Produção de RNA para análise transcriômica de corpos celulares de neurônio motor da medula espinhal do rato por microdisseção de captura a laser

O objetivo geral deste procedimento é recuperar RNA de alta qualidade dos neurônios motores da medula espinhal sem contaminação pelo RNA das células vizinhas. Isso é feito primeiro recuperando, dividindo e incorporando o cordão em meio de incorporação criogênica e congelando a 160 graus Celsius negativos. O segundo passo é seccionar criogênico o cabo em lâminas de membrana da caneta a 20 graus Celsius negativos.

Em seguida, as lâminas são lavadas em etanol 70% e coradas com Azure B em etanol 70%. A etapa final é a micro dissecação por captura a laser de corpos celulares de neurônios motores identificados em tampão de lise de tiocianato de guiné. Em última análise, o RNA total é preparado a partir dos lisados combinados e testado para descobrir diferenças na transcrição geral ou específica do RNA em neurônios de animais mutantes versus selvagens.

A microdissecção por captura a laser permite a recuperação de corpos celulares de neurônios motores de seções da medula espinhal sem contaminação pelo Scalia mais numeroso e outros tipos de células. Oferecendo uma chance de preparar RNA e comparar a transcrição entre neurônios de um animal doente e um normal. O aspecto mais difícil no desenvolvimento desse procedimento foi encontrar um método de coloração que nos permitisse detectar neurônios motores em seções da medula espinhal, mantendo altos níveis de integridade do RNA e capacidade de extração, antes e durante a captura do laser.

Descobrimos que as seções de coloração em Azure B e 70% de etanol atenderam a esses critérios quando combinadas com a coleta dos corpos celulares dissecados diretamente no tampão de lise de tiocianato de Guiné, demonstrando que o procedimento é ine Van Padia, um pós-doutorado em nosso laboratório para obter os melhores resultados. Certifique-se de que todos os equipamentos sejam limpos com solução descontaminante de RNAs seguida de etanol 70% livre de RNAs após eutanásia e perfusão transcárdica Isole cuidadosamente a medula espinhal. Enxágue o cordão por 10 segundos em RNAs.

Água livre para lavar qualquer sangue residual e colocá-lo em uma lâmina de vidro livre de RNAs com muito cuidado, mas rapidamente. Em seguida, divida a medula espinhal transversalmente usando uma lâmina de barbear limpa em nove a 10 pedaços. Posicione as peças em um molde criogênico preenchido com OCT e alinhe-as verticalmente usando uma agulha limpa.

Coloque o molde em uma bandeja rasa contendo dois metil butano pré-resfriado com nitrogênio líquido. Para evitar a degradação do RNA, coloque a bandeja em um banho de nitrogênio líquido. Para congelar rapidamente as peças da medula espinhal.

Armazene o bloco embutido OCT a 80 graus Celsius negativos por até seis meses antes de seccionar. Quando pronto para a posição de seccionamento, o OCT embutiu o bloco em um criostato resfriado. Produza fatias de 20 mícrons, cada uma contendo de nove a 10 seções transversais da medula espinhal.

Coloque as seções na membrana da caneta livre de RNAs. Lâminas de dois mícrons mantidas inicialmente em temperatura ambiente para garantir que as seções adiram. Bem, congele imediatamente a seção em uma superfície negativa de 20 graus Celsius dentro do criostato.

Mantenha as lâminas a 80 graus Celsius negativos até serem usadas em uma faixa de rack limpa. Seis tubos cônicos de 50 mililitros preenchidos com RNAs free.70%etanol. A profundidade deve ser suficiente para cobrir todas as seções de uma lâmina quando a lâmina estiver imersa.

Em seguida, coloque a solução 1%Azure B no mesmo rack. Para minimizar o tempo entre a troca de soluções durante a lavagem ou coloração, mantenha três ou quatro lenços umedecidos na frente do rack para drenar a solução extra rapidamente. Quando estiver pronto, retire as lâminas do freezer negativo de 80 graus Celsius e coloque-as sobre gelo seco e descongele uma lâmina, colocando-a na palma da mão enluvada.

Remova a maior parte da umidade e condensação da lâmina limpando-a com um lenço umedecido, tomando cuidado para não tocar nas seções. Coloque a lâmina no dessecante de sílica gel fresco em uma placa de Petri por 30 a 40 segundos para secar completamente. Quando seco, mergulhe a lâmina no primeiro tubo de RNAs, etanol 70% livre.

