Produção de RNA para análise transcriômica de corpos celulares de neurônio motor da medula espinhal do rato por microdisseção de captura a laser

O objetivo geral deste procedimento é recuperar RNA de alta qualidade de neurônios motores da medula espinhal sem contaminação por RNA de células vizinhas. Isso é realizado primeiramente recuperando, dividindo e embutindo a medula em meio de inclusão criogênico e congelando-a a 160 graus Celsius negativos. O segundo passo é seccionar criogenicamente a medula em lâminas com membrana PEN a 20 graus Celsius negativos.

Em seguida, as lâminas são lavadas em etanol 70% e coradas com Azul de Azure B em etanol 70%. A etapa final é a microdissecção por captura a laser dos corpos celulares de neurônios motores identificados em tampão de lise contendo tiocianato de guanidina. Por fim, o RNA total é preparado a partir dos lisados combinados e analisado para identificar diferenças na transcrição de RNA geral ou específica em neurônios de animais mutantes em comparação com animais do tipo selvagem.

A microdissecção a laser permite recuperar corpos celulares de neurônios motores de cortes da medula espinhal sem contaminação pelos tipos celulares mais numerosos, como os astrócitos e outros. Oferece a possibilidade de preparar RNA e comparar a transcrição entre neurônios de um animal doente e um normal. O aspecto mais difícil no desenvolvimento deste procedimento foi encontrar um método de coloração que nos permitisse detectar neurônios motores em cortes da medula espinhal, mantendo altos níveis de integridade e capacidade de extração do RNA, tanto antes quanto durante a captura a laser.

Descobrimos que a coloração de cortes em Azul de Azure B e etanol 70% atende a esses critérios quando combinada com a coleta direta dos corpos celulares dissecados diretamente no tampão de lise de Guanidina Tiocianato, demonstrando o procedimento é ine Van Padia, pós-doutoranda em nosso laboratório. Para os melhores resultados, certifique-se de que todo o equipamento seja limpo com solução descontaminante de RNAses, seguida por etanol 70% livre de RNAses, após a eutanásia e a perfusão transcardial. Isole cuidadosamente a medula espinhal. Enxágue o cordão por 10 segundos em RNAs.

Água livre para lavar qualquer resíduo de sangue e coloque-o suavemente, porém rapidamente, em uma lâmina de vidro livre de RNAses. Em seguida, divida a medula espinhal transversalmente usando uma lâmina de barbear limpa em nove a dez pedaços. Posicione os pedaços em um molde criogênico preenchido com OCT e alinhe-os verticalmente usando uma agulha limpa.

Coloque o molde em uma bandeja rasa contendo butano metílico pré-resfriado com nitrogênio líquido. Para evitar a degradação de RNA, coloque a bandeja em um banho de nitrogênio líquido, a fim de congelar rapidamente os fragmentos da medula espinhal.

Armazene o bloco embutido em OCT a menos 80 graus Celsius por até seis meses antes do corte. Quando estiver pronto para o corte, posicione o bloco embutido em OCT em um criostato refrigerado. Produza fatias de 20 mícrons, cada uma contendo de nove a dez seções transversais da medula espinhal.

Coloque as seções em uma membrana livre de RNAses. Mantenha lâminas de 2 µm inicialmente à temperatura ambiente para garantir que as seções adiram. Recongele imediatamente a seção em uma superfície a menos 20 graus Celsius dentro do criostato.

Mantenha as lâminas a menos 80 graus Celsius até o uso em uma estufa limpa. Seis tubos cônicos de 50 mililitros preenchidos com etanol a 70%, livre de RNAses. A profundidade deve ser suficiente para cobrir todas as seções em uma lâmina quando esta for imersa.

Em seguida, coloque a solução de Azul 1% no mesmo suporte. Para minimizar o tempo entre a troca de soluções durante a lavagem ou coloração, mantenha três ou quatro lenços de laboratório à frente do suporte para drenar rapidamente o excesso de solução. Quando estiver pronto, retire os lâminas do congelador negativo a 80 graus Celsius e coloque-os sobre gelo seco; descongele um lâmina por vez, colocando-o na palma da mão com luva.

Remova a maior parte da umidade e condensação da lâmina limpando-a com um lenço de laboratório, tomando cuidado para não tocar nas seções. Coloque a lâmina sobre gel de sílica fresco em uma placa de Petri por 30 a 40 segundos para secar completamente. Quando seca, mergulhe a lâmina no primeiro tubo de etanol 70% livre de RNAses.

