. Em última análise, as proteínas recombinantes são usadas para investigar as respostas imunes às glicoproteínas de superfície do vírus influenza.A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a expressão bacteriana do HA, por exemplo, é que os antígenos purificados são dobrados corretivamente e também permanecem biologicamente ativos, ao contrário do uso de preparações de vírus inteiros para ensaios imunológicos. Esses reagentes permitem medir as respostas imunes contra as proteínas hemaglutinina e não neuraminidase. Inicie este protocolo apenas com a geração do vírus baula recombinante conforme descrito no protocolo de texto trabalhando assepticamente em uma placa de capela de fluxo laminar, SF nove células de insetos em seis placas de poços a uma densidade de 200.000 células por centímetro quadrado.E vamos sentar por 20 minutos em uma incubadora de 28 graus Celsius sem CO2. Em seguida, misture dois microgramas de recombinante back mid com 100 microlitros de Trico Leia formulação de meio de joelho HINK ou TNM fh. Em seguida, misture seis microlitros do agente de transfecção com 100 microlitros de meio de inseto TNM FH.Combine os dois volumes, misture delicadamente e deixe a mistura de transfecção descansar por 20 minutos. À temperatura ambiente, inclua uma transfecção simulada como controle, que contém o reagente de transfecção, mas nenhum DNA. Remova o SNAT das nove células SF plaqueadas e substitua por dois mililitros de meio TNM FH livre de soro contendo solução de estreptomicina de penicilina a 1%.Adicione o volume completo da mistura de transfecção às células e balance a placa de seis poços com cuidado por cinco segundos. Incubar em uma incubadora de 28 graus Celsius sem CO2 por seis horas. Substitua o meio por um novo meio TNM FH completo antes de incubar a placa nas mesmas condições por seis dias.Verifique as células ocasionalmente ao microscópio. As células infectadas geralmente parecem maiores. Os núcleos mais redondos aumentaram e começam a se desprender.Colher células seis dias após a transfecção por centrifugação a 2000 G por cinco minutos em temperatura ambiente. O sobrenadante contém o vírus baula recombinante e será usado para gerar estoques de trabalho imediatamente, ou pode ser armazenado a quatro graus Celsius por anos. Verificar a expressão proteica através da página SDS e western blot e preparar as matérias-primas de trabalho conforme descrito no protocolo de texto.As células SF nove suportam muito bem o crescimento do vírus macular. No entanto, sua capacidade de secretar grandes quantidades de proteína recombinante é limitada. Portanto, usamos outra linha de células de insetos.Cinco células para a expressão de proteínas recombinantes secretadas. Essas células não suportam o crescimento do vírus balo com altos títulos, mas têm uma capacidade secretora muito alta. Cultive cinco células em meio de cultura de células de insetos SFX em T 175 centímetro quadrado frascos de passagem a cada dois dias.Dividindo-os em uma proporção de um para três. Cultive cinco frascos confluentes para uma cultura de expressão de 200 mililitros para colher e infectar as cinco células altas. Primeiro, desconecte as células high five batendo nos frascos.Recolha a suspensão celular e transfira para tubos de centrifugação de 50 mililitros. Gire os tubos a 1200 G por sete minutos em temperatura ambiente. Retirar o sobrenadante por decantação e unir os pellets por resus, suspendendo-os em 15 mililitros de P três.Deixe as células descansarem por 15 minutos na coifa. Transfira 200 mililitros de meio de cultura SFX de alto clone para um frasco agitador limpo e estéril de 1000 mililitros. Em seguida, transfira a suspensão de três células P para o selo do frasco agitador com papel alumínio estéril antes de agitar a 70 RPM e 28 graus Celsius por 72 a 96 horas.Colher proteína recombinante de sobrenadantes de expressão celular high five 72 a 96 horas após a infecção. Transfira os sobrenadantes da cultura