Name: Hızlı Analiz ve Floresans Mikroskopi Görüntüler Exploration (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Öğrenin, PhenoRipper platformu kullanarak floresan mikroskopi görüntülerini hızlıca analiz etme ve fenotipik profilleri keşfetme yöntemini. Bu yaklaşım, yüksek verimli görüntüleme taramalarında karmaşık fenotipleri karşılaştırmayı kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Adam Coster ve yararlı geri bildirim ve tartışmalar için Altschuler ve Wu laboratuarları diğer tüm üyelerine teşekkür ediyorum. Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından desteklenen R01 GM085442 ve CA133253 (SJA), R01 GM081549 (LFW), CPRIT RP10900 (LFW) ve Welch Vakfı I-1619 (SJA) verir ve I-1644 (LFW).

1.. Numune Hazırlanması ve Görüntüleme <ol><li> Hücre kültürü <ol><li> Rutin kültürleri bölmek ve% 20-70 izdiham korumak. Deneyden önce bir gün, (Dulbecco Modified Eagle Medium Malzemelerin Tablo) DMEM içinde HeLa hücrelerinin büyümesi ve% 10 FBS (Fetal Sığır Serumu) ve 1 x penisilin / streptomisin ile takviye edilmiştir. </li><li> Deney gününde, split hücreleri kültür (yaklaşık% 50 kaynaşık), büyüyen. </li><li> Birkaç saniye tripsin / EDTA (Etilendiamintetraasetik asit), yaklaşık 2 ml maruz PBS (Fosfat Tamponlu Tuzlu Su) hücreleri yıkayın. Fazla tripsin / EDTA aspire ve ~ 3 dakika, oda sıcaklığında kaputu tripsin / EDTA ince film içinde kalmış hücreler tutun. </li><li> Mekanik kez şişeler sallamak ve serumu medya ile hücreleri ayırmak. Hücre sayımı ve medya 5000 s/50 ul&#39;ye seyreltilmiş ve hemen de otomatik bir sıvı kotarma robotu (sadece 30 kullanılarak 384 oyuklu cam alt plaka üzerine 50 ul / oyuk plakaPlakanın s) burada kullanılmaktadır. </li><li> Oyuklara 5 kenar etkileri en aza indirmek için, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Gece boyunca, 37 ° C /% 5 CO2 inkübatöründe RT kuluçkalandıktan sonra, plakalar bir yer. </li><li> Her ilaç, iki kopya halinde deneye tabi tutulur. Plaka daha önce ortamı içeren karşılık gelen oyuklara ilacın 25 ul ekle. </li><li> 24 saat sonrası ilaç tedavisi de PBS içinde% 4 paraformaldehid çözümü ile plaka düzeltmek. </li></ol></li><li> Boyanma Burada kullanılan spesifik birincil antikorlar, floresan-etiketli sekonder antikorları ve diğer floresan lekeleri Malzemelerin Tablo l&#39;de listelenmiştir. <ol><li> Permeabilize 3 dakika için TBS içinde% 0.2 Triton X-100 çözeltisi (Tris-tamponlu tuzlu su) ile hücreler sabitlenmiş ve TBST (Tris-tamponlu tuzlu su + Tween 20) 3x ile yıkayın. Bloke edilmesi için TBST içinde% 5 BSA (Bovin Serum Albumin) solüsyonu ekleyin. </li><li> 2 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin ve daha sonra 3x TBST ile yıkayın. </li><li> Primer antikor zaman dilüe olabilme olunTBST içinde% 5 BSA içinde iyonları (Malzemelerin Tablo bakınız) ve de 10 ul / ekleyin. 2 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin ve daha sonra 3 kez TBST ile yıkayın. </li><li> TBST ikincil antikor dilutionin% 5 BSA (Materyallerin bkz. Tablo) yapmak ve de 10 ul / ekleyin. </li><li> 2 saat boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edin ve daha sonra iki kez de TBST ile yıkayın. </li><li> PBS (Materyallerin bkz. Tablo) Hoechst ve Phalloidin için seyreltimler hazırlayın ve iyi 10 ul / ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca karanlıkta inkübe edin. </li><li> Sonra 2 TBST&#39;dir yıkar, 4 ° CO / N. folyo ve mağaza kapak plakaları </li></ol></li><li> Görüntüleme 1x1 kamera binning ile 20X objektif kullanılarak Epifloresans bir mikroskop kullanılarak görüntü kazanır. 480 görüntüler (x3 kanal) toplam, her bir kuyu için onaltı görüntü kazanır. </li></ol> 2. Görüntüler incelendiğinde Download ve phenoripper.org gelen PhenoRipper yüklemek ve IMA analiz başlamak için PhenoRipper başlatmakGes. PhenoRipper anda destekler TIFF, PNG, JPEG ve MATLAB tarafından desteklenen diğer tüm biçimler (mikroskop yazılımı tipik TIFF içine ihracatı desteklemek). 2.1 Yükleme Veri <ol><li> Hiçbir standart adlandırma / kuruluş kuralı yükleme görüntüleri ve ilişkilendirerek meta yapabilirsiniz mikroskopi görüntüleri için var (örneğin tedavi türü, yani deneysel açıklama, kuyu sayısı ve benzeri) iş akışının en zor kısmı. (Aşağıda açıklanmıştır) sunulan yöntemlerin birini seçin. <ol><li> PhenoLoader: istediğiniz gibi dosya adı ve / veya dizin yapısı (örneğin, B16 HeLa_Drug5-DAPI.png görüntü kuyudan B16 uzak olduğunu gösterebilir grup görüntüleri için yeterli bilgi olduğunda veri yüklemek yarı-otomatik olarak bu seçeneği seçin, hücreler tedavi edilir Bu adlandırma kuralı, iyi A1 veya ilaç 5 ile tedavi edilen tüm görüntüleri kolayca gruplandırılmış olabilir) - Kimin kimliği 5 ve görüntü nükleer DAPI leke yakalar ilaç ile. Sihirbaz olacakgörüntü grupları ile meta ilişkilendirmek ve aşağıdaki gibi işaretçileri tanımlamak için adım kullanıcı adım rehberlik: <ol><li> PhenoLoader penceresine ulaşmak için &quot;Dosya Yapısı&quot; üzerine tıklayın. </li><li> Görüntü veri kümesini içeren dizini seçmek için &quot;Define Kök Dizin&quot; üzerine tıklayın. Sonra analizi (opsiyonel, boş bırakılabilir) için kullanılmayan dosyaları (Kullanılmayan Dosya) filtre. </li><li> Deneyde kullanılan biyomarkırları belirtmek ve görüntüleri ile ilişkilendirmek için &quot;Define İşaretlerinin&quot; üzerine tıklayın. Özellikle, o benzersiz biomarkerlerin tanımlayan dosya adının bir kısmını seçmek bir görüntü dosyasına tıklayın. Son olarak, her biyomarkere için bir ad girin. </li><li> Her görüntü ile bilgileri ilişkilendirmek için &quot;Define Meta&quot; üzerine tıklayın. Özellikle, bir resim dosyası üzerine tıklatın ve sonra görüntü bilgilerini (kuyu adı örneğin &quot;B16&quot;) tanımlayan dosya adının bir kısmını seçin. Bir pencere, bir grup adı (örneğin, &quot;soran Bizll &quot;) bir ad girin, açılır. dosya çıkarılan grubunun üyeleri), örneğin iyi isimleri tam listesi (grup tabloda gösterilir. dosya mevcut değil ek bilgi eklemek için