Name: Isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco cardíacas do coração de rato adulto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Aprenda a isolar, caracterizar e diferenciar células-tronco cardíacas de coração de rato adulto usando centrifugação em gradiente de densidade. Este método padronizado oferece uma abordagem econômica para pesquisas em terapia cardíaca regenerativa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho é apoiado, em partes, por subvenções a National Institutes of Health, HL-113281 e HL116205 para Paras Kumar Mishra.

A habitação, anestesia e sacrifício de ratos foram realizados seguindo o protocolo aprovado IACUC do centro médico da Universidade de Nebraska.
1. materiais
<ol><li>Uso 10 a 12-semanas C57BL/6J preto camundongos machos, mantidos internamente à instalação de animais institucional, para o isolamento de CSCs. CSCs podem também ser isolado de ratos fêmeas não-grávidas.</li>
	<li>Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos necessários, incluindo tesouras cirúrgicas, bem tesoura cirúrgica, pinça de haste curvada e uma lâmina cirúrgica, por autoclavagem-los antes da eutanásia do mouse.</li>
	<li>Preparar os buffers de isolamento CSC em uma condição esterilizada e armazená-los em 4 ° C no gelo. Esses buffers incluem polysucrose e uma solução de diatrizoate de sódio ajustada para uma densidade de 1,077 g/mL, Dulbecco incompleta modificado médio da águia, do 1 x presunto balanceamento de solução salina (HBSS) e cultura-grau 1 x tampão fosfato salino (PBS) da pilha. Prepare uma solução 1% colagenase II estoque (filtrada e esterilizada) e uma solução de trabalho de 0,2% em HBSS.</li>
	<li>Mantenha os materiais de cultura de tecidos na condição esterilizada na biossegurança do gabinete, incluindo um prato de Petri de 10 mm, uma placa 6, uma placa 24, T-25 e T-75 frascos de cultura, tubos cônicos de 15 mL e 50 mL e pipetas descartáveis com 40 µm e 100 -filtros de célula µm com filtros de 0,22 µm.</li>
	<li>Esterilize a 10 µ l, 200 µ l e pontas de pipetas 1.000 µ l por autoclave.</li>
	<li>Utilize luvas de nitrilo sem pó e etanol a 70% para manter uma condição estéril durante todo o experimento.</li>
	<li>Use água sanitária 10% como um desinfetante.</li>
	<li>Use comercialmente disponível meio de manutenção do CSC e cardiomyocytes meio de diferenciação para a cultura e a diferenciação de CSCs, respectivamente.</li>
</ol>2. método isolamento de células-tronco cardíacas
<ol><li>Eutanásia em quatro ou cinco adulto do sexo masculino (ou feminino não grávidas) ratos utilizando uma câmara de2 CO. Consertar armas do cada rato em um cartão separado dissecação com pinos ou fitas adesivas.</li>
	<li>Pulverize o etanol a 70% sobre o mouse para se livrar dos germes externos e manter a condição esterilizada durante a colheita do coração. Fazer uma incisão com uma tesoura no meio do abdômen e cortar a pele do abdômen até o tórax em linha reta. Retire a pele de ambos os lados do corte médio para limpar a área abdominal de pele e pelos. Usando uma tesoura e pinça, corte o diafragma abaixo da caixa torácica.</li>
	<li>Abra a cavidade torácica do mouse pelo corte da caixa torácica dentro do capô. Expor o coração e remover o sangue perto do coração. Lave a área circundante do coração com PBS gelado para se livrar de qualquer sangue nas proximidades do coração.</li>
	<li>Disse o coração usando uma pinça e tesoura cirúrgica. Coloque o coração em um prato de Petri de 100mm contendo 10 mL de PBS gelado.</li>
	<li>Palpitar o coração usando pinça haste curvada e remover o sangue residual dentro do coração.</li>
	<li>Use o coração inteiro para o isolamento do CSCs.</li>
	<li>Transferi todos os quatro ou cinco corações todo para um tubo cónico de 50 mL contendo 10 mL de HBSS gelada. Mantenha o tubo no gelo até o processamento adicional.</li>
	<li>Limpe dentro e fora da Biossegurança armário com etanol a 70% para criar um ambiente esterilizado. Esterilize o tubo que contém o coração e outros materiais necessários com etanol a 70%. Coloca o tubo que contém o coração a biossegurança do armário para processamento adicional.</li>
	<li>Transferi os corações para um prato de Petri-100mm contendo 10 mL de HBSS gelada. Lave novamente os corações por palpar para remover qualquer sangue residual dentro do coração. Altere a solução HBSS depois de cada lavagem para garantir a remoção completa do sangue.</li>
	<li>Corte os corações em pedaços pequenos, usando uma tesoura cirúrgica fina ou uma lâmina cirúrgica em um prato de Petri-100mm contendo 5-7 mL de solução HBSS. Segure cada coração com um par de pinças e usar um par de tesouras cirúrgicas de bem ou uma lâmina de cortar o coração em pedaços de 2 a 4 mm. Altere a solução HBSS com frequência para garantir HBSS livre de sangue. Picar os corações na solução HBSS.</li>
	<li>Centrifugue o tecido picado em 500 x g a 4 ° C por 5 min. descartar o sobrenadante e manter a pelota.</li>
	<li>Resuspenda o pellet em 5-6 mL de solução II de colagenase de 0,2% em um tubo cónico de 50 mL. O volume de solução de colagenase deve tornar a ser quase 1.5 - a 2 vezes o volume da pelota. Nota: para a digestão do tecido, colagenase 0,2% eu e 2,5 U/mL de solução de dispase pode substituir colagenase 0,2% II. Use um volume quase igual de solução de dispase para a colagenase solução.</li>
	<li>Misture bem a pelota com solução a 0,2% colagenase II, agitando o tubo ou agite o tubo num agitador a 75 x g durante 45-60 min a 37 ° C. Agite o tubo vigorosamente à mão após cada 20-30 min para realçar a Lise.</li>
	<li>Triture a mistura de tecidos lisados utilizando uma pipeta sorológica 5ml e uma ponta da pipeta de 1 mL para dissociar o pedaço de tecido para a suspensão de célula única. Nota: Para obter a máxima recuperação dos CSCs, Triture a mistura de Lise pelo menos 5 min. Se os pedaços de tecido são relativamente grandes, corte a ponta de uma ponta da pipeta de 1 mL com tesoura ou lâmina cirúrgica e usá-lo para trituração.</li>
	<li>Pare a Lise enzimática do tecido adicionando comercialmente disponível meio de manutenção do CSC. Adicione quase 2-3x tanto meio de manutenção como o volume dos tecidos lisados na etapa 2.14.</li>
	<li>Passe a suspensão de eritrócitos digerido através de um filtro de célula de 100 µm para remover quaisquer pedaços de tecido não digerido.</li>
	<li>Repita a etapa 2.16 usando um coador de célula de 40 µm.</li>
	<li>Separe as células através de centrifugação gradiente de densidade. Para a separação de células, suavemente sobreposição igual volume do filtrado com solução de diatrizoate de polysucrose e de sódio. Por exemplo, em primeiro lugar, adicionar 20 mL de solução de diatrizoate de polysucrose e de sódio em um tubo cónico de 50 mL e em seguida, adicionar 20 mL do filtrado da etapa 2.17 sobre a solução de diatrizoate de polysucrose e de sódio. Nota: Durante a polysucrose e solução de diatrizoate de sódio a 37 ° C antes de usam com as células. Adicionar ao filtrado da etapa 2.17 sobre a solução de diatrizoate de polysucrose e de sódio muito lentamente e com cuidado para evitar qualquer mistura das duas soluções. Isto é considerado um passo crucial.</li>