para baldes de centrifugação de 500 mililitros. Gire a 5.500 G por 20 minutos a quatro graus Celsius.Entretanto, lavar o balão agitador três vezes com água bidestilada Próxima pipeta. Três mililitros de pasta de resina de níquel em um tubo de 50 mililitros com 45 mililitros de PBS por 200 mililitros de cultura.Agite bem antes de centrifugar por 10 minutos a 3000 G e temperatura ambiente após centrifugação. Transvase o PBS e guarde o pellet. Misturar o sobrenadante de células de insectos com o sedimento de resina de níquel e transferir para os balões agitadores já lavados.Incube a quatro graus Celsius por duas a quatro horas enquanto agita. Em seguida, monte uma coluna de polipropileno de 10 mililitros em uma braçadeira em um suporte de suporte. Remova as duas tampas e coloque um béquer abaixo da coluna para coletar o fluxo.Após a incubação do balão agitador, começar a transferir a mistura de pasta sobrenadante para a coluna. Ele reterá a resina de níquel e apenas o sobrenadante fluirá. Passe todo o volume sobre a coluna.Lave a resina quatro vezes com 15 mililitros de tampão de lavagem. Deixe o tampão de lavagem escorrer da coluna e feche o lado inferior com a tampa. Adicione dois mililitros de tampão eluciano e vamos descansar por cinco minutos.Abra a coluna e recolha o eit, mantendo-o em gelo úmido sempre que possível. Repita isso mais três vezes. Um EIT que contém altas concentrações de proteína normalmente mostra espuma quando agitado para trocar o tampão e concentrar a proteína primeiro, unidades de centrifugação de ultrafiltração de 15 mililitros de rotação livre com PBS a 3000 G e quatro graus Celsius por 20 minutos.Rejeitar o fluxo e colocar o EIT na coluna de centrifugação. Encha a coluna com cinco mililitros de PBS gelado estéril antes de girar nas mesmas condições por 60 minutos. Descarregue o fluxo novamente, reabasteça com 15 mililitros de PBS gelado e gire por mais 60 minutos.Repita este procedimento mais uma vez e, em seguida, colete o concentrado trocado por tampão que representa a proteína recombinante altamente concentrada. Mantenha o foco no gelo o tempo todo. Enxágue a coluna giratória com 400 microlitros de PBS gelado estéril e adicione ao concentrado.A proteína pode então ser caracterizada conforme descrito no protocolo de texto. As proteínas HA e NA expressas pelas cepas ENUE e Shanghai apresentaram níveis moderados de expressão variando de 0,2 miligramas por litro de cultura para influenza A coletada em Xangai a 0,7 miligramas por litro para influenza. A coletado em moléculas de enue, neuraminidase ou NA de ambas as cepas mostrou níveis moderados de expressão variando de 0,2 miligramas por litro de cultura para influenza A coletada em Xangai a 0,7 miligramas por litro para influenza A coletada em enue.Todas as quatro preparações proteicas tinham muito pouca ou nenhuma impureza, sendo o ha de maior pureza do que o nas, o que pode ser explicado pelo nível de expressão. A gripe A coletada em Shanghai HA foi posteriormente analisada usando ELI SA com o anticorpo monoclonal humano reativo CR 9 1 1 4 amplamente neutralizante. Como mostrado aqui em azul, este anticorpo monoclonal se liga a um epítopo de confirmação sensível no domínio de estoque e é usado aqui como uma sonda para o dobramento correto deste domínio.O anticorpo mostra boa ligação, como evidenciado pelo aumento da absorbância em 490 nanômetros, o que dá confiança de que o HA está realmente dobrado corretamente. Um segundo, Eliza com anti-hemaglutinina do soro policlonal de camundongo subtipo sete foi realizado para confirmar a identidade da proteína obtida como hemaglutinina de origem do subtipo sete. Depois de assistir a este vídeo, você tem uma boa compreensão de como expressar o vírus influenza recombinante, a hemaglutinina e as proteínas neuraminidase em seu laboratório.Este processo também pode ser útil para a expressão de outras proteínas virais ou de membrana celular. Desejo-lhe boa sorte com seus experimentos.

