Isolamento de Blood-derivado do navio Multipotentes Precursores do músculo-esquelético humano

O objetivo geral deste procedimento é isolar e purificar subconjuntos de células precursoras multipotentes derivadas de vasos sanguíneos humanos a partir de uma única biópsia de músculo esquelético primeiro, dissociar a biópsia muscular e digerir com uma combinação de colagenase tipo um, dois e quatro. Em seguida, marcar a suspensão de células únicas com anticorpos conjugados com fluorescência que reconhecem uma combinação de marcadores de superfície celular selecionados. Em seguida, realizar a triagem de células ativadas por fluorescência por citometria de fluxo.

Veja e expanda os subtipos de células classificados em condições de cultura específicas em densidades ideais. Por fim, a análise pós-classificação das células purificadas, bem como a citometria de fluxo e a análise de R-T-P-C-R subsequente dos subconjuntos de células cultivadas são usadas para mostrar a pureza desses subconjuntos de BVSE homogêneos. Sim, esse método, você sabe, pode responder realmente, você sabe, qual é a origem dessas células-tronco mesocamel?

Você sabe, porque muitas pessoas encontraram diferentes tipos de células-tronco em diferentes tecidos. Então, acho que isso pode responder à origem dessas células-tronco, bem como ao papel que as células perivasculares e quaisquer outras células derivadas de vasos sanguíneos desempenham na regeneração e reparo de tecidos. A demonstração visual deste método é crítica, assim como a biópsia muscular.

As etapas de dissociação podem ser difíceis de aprender. Detalhes técnicos e otimização da digestão da colagenase são muito críticos para o rendimento e a purificação das células-alvo. Transporte a biópsia de músculo esquelético humano na geleira.

Em DM M suplementado com 5%FBS e 1%penicilina estreptomicina sob condições estéreis. Lave o espécime duas vezes com PBS contendo 2%antibiótico antifúngico e, em seguida, em dms, suplementado com 2%aa. Remova o tecido adiposo e conjuntivo aderido.

Além disso, remova os grandes vasos sanguíneos sob um microscópio de dissecação. Agora corte o espécime muscular em pequenos pedaços. Transfira as amostras para 20 mililitros de meio de preservação para armazenamento a quatro graus Celsius por até cinco dias.

No dia da isolamento das células. Remova os pedaços musculares e lave-os duas vezes em PBS contendo 2%pen strip. Agora, para fazer a solução de digestão, adicione 100 miligramas por mililitro, cada um de colagenase tipo um, tipo dois e tipo quatro em pm.

Por fim, pique e triture mecanicamente os pedaços musculares com uma pequena quantidade de pm. Passe a solução através de uma pipeta serológica de 10 mililitros, monitorando a ausência de coagulação. Remova o tecido adiposo e conjuntivo residual durante este processo.

Em seguida, transfira metade da amostra adulta para 20 mililitros ou toda a amostra fetal para 10 mililitros da solução de digestão. Digira uma amostra por 50 a 60 minutos a 37 graus Celsius em um agitador orbital a 70 a 80 RPM. Observe o status de digestão a cada 15 a 20 minutos.

Otimize o rendimento celular e a preservação do antígeno de superfície ajustando o tempo de digestão e/ou velocidade de agitação de acordo, com base na quantidade de tecido, quando a turbidez quase desaparecer vigorosamente pipete o tecido digestivo três a cinco vezes. Adicione uma quantidade igual de PM para parar a reação e, em seguida, centrifugue a 400 Gs.Por quatro minutos, remova cuidadosamente o supra natant para lavar o pellet, ressuspensão em 10 mililitros de pm. Filtre através de um coador de células de 100 mícrons, centrifugue a 400 Gs por quatro minutos e remova cuidadosamente o SUP natant.

Em seguida, resus, suspenda os pellets em tampão de lise de eritrócitos e filtre através de um coador de células de 70 mícrons para obter uma suspensão de células únicas. Após incubação por 10 minutos à temperatura ambiente, filtre a suspensão através de um coador de células de 70 micrômetros. Se alguma precipitação for observada, pelletize as células por centrifugação resus.

Suspenda em 0,5 mililitros de PBS e conte o número de células para coloração. Dilua a suspensão de células únicas para menos de 5 milhões de células por mililitro com PBS, alíquota, 50 a cem microlitros da suspensão celular e divida em 11 tubos para o controle não colorido, os controles negativos e os controles positivos de cor única. Se necessário, bloqueie a suspensão de células únicas por 10 minutos a quatro graus Celsius em soro de camundongo.

Adicione as soluções de anticorpos de acordo com o projeto experimental e incube por 20 minutos a quatro graus Celsius. Pelletize as células por centrifugação e lave cada amostra de pellet uma vez em PM diluído a uma concentração final de 5 milhões de células por mililitro para exclusão de células mortas em uma diluição de um para 100 de sete a a d e incube por 15 minutos à temperatura ambiente para o controle negativo e os controles positivos de cor única. Ressuspensione os pellets celulares em 0,5 mililitros de PM diluído.

Transfira todas as suspensões celulares para tubos de citometria de fluxo de fundo redondo de poliestireno. Agora prepare tubos de coleta de células com 500 microlitros do meio coer apropriado. Transporte as suspensões celulares na geleira para a célula.

Classifique a execução das suspensões celulares no classificador de células na ordem do controle não colorido, controles negativos, controles positivos de cor única e a suspensão principal de células, ajustando rigorosamente a intensidade do laser, a compensação do canal e o gating da população celular para maximizar a pureza celular. Colete as populações celulares desejadas nos tubos de coleta apropriados. Armazene as células coletadas a quatro graus Celsius.

Se não semeado imediatamente. Semear recém-classificado. Células endoteliais miogênicas em MPM em placas que foram pré-codificadas com colágeno Tipo um para o subsequente empacotamento de ECS seme.

3, 500 a 4.000 células por centímetro quadrado em MPM em placas ou frascos pré-revestidos com colágeno tipo um seme. Parasitas recém-classificados em e gm dois em placas recém-revestidas com 0,2% de gelatina para a primeira e segunda passagens. Divida as células em uma proporção de um para três em meio PC em cultura de poliestireno regular.

Placas a partir de P três em diante. Veja as células em 6.500 a 7.000 células por centímetro quadrado em meio PC em placas de cultura de poliestireno regular. Frascos veja as células de tecido adventício recém-classificadas em meio AC em placas de cultura de poliestireno regular para o subsequente empacotamento de células de sementes ACS em 6.000 a 7.000 células por centímetro quadrado em meio AC em placas de cultura de poliestireno regular.

Os parâmetros dos frascos são primeiro corrigidos com base nos dados obtidos do controle não colorido, controles negativos e controles positivos de cor única após a exclusão de células mortas, a suspensão de células fluorescentes marcadas é submetida a uma série de seleções de marcadores de superfície celular negativas e positivas. Primeiro, as células CD 45 positivas são excluídas. Em seguida, as células CD 56 positivas e CD 56 negativas são separadas da fração CD 45 negativa