	<li>Centrifugar o tubo contendo ambas as soluções a 500 x g por 20 min à temperatura ambiente utilizando uma centrífuga de balde de balanço. Defina o centrifugador a uma velocidade inferior de aceleração e desaceleração, para evitar misturar as duas soluções e para a separação adequada dos CSCs. Este é um passo importante no isolamento de CSC. Colocar o tubo contendo a mistura gradiente muito lentamente sem perturbação dentro da centrifuga e configurá-lo para centrifugação.</li>
	<li>Tire o casaco buffy junto com solução extra da camada superior usando uma pipeta de 1 mL ou uma pipeta Pasteur plástica em um tubo esterilizado 15 mL. Esta camada de buffy conterá os CSCs. Nota: Tomar precauções extras durante a pipetagem do buffy coat para não tirar a camada de solução de diatrizoate de polysucrose e de sódio, porque é tóxico para CSCs.</li>
	<li>Adicione igual volume de meio de manutenção do CSC para a suspensão de células da etapa 2,20 e misturá-lo corretamente para neutralizar o polysucrose residual e a solução de diatrizoate de sódio, se estiver presente.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão celular acima de 500 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.</li>
	<li>Resuspenda o pellet em 7-10 mL de meio DMEM incompleto e centrifuga-lo a 500 x g por 5 min a 4 ° C, para se livrar de qualquer polysucrose residual e a solução de diatrizoate de sódio.</li>
	<li>Colete o sedimento, que contém os CSCs purificadas.</li>
	<li>Resuspenda o pellet em 1 mL de meio de manutenção do CSC, contar o número de CSC e usar o pellet de cultura. Para contar o número de CSC, use coloração azul Trypan e um hemocytometer. Com quatro corações de ratos masculinos, o rendimento do CSCs é ~1.8 milhões.</li>
	<li>Semente do CSCs em uma placa de cultura de 6-Poços revestidos com uma solução de 0,02% gelatina contendo 0,5% de fibronectina. Uso 2 mL do meio de manutenção completa para propagação. Incube a placa de cultura numa incubadora a 37 ° C com 5% de CO2.</li>
	<li>Substitua o meio de cultura CSCs meio de manutenção do CSC completo todos os dias até o terceiro dia. Depois disso, altere o meio em dias alternados.</li>
	<li>Determine o crescimento dos CSCs, observá-los sob um microscópio.</li>
</ol>3. cultura de manutenção e passagem de células-tronco cardíacas
<ol><li>Cultura do CSCs isoladas em meio de manutenção disponível comercialmente. Substitua o meio de cultura com meio de manutenção fresco em dias alternados. Quando a cultura de CSC alcançou a confluência, transferi os CSCs para uma nova placa revestida com gelatina e fibronectina, como mencionado na etapa 2.26. Desanexe os CSCs cultivadas pelo buffer de dissociação enzimática da célula. Siga o protocolo padrão de dissociação celular da placa de cultura. Nesta fase, CSCs são considerados na passagem 0 palco (P0).</li>
	<li>Cultura P0 CSCs em uma gelatina nova placa revestida de fibronectina em meio de manutenção completo do CSC a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 , permitir que eles sejam confluente e então siga passo 3.1 para obter passagem 1 (P1) CSCs. loja P1 CSCs em nitrogênio líquido ou usá-los para tranforme em mentos.</li>
	<li>Sementes de 0,5 milhões de células em uma placa de 6 ou 1 milhão em T-25 para manter a cultura de CSC em seu estágio inicial.</li>
	<li>Os CSCs quando tornam-se 85% - 90% de confluencia de passagem. CSCs podem ser cultivadas em meio de manutenção até quatro a seis semanas. Nota: Manter a densidade de semeadura inicial dos CSCs relativamente elevadas (40% - 50%) porque, em uma menor densidade de semeadura, os CSCs podem mudar sua morfologia plana e alongada.</li>
</ol>4. caracterização de células-tronco cardíacas
<ol><li>Para caracterizar os CSCs culturas, observá-los sob um fago-contraste ou um microscópio de campo claro. Coloque a placa CSC-contendo no objectivo de um microscópio fluorescente. Defina a ampliação bastante baixa (10 X) para concentrar as células. Use o contraste de fase abertura para observar as células. Aumentar a ampliação de 20 X alterando a lente objetiva e o CSCs. aumento o objetivo de 40 X de imagem e imagem do CSCs. Em dois dias, os CSCs aparecem quase redondos em forma, mas o tamanho da célula aumenta com o tempo e em sete dias, os CSCs aparecem quase cilíndricos em forma (Fig. 1A - 1C).</li>
	<li>Executar imunocoloração dos CSCs com marcadores de pluripotência/stemness (OCT4, SOX2 ou Nanog), proliferação (Ki-67) (Fig. 2A - 2D) e células de origem cardíaca/progenitoras (Sca-1, NKX2-5 ou GATA4) (Figura 3A - 3C).<ol>
<li>Para a imunocoloração dos CSCs, sementes 10.000 CSCs em uma placa de cultura de 24-bem.</li>
		<li>No dia seguinte (após 18-24 h), corrigi os CSCs em 300 µ l de paraformaldeído 4% por 10 min.</li>
		<li>Lave os CSCs com 500 µ l de PBS gelado, 3x com intervalos de 5 min.</li>
		<li>Permeabilize os CSCs com 300 µ l de 0,2% Triton X-100 diluído em PBS por 10 min.</li>
		<li>Lave os CSCs com 500 µ l de PBS gelado, 3x com intervalos de 5 min.</li>
		<li>Realizar o bloqueio dos CSCs com 300 µ l de BSA 1% diluído em PBST (PBS + 0.1% Tween 20) ou 300 µ l de soro normal frango 10% diluído em PBST por 1h.</li>
		<li>Incubar os CSCs em 200 µ l de anticorpo primário diluído no bloqueio de solução durante a noite a 4 ° C. Dilua o anticorpo primário, como recomendado pela folha de dados de anticorpos ou conforme padronização.</li>
		<li>Lave os CSCs com 500 µ l de PBS gelado, 3x com intervalos de 5 min.</li>
		<li>Incubar os CSCs em 200 µ l de anticorpo secundário diluído em solução de bloqueio (ver passo 4.2.6) por 1h à temperatura ambiente. Dilua o anticorpo secundário, como recomendado pela folha de dados de anticorpos ou conforme padronização.</li>
		<li>Lave os CSCs com 500 µ l de PBS gelado, 3x com intervalos de 5 min.</li>
		<li>Counterstain os CSCs com 200 µ l de DAPI (1 µ g/mL) diluído em PBS por 5 min.</li>
		<li>Lave os CSCs 1 x com 500 µ l de PBS gelado. Em seguida, adicione 300 µ l de PBS gelado em cada poço.</li>
		<li>Execute a imagem usando um microscópio de fluorescência. Siga as instruções de fluorescente de imagem, tais como evitar a luz direta na placa. Manter a placa de cultura sob o microscópio. Concentre-se as células em diferentes ampliações. Observar as células sob contraste de fase e/ou filtros de excitação diferentes e salvar as imagens.</li>
		<li>Armazenar a placa no escuro a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. diferenciação de células-tronco cardíacas em casos
<ol><li>A diferenciação de CSCs, sementes 500.000 CSCs em uma placa de 6 com 2 mL de meio de manutenção de CSC comercialmente disponível durante (37 ° C).</li>
	<li>Incubar a placa contendo os CSCs numa incubadora de CO2 a 37 ° C. Permitir que o CSCs anexar e proliferar até crescimento secundário confluente. Se o meio fica amarelo, substitua o meio de cultura com meio de manutenção fresco.</li>
	<li>Na confluência de 85-90%, substituir o meio de manutenção com 2 mL de cardiomyocytes durante (37 ° C) meio de diferenciação. Incube a placa numa incubadora de CO2 a 37 ° C por até 2-3 semanas.</li>
	<li>Altere o meio de diferenciação cada 2-3 m. observar a morfologia do CSCs sob um microscópio cada vez durante o médio mudar para garantir as condições de boa cultura.</li>
	<li>Depois d 12 da cultura CSC num meio de diferenciação, imagem os CSCs para marcadores de diferenciação, seguindo um padrão immunostaining protocolo (consulte as etapas 4.2.1 - 4.2.14). Salve as imagens fluorescentes para a expressão de marcadores cardiomyocytes (Figura 4A - 4B).</li>
</ol>