tıklayın&quot; (isteğe bağlı) Sonraki &quot;, ek grup adı (örneğin enter&quot; Meta Grup Ekle &quot;düğmesine tıklayın. tıklayın&quot; İlaç &quot;) ve önceden tanımlanmış grubun her değer için (örneğin&quot; Şey &quot;), onun değerini girin (örneğin&quot; Taxol &quot;) . eklenebilir ek grupların sayısında bir sınır yoktur. </li><li> Son olarak, meta veri dosyası oluşturmak ve analiz devam etmek için &quot;Create Metadatafile&quot; üzerine tıklayın. Bir meta veri dosyası daha önce oluşturulan olmuşsa, yukarıdaki adımları doğrudan seçeneği (aşağıda 3 tarif) &quot;detayları Dosya&quot; kullanarak dosya yükleme ile önlenebilir. </li></ol></li><li> Düzenli İfade Tabanlı Templates: Düzenli ifadeler desen eşleştirme için standart bir yaklaşım vardırmetin. Dosya adı ve / veya dizin yapısı grup görüntüleri için yeterli bilgi ve adlandırma kuralı önceden varolan şablonlardan birini maçları bu seçeneği seçin. Düzenli ifadeler dayalı özel şablonlar elle de tanımlanabilir ve tekrar edilebilir. Bu gelişmiş seçenek sadece düzenli ifadelerle aşina kullanıcılar için önerilir. </li><li> Dosya: nihai Customizability için bu seçeneği seçin. Tanımlayın ve bir virgülle ayrılmış değerler her bir görüntü ile ilişkili dosya isimleri ve meta verileri içeren (CSV) dosyası yükleyin. Dosya biçimi bir örnek web sitesinde (phenoripper.org) bir yükleme kısmında mevcuttur. Basitçe içerdiği bilgileri görüntülemek için arayüz üzerinden dosya yüklenemedi. </li></ol></li><li> Gereksiz örnekleme önlemek için deneyde çoğaltır tanımlayan meta alanını seçin. Göstrm olabilir (iyi örneğin) onları bir araya gruplama, çoğaltır (bir kuyuda örneğin tüm görüntüleri aynı olmalıdır) içeren veri setleri içinove performans. Çoğu durumda bu rastgele bir alt kümesini seçer varsayılan seçenek &quot;Random (bilmiyorum)&quot; seçmek için makul. </li></ol> 2.2 Analiz Parametreleri Ayarlama Veri kümesini işlemek için gereken parametreleri tanımlamak için &quot;Set Parametreleri&quot; üzerine tıklayın. Tanımlamak için parametreler sol panelde bulunmaktadır. Sağ panel veri kümesi birleştirilmiş bir örneğini görüntüler. Farklı görüntüler arasında geçiş yapmak için sağ / sol oklara tıklayın. <ol><li> Eşik Yoğunluk: kabaca görüntülerin hücre kısımlarını (yerine arka plan, hücresel-olmayan bölgeleri) tanımlamak için uygun bir eşik değer seçin. Bir eşik PhenoRipper tarafından önceden hesaplanmış, ancak görüntünün üstünde mevcut scrollbar kullanarak hücresel bölgelerin vurgulamasını geliştirmek için ayarlanabilir. Seçilmiş bir eşik Tüm görüntüler üzerinde işe yaramazsa, hücresel olmayan bölgeleri yerine hücresel bölgeleri bırakarak içerecek şekilde eşiğini düşürmek. </li><li> Blok Size: ızgaraya görüntüyü (piksel) uygun bir blok boyutu seçin. Belirtilen boyutta bloklar görüntü üzerine bindirilmiş olacaktır. 20-30 Taşları / hücrenin bir ortalama elde etmek için blok boyutunu ayarlayın. &quot;Block Size&quot; alanına önündeki onay kutusunu görüntü tıklama üzerinden ızgara bindirmek için. </li><li> Opsiyonel Parametreler: auto-ölçekli görüntüleri istenilen göreli yoğunlukları ile işaretçileri (örn. tek renk doymuş) görüntülemek veya belirteçleri analiz düştü gerekiyorsa, &quot;Kanal ve yoğunluğunu ayarlayın&quot; seçeneğini kullanın yoksa. Belirteçlerin bir alt hücresel bölgelerini belirlemek için seçenek &quot;Eşik için kullanılan Kanallar&quot; kullanın. Diğer parametrelerin varsayılan seçenek genellikle yeterli olmaktadır, ancak gerekirse, &quot;İleri Analiz Seçenekleri&quot; kullanarak ayarlayın. </li><li> Ana uygulama panelde &quot;PhenoRip&quot; tuşuna basarak analizi çalıştırın. PhenoRipper otomatik olarak görüntüler tekrarlayan blok tiplerini belirlemek olacaktır. Fenotipik profilleri için üretilecektiriçinde farklı blok tipleri fraksiyonların göre her görüntüsü. </li></ol> 3. Keşfetmek Sonuçlar <ol><li> PhenoBrowser (Şekil 1) kullanılarak görüntülerin fenotipik profilleri arasındaki ilişkiyi araştırmak. PhenoBrowser arayüzü dört panel oluşur: Sol üst paneli farklı görüntüler / şartlar arasındaki göreceli benzerlik grafik bir temsilidir (dağılım arsa), seçildikleri koşulların sağ ekran örnek görüntüler ve son panelinde (çubuk grafik üzerindeki iki panel ) fenotipik profillerini karşılaştırır. </li><li> &quot;Bilgi İşlem&quot; menüsünü kullanarak &quot;Boş Çerçeveler atın&quot;. </li><li> Kalitesiz görüntüleri kaldırmak: Birincisi, bireysel görüntüler &quot;Veri İşleme&quot; menüsünden gruplama kapatmak çalışma. Sonraki, dağılım arsa Aykırı noktaları aracılığıyla tıklayın ve (örneğin, odak dışında, boyama paraziti) düşük kaliteli görüntüler atın. </li><li> Verileri keşfedin: alan tanımlar meta karar verinkarşılaştırma temel bir birim (örneğin uyuşturucu karşılaştırmak için, meta alanın aynı değeri &quot;uyuşturucu&quot; ile görüntüler gruplanmış gerekir). &quot;Grup By&quot; ile tek bir veri noktası içine bu meta alanın aynı değeri ile tüm görüntüleri kapa. Örneğin, bir ilaç ile bir ilaç gruplama her bir nokta elde etmek için her bir ilacın içindeki görüntüleri ortalamasını alır. Dağılım arsa yakın (veya uzak) puan benzer (ya da farklı) hücresel fenotipleri ortaya koşullarını yansıtır. Yorumlanabilirliğini yardımcı olmak için mevcut meta dayalı renkli veya etiket noktaları (veri görüntüleme menüsü). 3D arsa &quot;döner&quot; onay kutusunu ve sol butonuna tıklayarak ve üzerinde fareyi sürükleyerek tıklayarak döndürülebilir. </li><li> Onları doğrudan karşılaştırmak için iki farklı sayı seçin. Görüntü panelleri her bir nokta için örnek görüntüleri olacak ve çubuk grafik paneli olan olay frekansları iki nokta arasındaki en farklı blok tipleri gösterecektir. </li><li> C başlatınblok tipleri ve deneysel koşulları arasındaki ilişkinin daha küresel bir görünüm sağlamak için &quot;Clustergram menüden&quot; lustergram. Blok tipleri ve koşulları hem gruplandırarak, bu temsili en iyi koşullarda grupları (Şekil 5) ayırt hücresel fenotipleri vurgulamaktadır. </li></ol>

