FIBS habilitado Noninvasive Metabolic Profiling

O objetivo geral deste procedimento é monitorar o nível de glicose ou glutamina intracelular de forma não invasiva usando biossensores baseados em proteínas geneticamente codificadas. Isso é feito primeiro seccionando as células de interesse com o gene do biossensor contendo o plasmídeo e selecionando as células que expressam o biossensor. Na segunda etapa, as amostras de cultura de células são retiradas de culturas de batelada ou alimentadas em batelada e suas taxas de traste são medidas.

A concentração intracelular de glicose ou glutamina das amostras pode então ser determinada por um ensaio independente. Em última análise, a razão de traste das amostras pode ser usada para calcular a concentração intracelular de glicose ou glutamina de forma não invasiva e em tempo real. As implicações dessa técnica se estendem para a melhoria dos bioprocessos, pois é um método confiável para obter informações metabólicas em tempo real que podem ser usadas para otimização e controle online.

Embora o método possa ser usado para fornecer informações sobre o bioprocessamento, ele também pode ser usado em outros sistemas, incluindo a detecção de marcadores de doenças. Comece revivendo células CHO em nove mililitros de meio de crescimento completo. Em seguida, gire as células, ressuspenda o pellet em 10 mililitros de crescimento fresco, médio, e conte as células por tripa em exclusão de matriz azul.

Em seguida, inicie uma cultura com uma densidade de semeadura de três vezes 10 elevado à quinta célula por mililitro em 125 mililitros. Frascos agitados a 37 graus Celsius e 5%CO2 em uma plataforma de agitação orbital. Com uma rotação de 125 RPM, subcultive as células a cada três a quatro dias no meio de crescimento completo a uma densidade de assentamento de duas vezes 10 elevado à quinta células por mililitro para transfecção celular.

Mantenha as células a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por 12 a 24 horas antes da transfecção para garantir que as células estejam se dividindo ativamente. Em seguida, depois de preparar o DNA do plasmídeo, conte as células por exclusão de tripa e matriz azul e dilua as células até um volume de trabalho de 20 mililitros de meio de cultura de células. Agitar o balão numa concentração de 125 ml na concentração de uma vez 10 elevado à sexta pilhas por mililitro.

Utilizar um kit de transfecção adequado para a linhagem celular utilizada, incluindo pelo menos um compartimento de controlo negativo que contenha células, mas sem ADN. Incube as células transfectadas por quatro dias em modo estático. Agora adicione o antibiótico apropriado para seleção de plasmídeo a uma concentração adequada, conforme determinado por uma curva de eliminação.

Por exemplo, neste estudo, o zin foi adicionado a uma concentração final de 400 gramas por mililitro para seleção das células transfectadas e, em seguida, transferiu as culturas para uma plataforma de agitação girando a 125 RPM. Troque o meio em um intervalo de tempo apropriado para a linhagem celular, adicionando antibiótico a cada vez até que as células do poço de controle tenham morrido. Use os poços mais confluentes para progredir para as culturas agitadas.

Em seguida, congele as células em frascos criogênicos contendo uma vez 10 elevado à sétima células viáveis em um mililitro de mistura de congelamento para gerar curvas de crescimento em lote e alimentadas em lote. Primeiro, estabelecer culturas de células triplicadas das células CHO transfectadas em frascos Shake de 250 mililitros com um volume de trabalho de 50 mililitros. Em seguida, coloque as culturas em uma incubadora de células umidificadas com agitação e remova amostras de 4,1 mililitros de cada cultura em intervalos de 24 horas Para as culturas em lote Fed, suplemente as células com a quantidade apropriada de glicose ou glutamina no sexto dia para restaurar suas concentrações aos seus valores iniciais.