<ol><li>Benjamin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+Disease+and+Stroke+Statistics-2017+Update%3A+A+Report+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 135, e146(2017).</li>
<li>Nguyen, P. K., Rhee, J. W., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+Stem+Cell+Therapy+and+Heart+Failure%2C+2000+to+2016%3A+A+Systematic+Review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Medical+Association+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Adult Stem Cell Therapy and Heart Failure, 2000 to 2016: A Systematic Review.</a> The Journal of the American Medical Association Cardiology. 1, 831-841 (2000).</li>
<li>Emmert, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+efficacy+of+cardiopoietic+stem+cells+in+the+treatment+of+post-infarction+left-ventricular+dysfunction+-+From+cardioprotection+to+functional+repair+in+a+translational+pig+infarction+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Safety and efficacy of cardiopoietic stem cells in the treatment of post-infarction left-ventricular dysfunction - From cardioprotection to functional repair in a translational pig infarction model.</a> Biomaterials. 122, 48-62 (2017).</li>
<li>Silvestre, J. S., Menasche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Evolution+of+the+Stem+Cell+Theory+for+Heart+Failure%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">The Evolution of the Stem Cell Theory for Heart Failure.</a> EBioMedicine. 2, 1871-1879 (2015).</li>
<li>Terzic, A., Behfar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+therapy+for+heart+failure%3A+Ensuring+regenerative+proficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Stem cell therapy for heart failure: Ensuring regenerative proficiency.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 26, 395-404 (2016).</li>
<li>Yamada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+therapy+of+heart+failure+in+genetic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell therapy of heart failure in genetic cardiomyopathy.</a> Stem Cells. 26, 2644-2653 (2008).</li>
<li>Sadek, H. A., Martin, C. M., Latif, S. S., Garry, M. G., Garry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone-marrow-derived+side+population+cells+for+myocardial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Bone-marrow-derived side population cells for myocardial regeneration.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 173-181 (2009).</li>
<li>Vrtovec, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+intracoronary+CD34%2B+stem+cell+transplantation+in+nonischemic+dilated+cardiomyopathy+patients%3A+5-year+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of intracoronary CD34+ stem cell transplantation in nonischemic dilated cardiomyopathy patients: 5-year follow-up.</a> Circulation Research. 112, 165-173 (2013).</li>
<li>Hare, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+allogeneic+vs+autologous+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+delivered+by+transendocardial+injection+in+patients+with+ischemic+cardiomyopathy%3A+the+POSEIDON+randomized+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial.</a> The Journal of American Medical Association. 308, 2369-2379 (2012).</li>
<li>Guijarro, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0167527316302285">Intramyocardial transplantation of mesenchymal stromal cells for chonic myocardial ischemia and impaired left ventricular function: Results of the MESAMI 1 pilot trial.</a> International Journal of Cardiology. 209, 258-265 (2016).</li>
<li>Bobi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+Administration+of+Allogeneic+Adipose+Tissue-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+Improves+Myocardial+Perfusion+But+Not+Left+Ventricle+Function%2C+in+a+Translational+Model+of+Acute+Myocardial+Infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Intracoronary Administration of Allogeneic Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells Improves Myocardial Perfusion But Not Left Ventricle Function, in a Translational Model of Acute Myocardial Infarction.</a> Journal of the American Heart Association. 6, (2017).</li>
<li>Suzuki, E., Fujita, D., Takahashi, M., Oba, S., Nishimatsu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue-derived+stem+cells+as+a+therapeutic+tool+for+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue-derived stem cells as a therapeutic tool for cardiovascular disease.</a> World Journal of Cardiology. 7, 454-465 (2015).</li>
<li>Gao, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+infusion+of+Wharton%27s+jelly-derived+mesenchymal+stem+cells+in+acute+myocardial+infarction%3A+double-blind%2C+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medicine%22%5BJournal%5D)">Intracoronary infusion of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells in acute myocardial infarction: double-blind, randomized controlled trial.</a> BMC Medicine. 13, 162(2015).</li>
<li>Simpson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strong+regenerative+ability+of+cardiac+stem+cells+derived+from+neonatal+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A strong regenerative ability of cardiac stem cells derived from neonatal hearts.</a> Circulation. , S46-S53 (2012).</li>
<li>Kazakov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-kit%28%2B%29+resident+cardiac+stem+cells+improve+left+ventricular+fibrosis+in+pressure+overload%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">C-kit(+) resident cardiac stem cells improve left ventricular fibrosis in pressure overload.</a> Stem Cell Research. 15, 700-711 (2015).</li>
<li>Ong, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross+talk+of+combined+gene+and+cell+therapy+in+ischemic+heart+disease%3A+role+of+exosomal+microRNA+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cross talk of combined gene and cell therapy in ischemic heart disease: role of exosomal microRNA transfer.</a> Circulation. 130, S60-S69 (2014).</li>
<li>Sahoo, S., Losordo, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+cardiac+repair+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Exosomes and cardiac repair after myocardial infarction.</a> Circulation Research. 114, 333-344 (2014).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreatment+of+Cardiac+Stem+Cells+With+Exosomes+Derived+From+Mesenchymal+Stem+Cells+Enhances+Myocardial+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Pretreatment of Cardiac Stem Cells With Exosomes Derived From Mesenchymal Stem Cells Enhances Myocardial Repair.</a> Journal of the American Heart Association. 5, (2016).</li>
<li>Ibrahim, A. G., Cheng, K., Marban, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+as+critical+agents+of+cardiac+regeneration+triggered+by+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Exosomes as critical agents of cardiac regeneration triggered by cell therapy.</a> Stem Cell Reports. 2, 606-619 (2014).</li>
<li>Emanueli, C., Shearn, A. I., Angelini, G. D., Sahoo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+exosomal+miRNAs+in+cardiovascular+protection+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Exosomes and exosomal miRNAs in cardiovascular protection and repair.</a> Vascular Pharmacology. 71, 24-30 (2015).</li>
<li>Menasche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+cell+therapy%3A+lessons+from+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac cell therapy: lessons from clinical trials.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50, 258-265 (2011).</li>
<li>Trounson, A., McDonald, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Therapies+in+Clinical+Trials%3A+Progress+and+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges.</a> Cell Stem Cell. 17, 11-22 (2015).</li>
<li>Takamiya, M., Haider, K. H., Ashaf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+novel+multipotent+sub-population+of+Sca-1%28%2B%29+cardiac+progenitor+cells+for+myocardial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a novel multipotent sub-population of Sca-1(+) cardiac progenitor cells for myocardial regeneration.</a> PLoS One. 6, e25265(2011).</li>
<li>Cambria, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+cardiac+stem+cell+therapy%3A+advancing+from+first-generation+to+next-generation+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Translational cardiac stem cell therapy: advancing from first-generation to next-generation cell types.</a> NPJ Regenerative Medicine. 2, 17(2017).</li>
<li>Bruyneel, A. A., Sehgal, A., Malandraki-Miller, S., Carr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Therapy+for+the+Heart%3A+Blind+Alley+or+Magic+Bullet%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Therapy for the Heart: Blind Alley or Magic Bullet?</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 9, 405-418 (2016).</li>
<li>Garbern, J. C., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+stem+cell+therapy+and+the+promise+of+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration.</a> Cell Stem Cell. 12, 689-698 (2013).</li>
<li>Oh, H., Ito, H., Sano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+to+success+in+heart+failure%3A+Cardiac+cell+therapies+in+patients+with+heart+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Challenges to success in heart failure: Cardiac cell therapies in patients with heart diseases.</a> Journal of Cardiology. 68, 361-367 (2016).</li>
<li>Smith, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+resident+endogenous+c-Kit%2B+cardiac+stem+cells+from+the+adult+mouse+and+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart.</a> Nature Protocols. 9, 1662-1681 (2014).</li>
<li>Rutering, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Method+for+Isolation+of+Neonatal+Rat+Cardiomyocytes+with+Increased+Yield+of+C-Kit%2B+Cardiac+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Improved Method for Isolation of Neonatal Rat Cardiomyocytes with Increased Yield of C-Kit+ Cardiac Progenitor Cells.</a> Journal of Stem Cell Research and Therapy. 5, 1-8 (2015).</li>
<li>Saravanakumar, M., Devaraj, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+homing+pattern+of+c-kit%2B+Sca-1%2B+CXCR4%2B+resident+cardiac+stem+cells+in+neonatal%2C+postnatal%2C+and+adult+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Distribution and homing pattern of c-kit+ Sca-1+ CXCR4+ resident cardiac stem cells in neonatal, postnatal, and adult mouse heart.</a> Cardiovascular Pathology. 22, 257-263 (2013).</li>
<li>Monsanto, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+Isolation+of+3+Distinct+Cardiac+Stem+Cell+Populations+From+a+Single+Human+Heart+Biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Concurrent Isolation of 3 Distinct Cardiac Stem Cell Populations From a Single Human Heart Biopsy.</a> Circulation Research. 121, 113-124 (2017).</li>
<li>Vidyasekar, P., Shyamsunder, P., Santhakumar, R., Arun, R., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+protocol+for+the+isolation+and+culture+of+cardiomyocytes+and+progenitor+cells+from+neonatal+mouse+ventricles%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A simplified protocol for the isolation and culture of cardiomyocytes and progenitor cells from neonatal mouse ventricles.</a> European Journal of Cell Biology. 94, 444-452 (2015).</li>
<li>Dergilev, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cardiac+stem+cell+sheets+detached+by+Versene+solution+and+from+thermoresponsive+dishes+reveals+similar+properties+of+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparison of cardiac stem cell sheets detached by Versene solution and from thermoresponsive dishes reveals similar properties of constructs.</a> Tissue Cell. 49, 64-71 (2017).</li>
<li>Zaruba, M. M., Soonpaa, M., Reuter, S., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyogenic+potential+of+C-kit%28%2B%29-expressing+cells+derived+from+neonatal+and+adult+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cardiomyogenic potential of C-kit(+)-expressing cells derived from neonatal and adult mouse hearts.</a> Circulation. 121, 1992-2000 (1992).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+a+Sca-1%2B%2FCD31-+progenitor+cell+lineage+derived+from+mouse+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of a Sca-1+/CD31- progenitor cell lineage derived from mouse heart tissue.</a> BMC Biotechnology. 14, 75(2014).</li>
<li>Smits, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cardiomyocyte+progenitor+cells+differentiate+into+functional+mature+cardiomyocytes%3A+an+in+vitro+model+for+studying+human+cardiac+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology.</a> Nature Protocols. 4, 232-243 (2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Os passos críticos do presente protocolo de isolamento do CSC são como segue. 1) uma condição esterilizada deve ser mantida para extração de corações de ratos. Qualquer contaminação durante a extração do coração pode comprometer a qualidade do CSCs. 2) o sangue deve ser completamente removido antes de a picar o coração, que é feito por várias lavagens de todo o coração e o coração peças com solução HBSS. 3) os pedaços do coração devem ser completamente lysed em uma suspensão de célula única com solução de colagenase. 4) ...