<ol><li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+for+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">ImageJ for microscopy.</a> Biotechniques. 43, 25-30 (2007).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, (2006).</li>
<li>Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., Goldberg, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+Recognition+Software+and+Techniques+for+Biological+Image+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pattern Recognition Software and Techniques for Biological Image Analysis.</a> PLoS Comput. Biol. 6, (2010).</li>
<li>Rajaram, S., Pavie, B., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PhenoRipper%3A+software+for+rapidly+profiling+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">PhenoRipper: software for rapidly profiling microscopy images.</a> Nat. Methods. 9, 635-637 (2012).</li>
<li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).</li>
<li>Slack, M. D., Martinez, E. D., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+heterogeneous+cellular+responses+to+perturbations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Characterizing heterogeneous cellular responses to perturbations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19306-19311 (2008).</li>
<li>Wolf, D. E., Samarasekera, C., Swedlow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+digital+microscope+images%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of digital microscope images.</a> Methods Cell. Biol. 81, 365-396 (2007).</li>
<li>Zwier, J. M., Van Rooij, G. J., Hofstraat, J. W., Brakenhoff, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+calibration+in+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Image calibration in fluorescence microscopy.</a> J Microsc. 216, 15-24 (2004).</li>
<li>Shamir, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wndchrm+-+an+open+source+utility+for+biological+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Source+Code+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Wndchrm - an open source utility for biological image analysis.</a> Source Code Biol. Med. 3, 13(2008).</li>
<li>Hamilton, N. A., Wang, J. T., Kerr, M. C., Teasdale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+and+visual+differentiation+of+subcellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Statistical and visual differentiation of subcellular imaging.</a> BMC Bioinform. 10, 94(2009).</li>
<li>Huang, K., Murphy, R. F. Automated classification of subcellular patterns in multicell images without segmentation into single cells. IEEE Int. Symp. Biomed. Imag. Macro Nano, 2004 Apr 15-18, 2, 1139-1142 (2004).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada anlatılan iş akışı, hızlı ve kolay karakterizasyonu ve mikroskopi görüntülerin karşılaştırılmasını sağlar. Biz öncelikle bu iş akışı hızlı mikroskopi görüntüleri kalite kontrolü gerçekleştirerek, örneğin deney optimizasyon, nasıl yardımcı olabileceğini gösterdi. Sonra, yüksek verimli tarama verilerini analiz etmek için kendi potansiyelini gösterdi: Biz etki mekanizmasına dayalı grup ilaçlarla başardık. Ilaçların grup PhenoRipper daha hızlı olan büyüklüklerdir olduğu halde, daha karmaşık bir yöntem 6 ku...

