Isolamento de Blood-derivado do navio Multipotentes Precursores do músculo-esquelético humano
21 de agosto de 2014
Vasos sanguíneos dentro do porto músculo esquelético várias populações precursoras multi-linhagem humana que são ideais para aplicações de regeneração. Este método de isolamento permite purificação simultânea de três populações de células multipotentes precursor, respectivamente, de três camadas estruturais de vasos sanguíneos: as células endoteliais de miogênica íntima, pericitos de mídia e células adventícias de adventícia.
O objetivo geral deste procedimento é isolar e purificar subconjuntos de células precursoras multpotentes derivadas de vasos sanguíneos humanos a partir de uma única biópsia de músculo esquelético; primeiro, dissocie a biópsia muscular e faça a digestão com uma combinação das colagenases tipo um, dois e quatro. Em seguida, marque a suspensão de células isoladas com anticorpos conjugados a fluorescência que reconhecem uma combinação de marcadores de superfície celular selecionados. Depois, realize a classificação de células ativada por fluorescência por citometria de fluxo.
Visualize e expanda os subtipos celulares classificados em condições específicas de cultura e em densidades ideais. Em última análise, a análise pós-classificação de células purificadas, bem como a citometria de fluxo subsequente e a análise de R-T-P-C-R de subconjuntos celulares cultivados, é utilizada para demonstrar a pureza desses subconjuntos homogêneos de BVSE. Sim, este método, você sabe, pode responder realmente, você sabe, qual é a origem dessas células-tronco meso camel?
Você sabe, porque muitas pessoas descobriram diferentes tipos de células-tronco em diversos tecidos. Então, acho que isso pode responder à origem dessas células-tronco, bem como ao papel que as células perivasculares e quaisquer outras derivadas de vasos sanguíneos desempenham na regeneração e reparação tecidual. A demonstração visual deste método é fundamental, assim como a biópsia muscular.
Os passos de dissociação podem ser difíceis de aprender. Os detalhes técnicos e a otimização da digestão com colagenase são muito críticos para o rendimento e a purificação das células-alvo. Transporte a biópsia de músculo esquelético humano em gelo.
Em DM M suplementado com 5% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina, sob condições estéreis. Lave o espécime duas vezes com PBS contendo 2% de antibiótico-antifúngico, depois em dms, suplementado com 2% de aa. Remova o tecido adiposo e o tecido conjuntivo aderidos.
Remova também os grandes vasos sanguíneos sob um microscópio de dissecação. Agora, corte a amostra muscular em pequenos pedaços. Transfira as amostras para 20 mililitros de meio de preservação para armazenamento a quatro graus Celsius por até cinco dias.
No dia do isolamento celular. Remova os fragmentos musculares e lave-os duas vezes em PBS contendo 2% de pen strip. Para preparar a solução de digestão, adicione 100 miligramas por mililitro de colagenase tipo um, tipo dois e tipo quatro ao pm.
Por fim, pique e triture mecanicamente os pedaços de músculo com uma pequena quantidade de pm. Passe a solução através de uma pipeta serológica de 10 mililitros, verificando a ausência de coagulação. Remova o tecido adiposo e conjuntivo residual durante esse processo.
Em seguida, transfira metade da amostra de adulto para 20 mililitros ou toda a amostra fetal para 10 mililitros da solução de digestão. Incube a amostra por 50 a 60 minutos a 37 graus Celsius em agitador orbital a 70 a 80 RPM. Observe o estado da digestão a cada 15 a 20 minutos.
Otimize o rendimento celular e a preservação do antígeno de superfície ajustando o tempo de digestão e/ou a velocidade de agitação de acordo com a quantidade de tecido; quando a turbidez estiver quase totalmente clara, pipete o tecido digestivo de três a cinco vezes vigorosamente. Adicione uma quantidade igual de PM para interromper a reação e, em seguida, centrifugue a 400 Gs por quatro minutos. Remova cuidadosamente o sobrenadante para lavar o pellet e re suspenda em 10 mililitros de PM. Filtre através de um estrainer celular de 100 mícrons, centrifugue a 400 Gs por quatro minutos e remova cuidadosamente o sobrenadante.
A seguir, reconstitua, suspenda os pellets no tampão de lise de eritrócitos e filtre através de um estrainer de células de 70 mícrons para obter uma suspensão simples de células. Após a incubação por 10 minutos à temperatura ambiente, filtre a suspensão através de um estrainer de células de 70 micrômetros. Se qualquer precipitação for observada, pelletize as células por centrifugação e reconstitua.
Suspenda em 0,5 mililitros de PBS e conte o número de células para coloração. Dilua a suspensão de células isoladas para menos de 5 milhões de células por mililitro com alíquota de PBS, de 50 a cem microlitros da suspensão celular, e divida em 11 tubos para o controle não corado, os controles negativos e os controles positivos monocromáticos. Se necessário, bloquee a suspensão de células isoladas por 10 minutos a quatro graus Celsius em soro de camundongo.