Mergulhe o slide por 30 segundos e, em seguida, lave o OCT mergulhando-o para cima e para baixo por 45 segundos a um minuto. Em seguida, retire a lâmina da solução e drene o excesso de líquido em lenços umedecidos. Repita este processo mergulhando a lâmina no segundo tubo de etanol a 70%.

Se a OCT permanecer ao redor das seções da medula espinhal, repita a lavagem no terceiro tubo. Depois de drenar o excesso de líquido, mergulhe a lâmina em solução 1%Azure B em 70%RNAs, etanol livre por 30 a 45 segundos. Drene o excesso de Azure B em um lenço de laboratório.

Neste ponto, todo o slide será azul. Mergulhe a lâmina no próximo tubo de etanol a 70% e mergulhe para cima e para baixo rapidamente, três a quatro vezes para remover o excesso de corante e tornar visível a coloração específica do neurônio motor. Se as seções parecerem muito escuras, repita a etapa de descoloração em um tubo novo de etanol a 70%.

Se a coloração parecer muito clara, retorne a lâmina para a solução Azure B por mais 32 e repita a coloração des. Se a coloração for satisfatória, deixe a lâmina secar ao ar por um breve instante e prossiga para a próxima etapa. Após a coloração e secagem do DES, a substância cinzenta ficará azul claro e os neurônios motores corados de azul profundo serão facilmente visíveis.

Inicie a dissecção imediatamente após ligar o microscópio. Descarregue o suporte do tubo para prender a tampa de um tubo de microfuga de 0.6 milímetro. Para a coleta de amostras, coloque 30 microlitros de tampão de lise de guiné e tiocianato na tampa e cubra a superfície espalhando a solução.

Com uma ponta de pipeta, alinhe a tampa com o orifício e a objetiva. Com o desgaste do software do microscópio, mantenha a tampa na posição coberta até iniciar a captura do laser. Coloque a lâmina seca ao ar de cabeça para baixo no stage do microscópio de modo que o lado da membrana fique voltado para baixo e a seção fique alinhada com o orifício.

Com o slide no lugar, concentre-se em uma seção da medula espinhal com a objetiva de cinco x e, em seguida, passe para a objetiva de 20 x para dissecção. Primeiro, marque uma região fictícia com a caneta de luz e deixe o laser cortá-la sem coletá-la. Isso relaxa a membrana e torna possível marcar e cortar várias regiões sucessivamente.

Em seguida, reoriente e identifique os neurônios motores na região do corno ventral. Esses neurônios são reconhecíveis por sua morfologia parmal de localização, tamanho grande e coloração azul escura com Azure B. Usando a caneta de luz, selecione a ferramenta de desenho e marque ao longo da borda dos neurônios motores fazendo um contorno completo. Tente fazer o contorno o mais próximo possível do neurônio motor para evitar a contaminação de outras células.

Várias células podem ser marcadas antes do corte, pois o software lembrará as posições quando estiver pronto para cortar, coloque a tampa abaixo da posição de corte e clique no botão Iniciar para iniciar a dissecção do neurônio motor com o laser. Colete todos os neurônios motores de todas as seções em uma lâmina na tampa de um tubo de micro fuga. Após a conclusão da coleta, retire o tubo de microfuga do suporte descarregando a bandeja e desalojando suavemente o tubo dissolver completamente os neurônios motores e o tampão pipetando a solução para cima e para baixo.

Mova a solução para o corpo do tubo centrifugando, congele a amostra imediatamente em gelo seco e armazene-a a 80 graus Celsius negativos após a coloração com Azure B. Os neurônios motores aparecem como grandes corpos celulares corados de escuro. Eles são confirmados por anticorpos anti-CHATT, coloração e são facilmente diferenciados das células vizinhas menores. Neste exemplo, os corpos celulares dos neurônios motores foram delineados com a caneta de luz e numerados pelo software.

Aqui, os corpos celulares foram cortados com o laser e jogados no tubo de coleta com os contornos desligados. A extensão dos danos causados pelo laser nas regiões vizinhas é aparente. Os resultados típicos de uma análise eletroforética da integridade do RNA de uma amostra de aproximadamente 4.000 corpos celulares de neurônios motores de camundongos coletados por LMD são mostrados aqui.

Observe os picos proeminentes de RNA ribossômico. Este processo de coloração de lâmina até a dissecção do neurônio motor deve ser concluído em 30 minutos para todas as seções em uma lâmina para minimizar a degradação do RNA. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de trabalhar o mais rápido possível, tanto na dissecção inicial e incorporação do cordão, quanto nas etapas finais de coloração e microdissecção por captura a laser dos neurônios motores.