Geçtiğimiz on yıl içinde, görüntüleme teknolojisindeki hızlı gelişmeler birçok laboratuarlara yüksek verimli mikroskobu gerçekleştirme yeteneğini verdik. Şimdi sorun analizi birine görüntüleme birinden kaymıştır. Nasıl karşılaştırmak, karakterize, ve tipik bir yüksek verimli görüntüleme ekranında tarafından üretilen karmaşık henüz ince fenotipleri sel keşfedebilirsiniz? Görüntü analizi ve bilişim platformları bir dizi büyük koleksiyon görüntüleri biyolojik bilgi ayıklamak için kullanıcılar gelişmiş avadanlıklarını 1-3 verdik. Ancak birçok önemli engel yüksek verimli görüntü-tabanlı ekranlar verileri analiz kalır. (Faiz sistemi) görüntüler ve algoritmik parametrelerin ince ayar uygun karakterizasyonlarını seçimi ile ilgili zorluklar sık ​​sık özellikle görüntü analiz uzmanlığı olmayan kullanıcılar için uzun kurulum süreleri, neden. Özellikle, hücre bölümleme, bir tek tek hücrelerin belirlenmesi sürecin görüntü, bu konuda önemli bir darboğaz olduğunu. Segmentasyon, hücre tipi, hücre yoğunluğu ve biyo-belirteçler gibi deneysel parametreler son derece duyarlı olması ve sık sık büyük bir veri kümesi için tekrarlanan ayar gerektirir. Bu nedenlerden dolayı, görüntü analizi genellikle oldukça deney akışı ayrılmaz bir parçası daha uzmanlarca yapılan bağımsız terminal adımdır. Bu analiz ve deney, tahlil kalkınmanın önemli bir parçası arasındaki hızlı geri besleme döngüsünü engellemektedir. Burada yüksek verimli floresan mikroskobu için optimize edilmiş ve yukarıda bahsedilen zorluklarını bertaraf eder alternatif bir iş akışını açıklar. Bu amaçla, biz PhenoRipper 4, hızlı arama ve mikroskopi görüntülerin analizi için bir açık kaynak yazılım platformu faydalanmak. Anlamlı, PhenoRipper tek hücreleri tanımlamak için çalışan değil, hücre segmentasyon ile ilgili birçok zorlukla önler. Bunun yerine, PhenoRipper piksel içine görüntüleri bölerhücre içi büyüklükte bloklar ve içerdikleri bloklar cinsinden görüntüleri karakterize etmektedir. Özellikle, PhenoRipper işaretleyici-ko-tabanlı özellikleri açısından blokları profilleri ve otomatik eğitim görüntülerde en iyi temsil eden blok tipleri 4. tanımlar. PhenoRipper sonra her bloğun en benzer temsilcisi blok türü atar, ve nihayet içerdikleri blokların türlerine dayalı görüntüleri karakterize. Daha geleneksel tek-hücreli-temelli yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında, bu yaklaşım, minimal ince ayar ve uzmanlık gerektirir. Blok boyutu ve grafik geribildirim ile ayarlanır ikisi de bir eşik yoğunluğu (görüntü hücresel olmayan kısımlarını atmak için), gibi:, kullanıcıların yalnızca iki parametrelerini ayarlamak gerekir. Önemlisi, burada anlatılan iş akışı hız ve minimal ince ayar geniş zaman ve güvenilirlik artışı sağlar, çok büyük veri setleri, kolayca ölçek 4 gösterilmiştir. Uygulamada, biz bulmak Bu uygulamayıroach gerek büyüklük 4 çoklu emir tarafından kurulum ve çalıştırma için gerekli süreyi azaltır. PhenoRipper birincil çıkış hücreleri benzer fonetipler görüntülemek için neden deneysel koşullar gruplarını belirlemek için kullanıcı sağlayan, görüntü benzerlik görsel bir sunumudur. Tipik bulur PhenoRipper gruplaşmalar daha zaman alıcı, hücre tabanlı yöntemler 4 tarafından oluşturulan kıyaslanabilir &quot;biyolojik yorumlanabilirliğini&quot; var. Uygulamada, bu genellikle, tipik bir 96-sıra floresan mikroskopi deneyi gerçekleştirmek yarım saat içinde, önce görüntü analiz deneyimi olmayan bir deneyci kendi deney performansı hakkında güvenilir bir okuma almak anlamına gelir. Deneyci daha sonra farklı deneysel koşullar arasındaki ilişkileri keşfetmek ve görüntü fenotiplere bu ilişkileri ile ilgili başlayabilirsiniz. Biz etkilerini analiz ederek burada bu iş akışını göstermekDNA ve sitoskeletal belirteçler için boyanmış HeLa hücreleri üzerinde ayrı mekanik sınıflarında ilaçların. Ilaçların aynı sınıf ile tedavi hücreleri görüntüleri gruplanmış, ve (böylece odak hücreleri ve dışarı boyama eserler) kalitesiz görüntüler belirlemek ve potansiyel atmak için onları kolay hale aykırı olarak ortaya çıktı. Bu iş akışı görüntü tabanlı deneylerde çok sayıda için yararlı olsa da, farklı bir yaklaşım potansiyel olarak daha bilgilendirici olabilir açıkça birçok durum vardır. Örneğin, PhenoRipper gelen çıkış temel deneysel koşullar arasında floresan desen göreli bir karşılaştırılmasıdır. Belirli bir özelliği, tek bir hücre mutlak karakterizasyonu (a hücrede beneklerin örneğin sayısı) gerekli ise, tek hücre esaslı analiz gerekli olacaktır. Bununla birlikte, hatta bu tür durumlar içinde, PhenoRipper bu tek hücre fenotipleri değişiklikleri algılamak olasıdır ve bu nedenle tahlil opti için yararlı bir araç olabilirmizasyon.