Doença isquêmica do coração, incluindo infarto do miocárdio (MI), é das principais causas de morte em torno do mundo1. Terapia de células-tronco para regenerar o miocárdio morto continua a ser uma grande abordagem para melhorar a função cardíaca de um MI coração2,3,4,5. Diferentes tipos de células-tronco utilizaram para reabastecer o miocárdio morto e para melhorar a função cardíaca de um coração de MI. Eles podem ser amplamente classificados em células-tronco células-tronco embrionárias6 e adulto. Em células-tronco adultas, têm sido utilizados vários tipos de células-tronco, tais como células mononucleares de medula óssea-derivado7,8, células-tronco mesenquimais derivadas de medula óssea9,10, tecido adiposo 11,12e cordão umbilical13e CSCs14,15. Células-tronco podem promover regeneração cardíaca através do sistema endócrino e/ou parácrina ações16,17,18,19,20. No entanto, uma limitação importante da terapia de células-tronco está obtendo um número adequado de células-tronco que podem proliferar e/ou diferenciar-se em direção a uma linhagem cardíacas específicas21,22. Transplante autólogo e alogênico de células-tronco é um desafio importante na terapia de células-tronco9. CSCs poderiam ser uma melhor abordagem para regeneração cardíaca porque eles são derivados de coração e eles podem ser mais facilmente diferenciados em linhagens cardíacas do que as células-tronco não cardíaca. Assim, reduz o risco de teratoma. Além disso, os efeitos de glândula endócrina e parácrina da CSCs, tais como exosomes e miRNAs derivados os CSCs, poderiam ser mais eficazes do que outros tipos de células-tronco. Assim, CSCs continua a ser uma opção melhor para regeneração cardíaca23,24.
Embora CSCs são um candidato melhor para regeneração cardíaca em um coração MI devido a sua origem cardíaca, uma limitação principal com CSCs é menos rendimento devido à falta de um método eficiente de isolamento. Uma outra limitação pode ser a diferenciação prejudicada dos CSCs em direção cardiomyocytes lineage2,25,26,27. Para contornar essas limitações, é importante desenvolver um protocolo eficiente para CSC isolamento, caracterização e diferenciação no sentido de linhagem cardíaca. Não há nenhum marcador único aceitável para CSCs e um específico da pilha-superfície marcador de isolamento de CSCs produz menos CSCs. Aqui, podemos padronizar uma abordagem simples centrifugação gradiente para isolar CSCs partir o coração de rato que é cost-effective e resulta em um maior rendimento do CSCs. Estes CSCs isolados podem ser selecionados para marcadores de superfície celular específicos por fluorescência-ativado da pilha curto-circuito. Além do isolamento de CSCs, nós fornecemos um protocolo para CSC cultura, caracterização e diferenciação no sentido de linhagem de casos. Assim, apresentamos um método elegante para isolar, caracterizar, cultura e diferenciar CSCs de corações de rato adulto (Figura 5).

