Isolamento simultâneo e cultura de miócitos atrial, miócitos ventriculares e não-miócitos de um coração de rato adulto

Olá, sou Chris Glembotski. Sou professor de medicina na Faculdade de Medicina da Universidade do Arizona em Phoenix. E eu sou o diretor do Centro Cardiovascular Translacional também localizado aqui em Phoenix.

Gostaria de apresentar a vocês hoje duas pessoas que vão demonstrar nossa nova técnica, o Dr. Erik Blackwood, meu colega sênior de pós-doutorado e professor de treinamento, e a pesquisadora associada sênior Miss Alina Bilal. Os protocolos atuais de isolamento de miócitos cardíacos limitam a quantidade e a viabilidade das células em cultura, criando um impasse experimental para aprofundar nossa compreensão da fisiologia e fisiopatologia cardíaca. Este protocolo visa não apenas agilizar o processo de isolamento de células cardíacas murinas adultas, mas também aumentar o rendimento celular e a viabilidade das células cardíacas atriais e ventriculares simultaneamente a partir de um único coração de camundongo.

Essa técnica tem profundas implicações para a descoberta terapêutica e que doenças como a fibrilação atrial podem ser melhor caracterizadas em um nível específico do tipo de célula, permitindo a identificação de alvos terapêuticos. Recomendamos que indivíduos sem experiência microcirúrgica prévia pratiquem extensivamente as etapas de explante e canulação da aorta ascendente antes de tentar o protocolo de isolamento completo. Comece usando uma tesoura para fazer uma incisão na pele na linha média para abrir rapidamente o peito de um camundongo C57 preto 6J anestesiado de 10 semanas de idade do meio do abdômen até a mandíbula.

Entre no peritônio e limpe o diafragma por dissecção romba. Corte a caixa torácica com incisões ao longo da parede torácica na face lateral de ambos os lados e corte as conexões fibrosas entre o coração e a parede torácica. Após a remoção completa da caixa torácica, use uma pequena pinça e uma tesoura para levantar suavemente o coração pelo ápice, expondo a face posterior do coração.

Para explantar o coração, disseque imediatamente inferior à artéria inominada na aorta ascendente e coloque imediatamente o coração em meio de perfusão cardíaca gelada. Disseque rapidamente o tecido restante para expor a aorta ascendente e use pinças e tesouras de microdissecação para limpar a área ao redor da aorta do excesso de tecido. Use uma pinça de ponta fina para posicionar a aorta limpa dois milímetros em uma cânula de perfusão e prenda a cânula com uma sutura de seda 5-0.

Lave o coração canulado com meio de perfusão cardíaca a uma taxa de fluxo de três mililitros por minuto por quatro minutos antes de mudar para o tampão de digestão por 15 a 17,5 minutos. Durante os minutos finais da perfusão, colete oito mililitros do fluxo do tampão de digestão e transfira o coração da cânula para uma placa de cultura plástica de 60 milímetros, remova o excesso de tecido e mergulhe o coração em 2,5 mililitros do tampão de digestão. Para isolamento de células atriais, disseque os átrios longe do coração e coloque os átrios em uma placa de cultura de plástico de 30 milímetros contendo 750 microlitros de tampão de digestão.

Usando uma tesoura cirúrgica de ponta fina, pique e separe os átrios antes de dissecar o tecido com uma pinça fina sem agitar ou separar as fibras musculares. Usando uma ponta de pipeta de transferência estéril, continue a misturar e dissociar suavemente o tecido por 15 minutos. A cada cinco minutos, observe a dissociação do miócito atrial sob a objetiva de 10X de um microscópio de campo claro.

À medida que o tecido é digerido, continue misturando e dissociando suavemente o tecido usando uma ponta de pipeta de transferência estéril com um tamanho de poro menor antes de transferir a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga estéril de dois mililitros. Enxágue a placa de 30 milímetros com 750 microlitros de tampão de parada de miócito de 37 graus Celsius e combine o tampão com a suspensão celular. Deixar sedimentar os miócitos atriais por gravidade e agitação suave durante 10 minutos à temperatura ambiente.

Quando um projétil visível se formar, centrifugue a suspensão celular e transfira o sobrenadante não miócito para um tubo cônico de polipropileno de 15 mililitros sem perturbar o projétil do miócito atrial. Centrifugue a fração não miócito e ressuspenda o pellet não miócito em 10 mililitros de DMEM suplementado com 10% de soro fetal de bezerro. Após a contagem, coloque as células não miócitos na densidade experimental apropriada para análise a jusante e, em seguida, ressuspenda o pellet de miócitos atriais isolado na concentração experimental apropriada para semeadura em placas de cultura revestidas com laminina.