<table><tbody><tr><td>DMEM, Yüksek Glikoz</td><td>İnvitrojen</td><td>11965</td><td>Yüksek Glikoz, L-Glutamin</td></tr><tr><td>Marker Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td>DNA boyası, seyreltme 1: 2.000 5 mg / ml stok</td></tr><tr><td>Marker phalloidin-Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td>Konjuge fallotoksin, seyreltme 1:200</td></tr><tr><td>Primer Antikor &alpha;-tubulin</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>Primer Ab, fare monoklonal, seyreltme 1:200</td></tr><tr><td>İkincil Antivody anti-Fare TRITC</td><td>Jackson</td><td>115-025-166</td><td>Konjuge ikincil Ab, 1 ml PBS'de 0.5 mg + 1 ml gliserol</td></tr><tr><td>Kullanılan Aldosteron</td><td></td><td></td><td>konsantrasyonu: 0.2 & mu; Kullanılan M</td></tr><tr><td>Apicidin</td><td></td><td></td><td>konsantrasyonu: 20 &mu; Kullanılan M</td></tr><tr><td>Kolşisin</td><td></td><td></td><td>konsantrasyonu: 0.16 &mu; Kullanılan M</td></tr><tr><td>Kortizol</td><td></td><td></td><td>konsantrasyonu: 0.2 &mu; Kullanılan</td></tr><tr><td>M Deksametazon</td><td></td><td></td><td>konsantrasyonu: 0.2 & mu; Kullanılan</td></tr><tr><td>M Dosetaksel</td><td></td><td></td><td>konsantrasyonu: 0.2 & mu; Kullanılan M</td></tr><tr><td>M344</td><td></td><td></td><td>konsantrasyonu: 20 &mu; Kullanılan M</td></tr><tr><td>MS-275</td><td></td><td></td><td>konsantrasyonu: 5 &mu; Kullanılan</td></tr><tr><td>M Nokodazol</td><td></td><td></td><td>konsantrasyonu: 0.3 & mu; Kullanılan</td></tr><tr><td>M Prednizolon</td><td></td><td></td><td>konsantrasyonu: 0.2 & mu; Kullanılan M</td></tr><tr><td>RU486</td><td></td><td></td><td>konsantrasyonu: 0.2 &mu; Kullanılan</td></tr><tr><td>M Scriptaid</td><td></td><td></td><td>konsantrasyonu: 70 &mu; </td></tr><tr>Kullanılan<td>M Taxol</td><td></td><td></td><td>konsantrasyonu: 0.3 &mu; Kullanılan M</td></tr><tr><td>Trichostatin A</td><td></td><td></td><td>konsantrasyonu: 0.2 & mu; Kullanılan</td></tr><tr><td>M Vinorelbin</td><td></td><td></td><td>konsantrasyonu: 0.3 & mu; M</td></tr></tbody></table>