Adicione as soluções de anticorpos de acordo com o delineamento experimental e incube por 20 minutos a quatro graus Celsius. Peline as células por centrifugação e lave cada pellet de amostra uma vez em PM diluído numa concentração final de 5 milhões de células por mililitro para exclusão de células mortas, utilizando uma diluição de um para 100 de seven a a d, e incube por 15 minutos à temperatura ambiente para o controle negativo e os controles positivos de cor única. Reuspenda os pellets celulares em 0,5 mililitros de pm diluído.
Transfira todas as suspensões celulares para tubos de citometria de fluxo de fundo redondo feitos de poliestireno. Agora, prepare os tubos de coleta celular com 500 microlitros do meio coerente apropriado. Transporte as suspensões celulares sobre gelo até a célula.
Realize a triagem das suspensões celulares no classificador de células na ordem do controle não corado, controles negativos, controles positivos monocromáticos e a suspensão celular principal, ajustando rigorosamente a intensidade do laser, a compensação dos canais e o direcionamento das populações celulares para maximizar a pureza celular. Colete as populações celulares desejadas nos tubos de coleta apropriados. Armazene as células coletadas a quatro graus Celsius.
Se não for semear imediatamente, semeie células endoteliais miogênicas frescas e separadas. Células endoteliais miogênicas em MPM em placas previamente codificadas com colágeno tipo I para embalagem subsequente da semente de ECS.
3.500 a 4.000 células por centímetro quadrado em MPM sobre placas ou frascos pré-revestidos com semente de colágeno tipo I. Parasitas recém-separados em e gm dois sobre placas recém-revestidas com gelatina 0,2% para a primeira e segunda passagem. Divida as células na proporção de um para três em meio PC sobre cultura de poliestireno comum.
Placas a partir do P três em diante. Semear as células em densidade de 6.500 a 7.000 células por centímetro quadrado em meio PC sobre placas de cultura de poliestireno comum. Para frascos, semear as células de tecido adventício recém-separadas em meio AC sobre placas de cultura de poliestireno comum para o subsequente envase de células semente ACS em densidade de 6.000 a 7.000 células por centímetro quadrado em meio AC sobre placas de cultura de poliestireno comum.
Os parâmetros dos fatos dos frascos são primeiramente corrigidos com base nos dados obtidos a partir do controle não corado, controles negativos e controles positivos de cor única após a exclusão de células mortas; a seguir, a suspensão de células marcadas com fluorescência é submetida a uma série de seleções negativas e positivas de marcadores de superfície celular. Primeiro, as células positivas para CD45 são selecionadas. Em seguida, as células positivas para CD56 e as células negativas para CD56 são separadas da fração negativa para CD45.
A fração positiva para CD56 é submetida posteriormente à seleção para CD34 e CD144, na qual apenas as células duplamente positivas são marcadas como células endoteliais miogênicas e subsequentemente coletadas. De forma semelhante, a fração negativa para CD56 é submetida à seleção para CD34 e CD146, na qual apenas as células negativas para CD34 e positivas para CD146 são marcadas como parasitas e subsequentemente coletadas; a fração positiva para CD34 e negativa para CD146 é submetida a uma seleção negativa adicional para CD31 para excluir células endoteliais, e somente o subconjunto positivo para CD34 e negativo para CD31 é marcado como células adv para coleta. Neste caso, CD144 pode ser usado para substituir CD31 na exclusão de células endoteliais.
Esses subconjuntos de C-E-P-V-S foram purificados a partir de biópsias musculares de um único doador. Diferentemente das típicas células-tronco musculares heterogêneas, culturas de subconjuntos de células-tronco derivadas de vasos sanguíneos humanos permanecem homogêneas mesmo após expansão de longo prazo. Como você sabe, acho muito importante que pesquisadores de autoisolamento utilizem a mesma técnica para isolar, você sabe, aquelas células-tronco derivadas de vasos sanguíneos que descrevemos em nossos laboratórios.
Portanto, acreditamos que esta técnica, aplicada de forma comparativa, permitirá que as pessoas reproduzam nossos resultados e comparem realmente os resultados obtidos por diferentes equipes. Não se esqueça de que trabalhar com tecido humano fresco pode ser extremamente perigoso. Precauções, como o uso de luvas de nitrila e proteção ocular, devem ser tomadas durante a realização deste procedimento.
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Visão Geral
Este artigo descreve um método para isolar e purificar células precursoras multpotentes provenientes de vasos sanguíneos humanos no músculo esquelético. O procedimento permite a purificação simultânea de células endoteliais miogênicas, pericitos e células adventiciais a partir de diferentes camadas estruturais dos vasos sanguíneos.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Medicina regenerativa
- Biologia celular
- Pesquisa com células-tronco
Contexto
- O músculo esquelético humano contém populações precursoras multilinhagem.
- Essas células precursoras possuem aplicações potenciais em terapias regenerativas.
- O isolamento dessas células pode aprimorar a compreensão de suas propriedades.