<table><tbody><tr><td>Camundongos</td><td>The Jackson laboratory, EUA</td><td>Estoque nº 000664</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OCT4-Abcam</td><td></td> <td>ab18976 (policlonal de coelho)</td><td>OCT4-Anticorpo primário- diluição 1:100, anticorpo secundário- diluição 1:200, em solução de bloqueio</td></tr><tr><td>SOX2</td><td>Abcam</td><td>ab97959 (policlonal de coelho)</td><td>SOX2-Anticorpo primário - diluição 1:100, anticorpo secundário - diluição 1:200, em solução de bloqueio</td></tr><tr><td>Nanog</td><td>Abcam</td><td>ab80892 (policlonal de coelho)</td><td>Anticorpo Nanog-primário - diluição 1:100, anticorpo secundário - diluição 1:200, em solução de bloqueio</td></tr><tr><td>Ki67</td><td>Abcam</td><td>ab16667 (policlonal de coelho)</td><td>Ki67-Anticorpo primário - diluição 1:100, anticorpo secundário - diluição 1:200, em solução de bloqueio</td></tr><tr><td>Sca I</td><td>Millipore</td><td>AB4336 (policlonal de coelho)</td><td>Sca I Anticorpo primário - diluição 1:100, anticorpo secundário - diluição 1:200, em solução de bloqueio</td></tr><tr><td>NKX2-5</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8697 (policlonal de cabra)</td><td>NKX2-5-Anticorpo primário - diluição 1:50, anticorpo secundário - diluição 1:200, em solução de bloqueio</td></tr><tr><td>GATA4</td><td>Abcam</td><td>ab84593 (policlonal de coelho)</td><td>GATA4-Anticorpo primário - diluição 1:100, anticorpo secundário - diluição 1:200, em solução de bloqueio</td></tr><tr><td>MEF2C</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-13268 (policlonal de cabra)</td><td>MEF2C-anticorpo primário - diluição 1:50, anticorpo secundário - diluição 1:200, em solução de bloqueio</td></tr><tr><td>Troponina I</td><td>Millipore</td><td>MAB1691 (monoclonal de camundongo)</td><td>Troponina I-anticorpo primário - diluição 1:100, anticorpo secundário - diluição 1:200, em solução</td></tr> <tr><td>de bloqueioActinina</td><td>Millipore</td><td>MAB1682 (monoclonal de camundongo)</td><td>Actinina-Anticorpo primário - diluição 1:100, anticorpo secundário - diluição 1:200, em solução de bloqueio</td></tr><tr><td>ANP</td><td>Millipore</td><td>AB5490 (policlonal de camundongo)</td><td>ANP-anticorpo primário - diluição 1:100, anticorpo secundário - diluição 1:200, em solução de bloqueio</td></tr><tr><td>Alex Fluor-488 checken anti-coelho</td><td>Tecnologia de vida</td><td>Ref no. A21441</td><td></td></tr><tr><td>Alex Fluor-594 cabra anti-coelho</td><td>Life technology</td><td>Ref nº A11012</td><td></td></tr><tr><td>Alex Fluor-594 coelho anti-cabra</td><td>Life technology</td><td>Ref nº A11078</td><td></td></tr><tr><td>Alex Fluor-488 checken anti-mouse</td><td>Life technology</td><td>Ref nº A21200</td><td></td></tr><tr><td>Alex Fluor-594 checken anti-cabra</td><td>Life technology</td><td>Ref nº A21468</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Meio de cultura: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CSC meio de manutenção</td><td>Millipore</td><td>SCM101</td><td>Nota: Para cultura CSC, PBS ou meio DMEM incompleto foi usado para lavar as células</td></tr><tr><td>cardiomiócitos meio de diferenciação</td><td>Millipore</td><td>SCM102</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5546</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo<</td><td>strong>Comentários</td></tr><tr><td>Cell Isolation buffer:solução de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>polissacarose e diatrizoato de sódio (Histopaque1077)</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>2018-03</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase I</td><td>Sigma</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>Solução de dispase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>LONZA</td><td>S1226</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de dissociação celular StemPro Accutase</td><td>Thermoscientific</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>Outros reagentes: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Normal checken serum</td><td>Vector laboratory</td><td>S3000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI solution</td><td>Applichem</td><td>A100,0010</td><td>Dapi, concentração de trabalho-1 &micro; g / mL</td></tr><tr><td>Trypan azul</td><td>Biorad</td><td>145-0013</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase Reagente de Dissociação Celular</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ACROS</td><td>Cas No. 900-293-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Sceintific</td><td>Lote nº 160170</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Materiais de cultura de tecidos:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm placa de Petri</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 poços</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de 24 poços</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balão T-25</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balão T-75</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de 15 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de 50 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; corante de células m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; corante de células m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro; Filtro m</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-719C</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 10 mL</td><td>BD</td><td>Ref no. 309604</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; L, 200 &micro; L, 1000 &micro; Ponteiras de pipeta L</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL, 10mL, 25 mL pipeta de plástico descartável</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Instrumentos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Máquina centrufugada</td><td>Thermo Scientific</td><td>LEGEND X1R centrífuga</td><td></td></tr><tr><td>EVOS microscópio Tecnologia</td><td>da vida</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contador de células automatizado</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de contagem de células</td><td>Biorad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>Auxiliar de pippte</td><td>Thermo Scientific</td><td>S1 pipeta filler</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Instrumentos cirúrgicos:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica</td><td>Ferramenta</td><td></td><td></td>científica</tr><tr><td>fina Tesoura cirúrgica fina</td><td>Ferramenta</td><td></td><td></td>científica fina</tr><tr><td>Pinça de haste curva</td><td>Ferramenta científica fina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâmina cirúrgica</td><td>Fine Scientific Tool</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco cardíacas do coração de rato adulto