hızlı analiz ve floresans mikroskopi görüntüler exploration

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Yüksek verimli mikroskopi hızlı gelişmelere rağmen, kantitatif görüntü-tabanlı deneyler hala önemli sorunlar oluşturmaktadır. Özel görüntü analiz çeşitli araçlar mevcut olmakla birlikte, en geleneksel görüntü analizi tabanlı iş akışları (analiz parametreleri ince ayar için) dik bir öğrenme eğrileri ve görüntüleme ve analiz arasında uzun sürelerde sonuçlanır. Özellikle, hücre bölümleme, bir görüntüde tek hücrelerin belirlenmesi işlemi, bu konuda önemli bir darboğazdır. Burada PhenoRipper, hızlı analiz ve mikroskopi görüntüleri keşif için tasarlanmış bir açık kaynak yazılım platformu dayalı bir alternatif, hücre-segmentasyon serbest iş akışı mevcut. Burada sunulan boru hattı hücre kültürlerinin immünofluoresans mikroskopi görüntüler için optimize edilmiş ve en az kullanıcı müdahalesi gerektirir. Yarım saat içinde, PhenoRipper tipik bir 96-kuyu deney verileri analiz ve görüntü profillerini oluşturabilir. Kullanıcılardaha sonra görsel, kendi veri keşfetmek onların deney kalite kontrolünü gerçekleştirmek, tedirginlikler tepki sağlamak ve suretin tekrarlanabilirlik kontrol edin. Bu analiz ve tahlil optimizasyonu sırasında önemlidir deney arasında hızlı bir geri besleme döngüsü kolaylaştırır. Bu protokol, sadece kalite kontrol için bir birinci geçiş analiz olarak yararlıdır, ama aynı zamanda bir uç uca bir çözüm olarak kullanılabilir, özellikle de taranması için kullanılabilir. Burada tarif edilen bu tür bir iş akışı, yüksek verimli taramalara tarafından üretilenler gibi büyük veri setleri için ölçekler, ve doğru bir biyolojik sistemlerin geniş bir aralık içinde bir fenotip ile grup, deney şartlarının gösterilmiştir. PhenoBrowser arayüzü fenotipik alanı keşfetmek ve biyolojik açıklamalar görüntü özelliklerini ilgili sezgisel bir çerçeve sağlar. Birlikte ele alındığında, burada açıklanan protokol görüntü tabanlı ekranların kantitatif analiz benimsenmesi için engelleri düşürecektir.