Para o isolamento das células ventriculares, pique o tecido cardíaco ventricular conforme demonstrado para a amostra de tecido atrial e transfira a suspensão celular resultante para um tubo cônico de polipropileno de 15 mililitros contendo 2,5 mililitros de tampão de parada de miócito de 37 graus Celsius. Enxágue a placa de dissecção com 2,5 mililitros de tampão de parada de miócitos a 37 graus Celsius e combine a lavagem com a suspensão celular. Usando uma pipeta de transferência estéril, continue a misturar e dissociar suavemente o tecido por quatro minutos.

No final da incubação, use uma alíquota de 10 microlitros das células para verificar a presença de miócitos em forma de bastonete. Passe a suspensão celular por um filtro de náilon estéril de 100 microlitros para um tubo cônico de polipropileno de 50 mililitros e use dois mililitros do tampão de digestão coletado anteriormente para lavar as células restantes do filtro de náilon estéril. Deixar sedimentar os miócitos ventriculares por gravidade durante seis minutos, com agitação suave, até se formar um sedimento visível no fundo do tubo.

Usando uma ponta de pipeta estéril, transfira o sobrenadante contendo não miócito para um tubo cônico de polipropileno de 15 mililitros sem perturbar o pellet de miócitos ventriculares e centrifugue a fração não miócito. Ressuspenda o pellet sem miócitos em 10 mililitros de DMEM suplementado com 10% de soro fetal de bezerro para contagem e plaquee as células na concentração apropriada para sua análise a jusante, em seguida, ressuspenda os miócitos ventriculares isolados em dois mililitros de miócito, parando o tampão dois para contagem. Para estabelecer uma reintrodução gradual do cálcio paradigmático, adicione 50 microlitros de cloreto de cálcio 10 milimolar à suspensão de células de miócitos ventriculares com mistura completa para uma incubação de quatro minutos à temperatura ambiente.

No final da incubação, adicione mais 50 microlitros de cloreto de cálcio 10 milimolar às células com mistura para outra incubação de quatro minutos em temperatura ambiente. Em seguida, trate as células com uma incubação de quatro minutos com 100 microlitros de cloreto de cálcio 10 milimolar e uma incubação de quatro minutos com 80 microlitros de cloreto de cálcio 10 milimolar. Após a última incubação, ressuspender os miócitos ventriculares tratados com cálcio em um volume apropriado de meio de plaqueamento de miócitos ventriculares de acordo com a análise planejada a jusante e semear as células em placas de cultura revestidas com laminina.

Após uma hora, substitua o sobrenadante por meio de manutenção de miócitos ventriculares suplementado com 25 micromolares de Blebbistatina. A troponina T do músculo cardíaco é um marcador de miócitos cardíacos e é expressa de forma robusta em culturas de miócitos cardíacos atriais e ventriculares. Em contraste, o peptídeo natriurético atrial e a cadeia leve de miosina dois são expressos de forma robusta e específica em culturas de miócitos cardíacos atriais e ventriculares, respectivamente.

Os marcadores de fibroblastos são expressos exclusivamente em culturas não miócitos isoladas de câmaras atriais e ventriculares. A imunomarcação de miócitos atriais de camundongos adultos e de miócitos ventriculares de camundongos adultos para o marcador de túbulos T di-hidropiridina e o receptor de rianodina demonstra túbulos T intactos durante todo o isolamento e cultura de longo prazo. O padrão de estriamento sarcomérico pode ser usado para avaliar a pureza e a viabilidade de miócitos cardíacos isolados em conjunto com a morfologia em forma de bastonete e a coloração nuclear com TO-PRO-3.

Como esperado, os miócitos cardíacos ventriculares são grandes, exibindo um comprimento médio de aproximadamente 150 micrômetros, enquanto os miócitos cardíacos atriais têm em média aproximadamente 75 micrômetros. Além disso, após a análise de imunocoloração, os miócitos cardíacos atriais exibem uma expressão robusta do peptídeo natriurético atrial em um padrão de coloração característico da localização no retículo endoplasmático e nos grânulos secretores. Enquanto os miócitos atriais secretam peptídeo natriurético atrial em condições basais, a secreção aumenta em resposta aos secretagogos.

Além disso, os miócitos cardíacos atriais secretam peptídeo natriurético atrial e a co-secreção processa apenas uma parte do hormônio de seu estado precursor para o peptídeo produto. Os erros evitáveis mais comuns incluem não manter o animal calmo antes do sacrifício, não evacuar bolhas de ar do sistema de perfusão e o próprio cirurgião não manter a calma. Após este procedimento, qualquer procedimento experimental comum pode ser realizado, incluindo ensaios de parâmetros eletrofisiológicos e de manuseio de cálcio, imunocitoquímica, resposta hipertrófica e estudos de sinalização e estudos de reperfusão de isquemia simulada.