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Infarto do miocárdio (MI) é das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Dos principais objetivos da medicina regenerativa é reabastecer o miocárdio morto depois de MI. Embora várias estratégias têm sido usadas para regenerar o miocárdio, terapia de células-tronco permanece uma grande abordagem para reabastecer o miocárdio morto de um coração de MI. Acumular evidências sugere a presença de células-tronco cardíacas (CSCs) residentes no coração adulto e seus efeitos endócrinas e/ou parácrina sobre regeneração cardíaca. No entanto, o isolamento do CSC e sua caracterização e diferenciação para células do miocárdio, especialmente cardiomyocytes, permanece um desafio técnico. No presente estudo, nós fornecemos um método simples para o isolamento, caracterização e diferenciação do CSCs do coração de rato adulto. Aqui, descrevemos um método de gradiente de densidade para a isolação do CSCs, onde o coração é digerido por uma solução II de colagenase de 0,2%. Para caracterizar os CSCs isolados, avaliamos a expressão de marcadores de CSCs/cardíaco Sca-1, NKX2-5 e GATA4 e marcadores de pluripotência/stemness OCT4, SOX2 e Nanog. Nós também determinou o potencial de proliferação de CSCs isolados cultivo-os em um prato de Petri e avaliando a expressão do marcador de proliferação Ki-67. Para avaliar o potencial de diferenciação de CSCs, selecionamos sete a dez dias cultivada CSCs. Estamos transferindo-os para uma nova placa com meio de diferenciação de casos. Eles são incubados em um incubador de cultura celular durante 12 dias, enquanto meio de diferenciação é trocado a cada três dias. Os CSCs diferenciados expressam marcadores de casos específicos: actinin e troponina eu. Assim, CSCs isolados com este protocolo tem stemness e marcadores cardíacos, e eles têm um potencial de proliferação e diferenciação em direção a linhagem de casos.

No presente estudo, isolamos CSCs de corações de ratos machos C57BL/6J 10 a 12 semanas de idade. Aqui, apresentamos um método simples para CSC isolamento e caracterização utilizando marcadores de pluripotência. Também apresentamos um método elegante para diferenciação do CSC e a caracterização dos CSCs diferenciadas em direção a linhagem cardiomyocytes. Observamos uma morfologia de forma do eixo do CSCs 2 - a 3-dias-cultivadas sob um microscópio de contraste de fase (...

O objetivo geral deste artigo é a padronização do protocolo para o isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco cardíacas (CSCs) do fundo do coração de rato adulto. Aqui, descrevemos um método de centrifugação gradiente de densidade para isolar murino CSCs e métodos elaborados para CSC cultura, proliferação e diferenciação em cardiomyocytes.

Isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco cardíacas do coração de rato adulto

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

O objetivo geral deste artigo é padronizar o protocolo para o isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco cardíacas, CSCs do Coração de Rato Adulto. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave, no campo das doenças cardiovasculares e terapia regional, como a terapia de células-tronco cardíacas e a insuficiência cardíaca. A principal vantagem dessa técnica é que ela é rentável, com alto auxílio em pequeno período de tempo.Inicie este experimento preparando todos os materiais, instrumentos e tampões de isolamento necessários em uma condição esterilizada, conforme descrito no protocolo. Depois de remover a pele do abdômen de um rato eutanizado, corte a caixa torácica dentro da coifa estéril para abrir a cavidade torácica. Exponha o coração e remova o sangue perto do coração usando uma seringa de um mililitro.Para remover qualquer sangue perto do coração, lave a área circundante com PBS gelado. Usando tesouras cirúrgicas e pinças para dissecar o coração, coloque-o em uma placa de Petri de 100 milímetros contendo 10 mililitros de PBS gelado. Use fórceps curvas para palpitar o coração e remover o sangue residual dentro do coração.Transfira de quatro a cinco corações isolados para uma placa petri de 100 mililitros contendo 10 mililitros de solução de sal balanceado do presunto gelado. Palpa os corações novamente para lavá-los e remover qualquer sangue residual dentro do coração. Para garantir a remoção completa do sangue, altere a solução HBSS após cada lavagem.Segure cada coração com um par de fórceps e use uma lâmina cirúrgica para cortar cada coração em pedaços de dois a quatro milímetros em uma placa de Petri de 100 milímetros, contendo cinco a sete mililitros de HBSS. Altere frequentemente a solução para garantir a remoção completa do sangue. Finalmente, pique os corações na solução HBSS.Centrifugar os corações picados colocados em um tubo cônico de 50 mililitros a 500 vezes G, a quatro graus Celsius por cinco minutos, e depois descartar o sobrenante. Adicione cinco a seis mililitros, 0,2% Solução de Colagenase II à pelota para digerir o tecido. Suspenda completamente a pelota balançando o tubo em um agitador a 75 vezes G, a 37 graus Celsius por 45 a 60 minutos.A cada 20 a 30 minutos, aperte o tubo vigorosamente à mão para melhorar a lise. Triturar a mistura de tecido lículo usando cinco mililitros pipeta sorológica, e uma ponta de pipeta de um mililitro para dissociar o nódulo tecidual na suspensão celular única. Para parar a lise enzimática do tecido, adicione duas a três vezes mais médio de manutenção CSC disponível comercialmente do que o volume do tecido líscido.Passe a suspensão celular digerida através de um coador de células de 100 micrômetros colocado em um tubo cônico de 50 mililitros para remover quaisquer pedaços de tecido não digeridos. Para separar as células à centrifugação gradiente de densidade, adicione 37 graus Celsius, pré-aquecido, polisucrose e solução de diatrizoato de sódio a um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, adicione suavemente e lentamente um volume igual de filtrado sobre a solução, evitando qualquer mistura das duas soluções.É fundamental adicionar filtrado sobre polisucrose e solução de diatrizoato de sódio lentamente sem misturar inclinando o tubo a 45 graus e contra a parede do tubo. Não adicione polisucrose e solução de diatrizoato de sódio sobre filtrado. Coloque o tubo muito lentamente em uma centrífuga de balde de balanço certificando-se de não perturbar as soluções.Centrifugar a 500 vezes G por 20 minutos em temperatura ambiente fixada em uma velocidade de aceleração e desaceleração mais baixa para evitar misturar as duas soluções, e para a separação adequada das células-tronco cardíacas. É fundamental colocar a solução gradiente com muito cuidado sem perturbação na centrífuga. Colocar a aceleração e desaceleração da centrífuga deve ser de menor velocidade, como um ou zero.Use uma pipeta de um milímetro para transferir o revestimento buffy contendo os CSCs, juntamente com uma solução extra da camada superior para um tubo esterilizado de 15 mililitros. Adicione um volume igual de meio de manutenção CSC e misture-o adequadamente para neutralizar a solução de polisucrose residual e diatrizoato de sódio. Centrifugar esta suspensão a 500 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius.Descarte o supernaspeso. Repita a lavagem de CSCs com solução DMEM incompleta pelo menos por duas vezes. Centrifugar a 500 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius para se livrar de qualquer solução residual de polisucrose e diatrizoato de sódio.Depois de remover o supernascimento, resuspenque a pelota contendo CSCs purificados em um meio de manutenção CSC mililitro e, em seguida, conte as células. Semente os CSCs em uma placa de cultura de seis poços revestida com uma solução de gelatina de 0,02% contendo 0,5% de fibronectina, e adicione dois mililitros de meio de manutenção completa. Cresça as células a 37 graus Celsius em 5% de CO2.Quando a cultura CSC atingir a confluência, transfira as células para uma nova placa revestida de gelatina e fibronectina, conforme descrito no protocolo de texto. Cultura estes transferiram CSCs P0 em meio completo de manutenção CSC a 37 graus Celsius em uma incubadora de CO2 de 5% até confluente. Repita a transferência de células para uma nova placa para fazer CSCs P1 que podem ser usados para outros experimentos.Para manter a cultura CSC em seu estágio inicial, semeou ainda mais as células conforme descrito no protocolo de texto. Para caracterizar as células cultivadas, coloque o CSC contendo placa no objetivo de um microscópio fluorescente. Use dez vezes a ampliação para concentrar as células.Para observar as células, use abertura de contraste de fase e aumente a ampliação para 20 vezes alterando a lente objetiva e, em seguida, imagem dos CSCs. Depois de realizar a imunostaining, coloque a placa de cultura sob o microscópio de fluorescência. Concentre as células em diferentes ampliações, e observe as células sob contraste de fase e diferentes filtros de excitação, e salve as imagens.Para diferenciação celular, cresça os CSCs em uma placa de seis poços com dois mililitros de 37 graus Celsius, meio de manutenção CSC pré-aquecido. Quando as células atingirem 80 a 95% de confluência, substitua o meio de manutenção por dois mililitros, 37 graus Celsius, meio de diferenciação de cardiomiócitos pré-aquecidos. Incubar a 37 graus Celsius, em um CO2 de 5% por até duas a três semanas.Mude o meio de diferenciação a cada dois ou três dias. Durante a mudança média, observe a morfologia celular sob um microscópio para garantir as boas condições de cultura. Após 12 dias, imagem as células para marcadores de diferenciação seguindo um protocolo padrão de imunossuagem.CSCs cultivados de dois a três dias mostram uma morfologia em forma de fuso quando observada sob um microscópio de contraste de fase. Após sete dias de cultura, eles mostram uma mudança na morfologia se alongando. Depois de imunosmunficar para marcadores de pluripotência, CSCs mostram expressões de OCT4, SOX2 e Nanog.Além disso, os CSCs proliferam em meio de cultura e expressam o marcador de proliferação Ki67. Para caracterizar a origem cardíaca dos CSCs, foram examinadas expressões de marcadores cardíacos, e as células mostraram positivo para marcadores cardíacos Sca-1, NKX2.5 e GATA4. Após a culminação em meio de diferenciação de cardiomiócitos por 12 dias, CSCs diferenciados mostram expressão dos marcadores cardiomiócitos ACTININ e TROPONIN-I.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de não permitir a mistura da solução gradiente e do filtrado. Também é importante definir a aceleração e desaceleração em menor velocidade. Quem os contamina, é recomendável realizar todo o processo de isolamento celular dentro de um armário de biossegurança.Após esse procedimento, outros métodos como a separação baseada em contas magnéticas ou métodos de classificação celular baseadas em citomóticos de fluxo podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como, quão clara é a população homogênea das células-tronco cardíacas? O raio de crack em uma célula-tronco cardíaca é grande marcador, e há diferenças em relação aos cardiomiócitos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abrirá caminho para os pesquisadores do campo de doenças cardiovasculares que muitas vezes têm alto rendimento de células-tronco cardíacas do coração do camundongo, o que pode ser importante para a terapia regenerativa na insuficiência cardíaca isquêmica.Não se esqueça que trabalhar com lâmina cirúrgica, alvejante e DMSO pode ser perigoso, e precauções como o uso de Equipamentos de Proteção pessoal, EPI, devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.