Burada etki mekanizmasına göre grubu ilaçlara bu iş akışının kabiliyetini test etmiştir. HeLa hücreleri, 384 oyuklu plakanın 30 kuyu tohumlanmış ve DNA / aktin / α-tubulin için boyandı. Kullanılan spesifik birincil antikorlar, floresan-etiketli sekonder antikorları ve diğer floresan lekeleri Malzemelerin Tablo l&#39;de listelenmiştir. Wells üç mekanik sınıflarına (histon deasetilaz önleyici, mikrotübül ve hedef DNA hasar verici) 24 saat için ve 20X objektif büyütme Epifloresans mikroskop kullanılarak ait 15 ilaçlar ile ...

Burada hızla PhenoRipper, son zamanlarda geliştirilmiş görüntü analiz platformu kullanarak floresan mikroskopi görüntülerin koleksiyonları analiz ve keşfetmek için bir iş akışını açıklar.

Hızlı Analiz ve Floresans Mikroskopi Görüntüler Exploration

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Bu prosedürün genel amacı, floresan mikroskopi görüntülerini hızla analiz etmek ve incelemek için bir görüntü analiz platformu kullanmaktır. Bu işlem; öncelikle hücrelerin bir plakaya ekilmesi, her kuyucuğa perturbasyonlar uygulanması ve plağın inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, otomatik bir floresan mikroskop kullanılarak görüntüler elde edilir ve bu görüntüler, pheno loader aracı kullanılarak yarı otomatik bir şekilde pheno ripper görüntü analiz platformuna yüklenir.Analiz parametreleri ayarlandıktan sonra pheno ripper, görüntülerdeki tekrarlayan blok türlerini otomatik olarak tanımlar ve pheno browser kullanılarak incelenebilen her görüntü için fenotipik profiller oluşturur. Nihayetinde, final kümeleme şeması (cluster gram), farklı koşullar ve görüntü özellikleri arasındaki ilişkileri göstererek yüksek kapasiteli görüntüleme taraması tarafından oluşturulan karmaşık ancak belirgin olmayan fenotiplerin karşılaştırılmasına olanak tanır. Bu tekniğin, tek tek hücrelerin otomatik tanımlanmasını gerektiren mevcut yöntemlere göre temel avantajı, çok daha hızlı ve kullanımının daha kolay olmasıdır.Bu yöntem, farklı ilaçların hücresel süreçleri nasıl etkilediği gibi biyomedika

rapid-analysis-and-exploration-of-fluorescence-microscopy-images

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz tek hücrelerin üç boyutlu konfokal floresans alınan tanımsız bir şekil morfolojisi değişiklikleri ölçmek için Imaris Nörobilim, ImarisXT ve MATLAB kullanan bir yazılım platformu geliştirdi. Bu yeni yaklaşım, reseptör aktivasyonunu takiben hücre şekli değişiklikleri ölçmek için kullanılır ve bu nedenle ilaç keşfi için olası ek bir araç temsil edilebilir.

Üç boyutlu Floresans Images Hücresel Morfoloji Değişiklikleri rakamlarla Analitik Aracı

Otofaji hücreler protein ve organellerin aşağılamak ve geri dönüşüm sağlayan her yerde bulunan bir süreçtir. Biz görselleştirmek ve küçük ölçmek için gelişmiş floresan mikroskop geçerli, ama autolysosomes içine oluşumu ve autophagosomes ve lizozomlar dağılımı, ve füzyon da dahil olmak üzere otofaji indüksiyon ile ilgili temel, fiziksel değişiklikler,.

Gelişmiş 3D Floresan Mikroskobu kullanılarak Otofaji Kantitatif Analiz

Biz floresan büyüyen maya hücreleri mikroskop film ve tek hücreli zaman serisi veri ayıklamak için bir GUI tabanlı yazılım paketi elde etmek için basit protokol mevcut. Analizi otomatik soy ve görsel denetim ve izlenen verileri manuel küratörlüğü ile entegre bölümü zaman atama içerir.

Tomurcuklanma Maya Floresan Time-lapse Filmler Kazanılması ve GREFTLERİ kullanarak Tek hücreli Dynamics analiz

Floresan işaretli hücrelerin çoğaltılmış görüntü tabanlı analiz sağlayan esnek bir bilişim iş akışı sundu. iş akışı nükleer ve sitoplazmik belirteçleri rakamlarla ve bu bölmeleri arasındaki işaretleyici translokasyonu hesaplar. Prosedürler 96 oyuklu formatta indirek immunofloresan ile işaret tespiti için siRNA ve güvenilir bir yöntem kullanarak hücrelerin pertürbasyon verilmiştir.