- Os vasos sanguíneos atuam como fonte dessas células multipotentes.
Objetivo do Estudo
- Isolar subpopulações específicas de células precursoras derivadas de vasos sanguíneos.
- Realizar a purificação de células endoteliais miogênicas, pericitos e células adventiciais.
- Analisar a pureza e as características dessas populações celulares.
Métodos Utilizados
- Dissociação de biópsia de músculo esquelético utilizando digestão com colagenase.
- Marcação de suspensão de células isoladas com anticorpos conjugados a fluorescência.
- Classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) por citometria de fluxo.
- Análise pós-classificação incluindo citometria de fluxo e RT-PCR.
Principais Resultados
- Isolamento bem-sucedido de três populações distintas de células precursoras multpotentes.
- Alta pureza dos subtipos celulares classificados confirmada por meio de análise.
- O método demonstra potencial para o estudo da origem das células-tronco mesenquimais.
- Fornece uma base para aplicações regenerativas futuras.
Conclusões
- O método descrito isola efetivamente células precursoras do músculo esquelético humano.
- Essas células podem ser utilizadas em pesquisas futuras na medicina regenerativa.
- Compreender essas populações pode levar a avanços nas estratégias terapêuticas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite o isolamento simultâneo de três subpopulações distintas de precursores multpotentes derivadas de vasos sanguíneos a partir de uma única biópsia de músculo esquelético humano, otimizando a obtenção de material de origem para programas de medicina regenerativa. Ao preservar a homogeneidade fenotípica durante a expansão de longo prazo, ele possibilita a avaliação pré-clínica reprodutível das contribuições das células perivasculares para os mecanismos de reparo tecidual. A abordagem resolve um desafio-chave na fase de descoberta: definir a origem celular e a especificidade funcional de populações semelhantes a células estromais mesenquimais em tecidos humanos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas relativas aos papéis das células perivasculares na regeneração muscular e fibrose.
- Valor Operacional: Fornece uma fonte padronizada de células endoteliais miogênicas, pericitos e células adventiciais homogêneas para desvio mecanicista de riscos.
- Valor Preditivo: Apoia a validação de alvos ao associar populações específicas do nicho vascular aos potenciais de diferenciação mesodérmica.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão para ensaios: Gera subconjuntos celulares purificados adequados para estabelecer ensaios in vitro reprodutíveis e quantitativos de migração, proliferação e diferenciação.
- Escalabilidade: O protocolo de isolamento baseado em FACS permite a produção consistente de populações celulares definidas em múltiplas amostras de doadores.
- Reutilização da plataforma: Permite que equipes multifuncionais comparem os efeitos de compostos sobre linhagens perivasculares distintas utilizando um mesmo arcabouço de isolamento.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Facilita o estudo de precursores derivados de vasos sanguíneos em modelos de lesão muscular, isquemia e fibrose.
- Continuidade Tradutiva: Mantém a estabilidade fenotípica de subconjuntos isolados durante a expansão, apoiando a análise de resposta à dose e perfil de segurança.
- Avanço Ajustado ao Risco: Permite avaliação funcional específica de linhagem para orientar decisões de prosseguimento ou interrupção no desenvolvimento pré-clínico.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na continuidade entre descoberta e pré-clínico ao fornecer uma entrada celular definida para validação de alvo, desenvolvimento de ensaios e estudos mecanicistas das contribuições do nicho vascular à regeneração.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre a origem e função de células semelhantes às CMM em músculo esquelético humano.
- Triagem: Fornece populações celulares padronizadas e purificadas, permitindo triagem confiável de compostos em linhagens perivasculares.
- Análises: Gera resultados quantificáveis por citometria de fluxo e RT-PCR para avaliar pureza, identidade e marcadores funcionais após o isolamento.
- Pesquisa Translacional: Conecta o isolamento à validação pré-clínica ao manter culturas homogêneas adequadas para estudos de eficácia e mecanismos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho de isolamento reutilizável para programas multiprojeto que investigam terapias com células estromais vasculares.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao permitir a comparação paralela de populações distintas de precursores perivasculares.
- Valor Operacional: Padroniza o isolamento por meio de FACS, melhorando a reprodutibilidade e reduzindo a variabilidade entre laboratórios.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de portfólio ao esclarecer o potencial regenerativo de células específicas derivadas do nicho vascular.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de terapias baseadas em células com base em mecanismos de ação celulares definidos.
Considerações de Implementação
- Requer experiência no manuseio de tecidos primários, digestão enzimática e citometria de fluxo.
- Depende do acesso a instrumentação de FACS e painéis de anticorpos validados para CD34, CD144, CD146, CD31, CD45 e CD56.
- Necessita de protocolos padronizados para otimização da digestão com colagenase, equilibrando rendimento e preservação de antígenos de superfície.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar a estratégia de isolamento a outras fontes de tecido ou estados patológicos.
- É limitado pela necessidade de biópsias frescas ou adequadamente preservadas de músculo esquelético humano para garantir suspensões celulares viáveis em única célula.