Alimentando as culturas controle com o mesmo volume de água pura, use 100 microlitros das amostras de 4,1 mililitros de 4,2 diariamente para contar as células por trip e exclusão de matriz azul até que a concentração de células viáveis seja reduzida a zero. Para determinar as medições da taxa de traste, centrifugue dois mililitros das amostras diárias e ressuspenda o pellet em dois mililitros de PBS gelado, transfira metade da suspensão da célula para uma placa de seis poços e adicione uma amostra em branco sem células a uma. Bem, então meça imediatamente os níveis de fluorescência azul e amarela em um comprimento de onda de excitação de 430 com uma largura de banda de 35 nanômetros e comprimentos de onda de missão de 465 com uma largura de banda de 35 nanômetros e 520 com uma largura de banda de 10 nanômetros para a fluorescência azul e amarela, respectivamente.

Calcule as proporções de traste determinando a razão entre a fluorescência amarela detectada e a fluorescência azul. Agora gire os dois mililitros finais das amostras diárias e lave o pellet duas vezes em PBS gelado após a segunda lavagem. Sonicar a amostra cinco vezes durante três minutos de cada vez, com um impulso de 15 segundos ligado e 15 segundos desligado.

Finalmente, execute os ensaios de metabólitos de acordo com as instruções do fabricante e use as curvas padrão resultantes para calcular os níveis intracelulares de glicose ou glutamina, conforme apropriado. Neste experimento representativo, culturas em lote de duas linhagens celulares foram mantidas, conforme demonstrado, com amostras diárias usadas para a calibração in vivo de cada fibs. Um perfil de crescimento celular viável representativo das duas linhagens celulares em relação aos seus níveis intracelulares de glicose ou glutamina é demonstrado neste gráfico e as medições de trastes correspondentes e concentrações de metabólitos intracelulares determinadas pelos ensaios enzimáticos são apresentadas nesta tabela.

Foi determinado que o baixo número de células presentes nos primeiros quatro dias de cultura levou a um sinal de traste não confiável. Da mesma forma, o alto nível de lisado celular presente após o oitavo dia de cultura produziu uma grande quantidade de espalhamento de luz. Portanto, apenas os dados dos dias quatro a oito são usados para construir as curvas de calibração para as fibs de glicose e glutamina.

Os resultados indicam que o sinal FIB produz uma correlação confiável com as concentrações intracelulares entre um e cinco milimolares para glicose e 0,3 e dois milimolares para glutamina. Para validar os achados de fibs, foram realizadas culturas alimentadas com trituração das duas linhagens celulares. Um alimento contendo uma alta concentração de substrato foi suplementado no sexto dia da cultura de células para elevar as concentrações extracelulares do substrato.

Como os enxertos representam, as proporções de trastes em cada dia exibem uma resposta clara à alimentação. Ao reverter a tendência, eles seguiram até o sexto dia. Por exemplo, nas culturas alimentadas com glicose, a concentração de glicose extracelular aumentou até 36 milimolares.

Enquanto nas culturas alimentadas com glutamina, a concentração de glutamina aumentou para quatro milimolares. No experimento de glicose, a razão de trastes para a linhagem celular escolhida por glicose diminuiu no sétimo dia em resposta à adição de glicose. Uma vez que as fibrilações de glicose seguem o APO na configuração.

Da mesma forma, no experimento com glutamina, a razão de trastes para a linhagem celular escolhida pela glutamina aumentou em resposta à adição de glutamina de acordo com o princípio dos sensores APO off. Essas medições de trastes foram finalmente usadas para calcular as concentrações intracelulares correspondentes de glicose e glutamina com base nas curvas de calibração acima mencionadas. Eles são comparados com as concentrações intracelulares reais desses substratos, conforme determinado com os ensaios enzimáticos de glicose e glutamina, e mostram concordância adequada após seu desenvolvimento.

Essa técnica abre caminho para pesquisadores da área de explorar o efeito de diferentes formulações de meio na produtividade de proteínas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar biossensores geneticamente codificados para monitorar as concentrações de metabólitos intracelulares.