Yüksek içerik, Open Source Software tarafından desteklenen Evrensel Mikroskop Verilerden Floresan Göstergeler, Bireysel Hücre Niceleme için iş akışı

Veziküler kaçakçılık olaylarının doğru bir şekilde ölçülmesi, genellikle belirli proteinlerin rolleri ve mutasyonların etkileri hakkında önemli bilgiler sağlar. Bu makale, kantitatif floresan mikroskobu ve akış sitometrisi kullanılarak canlı hücrelerde endositik olayların nicelleştirilmesi için bir araç olarak pH'a duyarlı bir GFP varyantı olan süperekliptik pHluorin'i kullanma yöntemlerini sunmaktadır.

Budding Maya endositozun kantitatif, kinetik ve Yüksek verim Analizi pHluorin Uygulamaları

Biz Förster rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı readouts kullanarak protein etkileşimleri tahlil için otomatik floresans ömrü görüntüleme (Flim) kullanan açık kaynak kodlu bir yüksek içerik analizi (HCA) aleti sunuyoruz. Bu openFLIM-HCA cihaz için veri toplama yazılımı μManager yazılır ve veri analizi FLIMfit üstlenilmiştir tarafından kontrol edilir.

Otomatik Flüoresans Ömrü Görüntüleme Mikroskopi kullanmak Open Source Yüksek İçerik Analizi

Burada bir widefield yüksek-içerik analizi sistemi (WHCAS) kullanarak slaytlarda fluorescently etiketli dokuların otomatik bölümleme için bir protokol açıklayın. Bu iletişim kuralının Nefelometri biyolojik bilimler, tıbbi mühendislik ve Sağlık Bilimleri de dahil olmak üzere biyolojik dokularda floresan işaretleri içeren herhangi bir alanda geniş kapsamlı uygulamalar vardır.

Otomatik slayt tarama ve segmentasyon Fluorescently etiketli dokularda Widefield yüksek-içeriği analiz sistemi kullanılarak

Spektral görüntüleme, birden fazla floresan sinyalin tek bir örnekte tanımlanması ve ayrılması için güvenilir bir çözüm haline gelmiştir ve ilgi sinyallerini arka plandan veya otofloresanstan kolayca ayırt edebilir. Uyarma-tarama hiperspektral görüntüleme aynı anda sinyal-gürültü oranını artırırken gerekli görüntü edinme süresini azaltarak bu tekniği geliştirir.

Floresan Sinyallerini Etkin Bir Şekilde Ayırt Etmek Için Uyarma-Tarama hiperspektral görüntüleme mikroskobu

Floresan mikroskopi görüntülerinde belirli hücre bölmelerinde hücresel cisimlerin hızlı araştırılması ve doğru analizi için oluşturulmuş serbestçe kullanılabilir bir iş akışı salıyoruz. Bu kullanıcı dostu iş akışı açık kaynak yazılım Icy üzerinde tasarlanmıştır ve aynı zamanda ImageJ işlevleri kullanır. Boru hattı görüntü analizi nde bilgi olmadan uygun fiyatlı.

Alt Yapı Analizörü: Floresan Mikroskopi Görüntülerinde HücreCisimlerinin Hızlı Araştırılması ve Doğru Analizi için Kullanıcı Dostu İş Akışı

Burada, üç boyutlu bir alanda dağıtılan her canlı hücreden doğuştan gelen hücresel floresan imzalarının (yani hücresel otofluoresans) optik olarak çıkarılması ve kataloglanması için bir protokol sunulmaktadır. Bu yöntem, bakteri, mantar, maya, bitki ve hayvanlardan gelen hücreler de dahil olmak üzere çeşitli biyolojik sistemlerin doğuştan gelen floresan imzasını tek hücreli çözünürlükte incelemek için uygundur.

Tek Hücreli Doğuştan Gelen Floresan İmzalarının Konfokal Mikroskopi ile Yeniden Yapılandırılması

Bakterilerde plazmit retansiyonunun paralelleştirilmiş analizi için erişilebilir, açık kaynaklı bir mikroakışkan iş akışı sunulmaktadır. Jel mikro damlacıklar içindeki tek hücreli mikrokolonilerde plazmit varlığını ölçmek için floresan mikroskobu kullanan bu yöntem, geleneksel plaka sayımına kesin, erişilebilir ve ölçeklenebilir bir alternatif sunar.

Açık Kaynak Damlacık Mikroakışkanları ile Plazmid Stabilite Analizi

Öğrenin, PhenoRipper platformu kullanarak floresan mikroskopi görüntülerini hızlıca analiz etme ve fenotipik profilleri keşfetme yöntemini. Bu yaklaşım, yüksek verimli görüntüleme taramalarında karmaşık fenotipleri karşılaştırmayı kolaylaştırır.

Hızlı Analiz ve Floresans Mikroskopi Görüntüler Exploration

Daha fazla video keşfet