isolation-characterization-differentiation-cardiac-stem-cells-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui, descrevem o isolamento de cardiomyoctyes ratinho adulto usando um sistema de perfusão de Langendorff. As células resultantes são Ca2 +-tolerantes, electricamente quiescente e podem ser cultivadas e transfectadas com lentivírus para manipular a expressão de genes ou vírus adeno-. A sua funcionalidade, também pode ser analisada utilizando o sistema de MMSYS e técnicas de fixação de membranas.

Isolamento, cultura e caracterização funcional de rato adulto Cardiomyoctyes

Cardiomiócitos individuais de camundongos selvagens e mutantes podem ser isolados do coração para estudar sua contratilidade e transientes de cálcio. Isso permite caracterizar a contribuição da disfunção celular para a disfunção cardíaca por qualquer causa.

Isolamento e Fisiológica Análise de rato Cardiomyocytes

Nós descrevemos um método confiável para isolamento de cardiomiócitos adultos do mouse. Este protocolo produz um resultado consistente para a cultura de cardiomiócitos adultos funcionais a partir de uma variedade de camundongos geneticamente modificados.

Isolamento e Cultura de rato adulto Cardiomyocytes de sinalização celular e<em&gt; In vitro</em&gt; A hipertrofia cardíaca

Este protocolo descreve um método passo a passo para o isolamento reprodutível e cultura de longo prazo de cardiomiócitos de camundongos adultos com alto rendimento, pureza e viabilidade.

Isolamento, cultura e Transdução de rato adulto Cardiomyocytes

tecido cardíaco humano abriga populações de células precursoras perivasculares multipotentes que podem ser adequados para a regeneração do miocárdio. A técnica aqui descrita permite o isolamento e purificação simultânea de duas populações de células estromais multipotentes associados com os vasos nativos de sangue, ie CD146 + CD34 - pericitos e células CD34 + CD146 - células adventícias, a partir do miocárdio humano.

Isolamento de perivascular Multipotentes populações de células precursoras a partir de tecido cardíaco humano

Métodos são demonstradas para o isolamento de miócitos do nó sinoatrial (SAM) a partir de ratinhos adultos por patch-clamp electrofisiologia ou imagiologia estudos. As células isoladas podem ser utilizadas directamente ou podem ser mantidas em cultura que permita a expressão de proteínas de interesse, tais como repórteres geneticamente codificados.

Métodos para o isolamento, Cultura e caracterização funcional de SINOATRIAL Nó miócitos de ratos adultos

Este protocolo é usado para isolar cardiomiócitos atriais únicos do coração do rato adulto usando uma abordagem de digestão do pedaço. Esta aproximação é usada para isolar os miócitos atrial direito ou esquerdos que podem ser usados para caracterizar a electrofisiologia atrial do miócitos em estudos da remendo-braçadeira.

Isolamento de miócitos atriais de camundongos adultos

A obtenção de uma população pura de fibroblastos é crucial para estudar seu papel na reparação de feridas e fibrose. Descrito aqui é um método detalhado para isolar fibroblastos e miofibroblastos de corações de camundongos ilesos e feridos seguido susceptência de sua pureza e funcionalidade por imunofluorescência, RTPCR, triagem celular assistida por fluorescência, e contração de gel de colágeno.

Isolamento e Caracterização de Fibroblastos Cardíacos Adultos e Miofibroblastos

Um método é descrito para o isolamento simultâneo de miócitos e não miócitos tanto da atria quanto dos ventrículos de um único coração de rato adulto. Este protocolo resulta em rendimentos consistentes de miócitos cardíacos altamente viáveis e não miócitos e detalha condições ideais de cultura específica celular para fenotipagem e análise in vitro.

Isolamento simultâneo e cultura de miócitos atrial, miócitos ventriculares e não-miócitos de um coração de rato adulto

Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo a preparação de núcleos celulares. Após microdissecção e dissociação enzimática do tecido cardíaco em células únicas, as células progenitoras foram congeladas, seguidas pelo isolamento de células viáveis puras, que foram usadas para sequenciamento de RNA de núcleo único e o ensaio de núcleo único para cromatina acessível à transposase com análises de sequenciamento de alto rendimento.

Isolamento de Núcleos de Células Progenitoras Cardíacas de Camundongos para Perfil de Epigenoma e Expressão Gênica em Resolução Unicelular

Aprenda a isolar, caracterizar e diferenciar células-tronco cardíacas de coração de rato adulto usando centrifugação em gradiente de densidade. Este método padronizado oferece uma abordagem econômica para pesquisas em terapia cardíaca regenerativa.

Isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco cardíacas do coração de rato adulto

Explorar mais vídeos