Deixe o lâmina de molho por 30 segundos e, em seguida, remova o OCT mergulhando-o para cima e para baixo por 45 segundos a um minuto. Em seguida, retire o lâmina da solução e remova o excesso de líquido em lenços laboratoriais. Repita este processo mergulhando o lâmina no segundo tubo contendo etanol 70%.

Se o OCT permanecer ao redor das seções da medula espinhal, repita a lavagem no terceiro tubo. Após drenar o líquido em excesso, mergulhe a lâmina em solução de 1% de Azul de Azure B em etanol livre de RNAses a 70% por 30 a 45 segundos. Remova o excesso de Azul de Azure B em um lenço de laboratório.

Neste ponto, todo o lâmina estará azul. Mergulhe a lâmina no próximo tubo contendo etanol a 70% e movimente-a rapidamente para cima e para baixo de três a quatro vezes para remover o excesso de corante e tornar visível a coloração específica dos neurônios motores. Se as seções apresentarem coloração muito intensa, repita a etapa de descoloração em um tubo novo contendo etanol a 70%.

Se a coloração parecer muito clara, retorne a lâmina à solução de Azul de Azure por mais um 32º e repita a descoloração. Se a coloração estiver satisfatória, deixe a lâmina secar ao ar brevemente e prossiga para o próximo passo. Após a coloração DES e a secagem, a substância cinzenta ficará azul clara e os neurônios motores corados em azul escuro serão facilmente visíveis.

Inicie a dissecação imediatamente após ligar o microscópio. Descarregue o suporte de tubos para fixar a tampa de um tubo microfuga de 0,6 milímetro. Para coleta da amostra, coloque 30 microlitros de tampão de lise de guanidina e tiocianato na tampa e cubra a superfície espalhando a solução.

Com a ponta de uma pipeta, alinhe a tampa com o orifício e o objetivo. No software do microscópio, mantenha a tampa na posição fechada até o início da captura a laser. Coloque a lâmina seca ao ar invertida sobre a platina do microscópio, de modo que o lado da membrana fique voltado para baixo e a seção fique alinhada com o orifício.

Com a lâmina no lugar, foque em uma seção da medula espinhal com o objetivo de cinco x e, em seguida, mude para o objetivo de 20 x para a dissecação. Primeiro, marque uma região fictícia com a caneta de luz e permita que o laser a recorte sem coletá-la. Isso relaxa a membrana e torna possível marcar e cortar múltiplas regiões sucessivamente.

Em seguida, refocalize e identifique os neurônios motores na região do corno ventral. Essas células são reconhecíveis pela sua localização, morfologia característica, grande tamanho e coloração azul-escura com Azure B. Utilizando a caneta de luz, selecione a ferramenta de desenho e marque ao longo da borda dos neurônios motores, fazendo um contorno completo. Procure fazer o contorno o mais próximo possível do neurônio motor para evitar contaminação por outras células.

Várias células podem ser marcadas antes do corte, já que o software lembrará as posições quando estiver pronto para cortar, trará a tampa sob a posição de corte e clicará no botão de início para iniciar a dissecação de neurônios motores com o laser. Colete todos os neurônios motores de todas as seções em uma lâmina na tampa de um tubo microfuga. Após a coleta ser concluída, retire o tubo microfuga do suporte removendo a bandeja e desalojando suavemente o tubo, dissolvendo completamente os neurônios motores e o tampão pipetando a solução para cima e para baixo.

Transfira a solução para o corpo do tubo por centrifugação, congele a amostra imediatamente em gelo seco e armazene-a a menos 80 graus Celsius após a coloração com Azul B. Os neurônios motores aparecem como corpos celulares grandes e intensamente corados. Eles são confirmados por anticorpos anti-CHATT e pela coloração, sendo facilmente diferenciados das células vizinhas menores. Neste exemplo, os corpos celulares dos neurônios motores foram delineados com uma caneta óptica e numerados pelo software.

Aqui, os corpos celulares foram cortados com o laser e depositados no tubo de coleta com os contornos desativados. É evidente a extensão do dano causado pelo laser em regiões vizinhas. São apresentados aqui os resultados típicos de uma análise eletroforética da integridade do RNA de uma amostra de aproximadamente 4.000 corpos celulares de neurônios motores de camundongo coletados por LMD.

Observe os picos proeminentes de RNA ribossômico. Esse processo, desde a coloração do lâmina até a dissecção de neurônios motores, deve ser concluído em até 30 minutos para todas as seções em uma mesma lâmina, a fim de minimizar a degradação do RNA. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de trabalhar tão rapidamente quanto possível, tanto na dissecção inicial e inclusão da medula, quanto nas etapas finais de coloração e microdissecção a laser dos neurônios motores.