expression-functional-recombinant-hemagglutinin-neuraminidase

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo descreve a técnica de ressonância plasmônica de superfície, ou SPR, para estudar a interação entre duas moléculas usando um chip sensor. A mudança no ângulo de ressonância e a intensidade da luz refletida são detectadas em função da associação e dissociação de duas moléculas, e isso fornece informações sobre as interações entre as duas moléculas.

Ressonância plasmônica de superfície para estudar interações biomoleculares usando um chip sensor

Kindlins são fundamentais para a adesão celular através de integrinas mas os estudos deles foram prejudicados pela dificuldade encontrada em expressá-las de forma recombinante em hospedeiros bacterianos. Descrevemos aqui métodos para a sua produção eficiente em células de insecto infectadas com baculovírus.

Produção eficiente e Purificação de recombinante murino Kindlin-3 a partir de células de insetos de Estudos biofísicos

Há uma falta geral de conhecimento sobre como as vacinas funcionam. Aqui, propomos o uso combinado de genética reversa e camundongos quiméricos da medula óssea para obter informações sobre as respostas imunes iniciais do hospedeiro às vacinas, com foco especial nas células dendríticas e na imunidade das células T.

A administração intranasal de recombinantes Vacinas contra Influenza em quimérico rato Modelos para estudar a imunidade mucosal

Este protocolo descreve um calor induzida por choque proteína expressão (sistema pDHsp/V5-His/sf9 célula), que pode ser usado para expressar proteínas estranhas ou avaliando a atividade anti-apoptotic de potenciais proteínas estranhas e seus truncado amino ácidos em células de inseto.

Expressão transiente de estrangeiros Genes em células de inseto (sf9) para o ensaio funcional da proteína

Neste protocolo, baculovirus é produzido pelo transfection transiente de baculovirus plasmídeo em células Sf9 e amplificado em uma cultura de suspensão livre de soro. O sobrenadante é purificado por cromatografia de afinidade de heparina e mais concentrado por ultracentrifugação. Este protocolo é útil para a produção e purificação de baculovirus para aplicação de terapia de gene.

Produção e purificação de Baculovirus para aplicação de terapia gênica

Aqui, apresentamos os protocolos para utilizando o inseto sistema expressão da proteína celular e baculovirus para produzir grandes quantidades de proteínas vegetais secretada por cristalização de proteínas. Um vetor de expressão de baculovirus foi modificado com GP67 ou inseto hemolin peptídeo sinal planta secreção na expressão de proteínas nas células de inseto.

Modificar vetores de expressão de Baculovirus para produzir secretado proteínas vegetais em células de inseto

Os vírus da influenza A (IAVs) são patógenos respiratórios contagiosos que causam epidemias anuais e pandemias ocasionais. Aqui, nós descrevemos um protocolo para rastrear infecções virais in vivo usando uma novela recombinante luciferase e fluorescência-expressando o bi-repórter IAV (BIRFLU). Esta abordagem fornece aos pesquisadores uma excelente ferramenta para estudar IAV in vivo.

Um luciferase-vírus da gripe do repórter fluorescente para A imagem latente viva e a quantificação da infecção viral

Este protocolo descreve um processo experimental para produzir partículas pseudodigitadas virais infecciosas de alto titer (pp) com glicoproteínas envelope de duas cepas de gripe A e como determinar sua infectividade. Este protocolo é altamente adaptável para desenvolver pps de qualquer outro tipo de vírus envolvidos com glicoproteínas envelope diferentes.

Produção de partículas pseudodigitadas de gripe infecciosa de alto titer com glicoproteínas envelope de vírus H5N1 e H7N9 altamente patogênicos

O sistema vetorial de expressão baculovírus (BEVS) é uma plataforma robusta para triagem de expressão e produção de metiltransferases de arginina proteica (PRMTs) a serem utilizadas para estudos bioquímicos, biofísicos e estruturais. Quantidades de miligrama de material podem ser produzidas para a maioria dos PRMTs e outras proteínas de interesse que requerem uma plataforma de expressão eucariótica.

Produção de Proteínas PRMT Recombinantes utilizando o Sistema Vetorial de Expressão baculovírus

Aqui descrevemos um protocolo para empacotamento de pseudovírus e a medição da atividade neutralizante de anticorpos.

Preparação de Vírus da Influenza Aviária H5 Pseudotipados com Método de Transfecção de Fosfato de Cálcio e Mensuração da Atividade Neutralizante de Anticorpos

O presente protocolo descreve novas ferramentas para ensaios de ligação ao SPR para examinar a ligação de CV-N ao AH, glicoproteína S, glicanos do tipo híbrido relacionados e oligossacarídeos com alto teor de manose. O SPR é usado para determinar o KD para ligar o CV-N dimérico ou monomérico a esses glicanos.

Engenharia de Agentes Antivirais via Ressonância de Plasmon de Superfície

Aprenda a expressar hemaglutinina e neuraminidase funcionais do vírus influenza H7N9 usando o sistema de baculovírus em células de inseto. Este método permite obter proteínas corretamente dobradas para ensaios imunológicos.

Expressão da Funcionais recombinante hemaglutinina ea neuraminidase Proteínas do vírus Influenza H7N9 Novel usando a expressão Sistema de Baculovirus (Vídeo) | JoVE Journal

Expressão da Funcionais recombinante hemaglutinina ea neuraminidase Proteínas do vírus Influenza H7N9 Novel usando a expressão Sistema de Baculovirus

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