DNBS / TNBS Colite Modelos: elucidando sua Doença Inflamatória Intestinal e Efeitos de gordura na dieta

O objetivo geral deste procedimento é oferecer um método alternativo e de baixo custo para estudar a doença inflamatória intestinal ou DII utilizando ácido dinitrobenzeno sulfônico ou DNBS. Isso é realizado primeiramente por meio da administração intra-retal de DNBS mediante inserção suave no ânus. Na segunda etapa, são obtidas secções de tecido do intestino grosso para triagem histológica e avaliação da atividade da mieloperoxidase nos tecidos desafiados com DNBS; por fim, os efeitos de óleos dietéticos sobre perda de peso e colite podem ser avaliados por métodos macroscópicos e microscópicos.

A principal vantagem deste método em relação ao método existente de sulfato de dextrana sódica é que o método DNBS é fácil de realizar, menos oneroso e altamente reprodutível. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de pesquisa da DII, como quais são os papéis do estresse e da depressão na recorrência da DII, ou quais são os mecanismos subjacentes à lesão e reparação intestinais. Para a instilação retal de DNBS em camundongos, comece acoplando uma seringa de um mililitro a uma agulha de calibre 19. Equipada com um cateter de polietileno 50, aspire então o DNBS recém-preparado para dentro do cateter.

Em seguida, aplique gel lacrimal em um camundongo anestesiado e realize pressão suave com as pontas dos dedos na extremidade posterior do animal para remover qualquer fezes presentes no cólon distal. Agora, injete uma pequena quantidade da solução de DNBS para lubrificar o cólon e facilitar a inserção, inserindo suavemente o cateter por via intra-retal cerca de três a quatro centímetros. Uma vez posicionado o cateter, injete 100 microlitros de DNBS ou volume equivalente de etanol a 50% para os animais controle.

Em seguida, posicione o animal com a cabeça para baixo por 90 segundos para evitar perda dos reagentes. Após a administração de DNBS, forneça aos animais água com 8%sacarose em salina 0,2% para prevenir desidratação durante a primeira semana. Monitore cuidadosamente o animal diariamente quanto à perda de peso, desidratação ou sofrimento pelo período do experimento até o ponto temporal desejado.

Após o desafio com DNBS, abra a cavidade abdominal do animal eutanasiado e remova todo o intestino grosso. Em seguida, abra o intestino longitudinalmente. Devem ser observadas úlceras mucosas macroscópicas aproximadamente dois a três centímetros proximais em relação à extremidade distal do cólon.

Colete seções de 0,5 centímetro próximas ao local de dano macroscópico máximo nos animais experimentais e segmentos do cólon das localizações anatômicas correspondentes nos animais controle. Em seguida, congele rapidamente em nitrogênio líquido 0,5 centímetros de uma seção controle e de uma seção tratada com 1D NBS para avaliação da atividade de mieloperoxidase e fixe as outras seções em formalina tampão neutra a 10% durante a noite para análise histológica. Na manhã seguinte, lave os tecidos fixados em formalina com etanol a 70% e coloque-os em um cassete para envio a um laboratório de histologia, onde serão emblocados em parafina e corados com hematoxilina e eosina para pontuação histológica.

Em seguida, analise pelo menos três secções de tecido de cada animal ao microscópio óptico para determinar os escores de dano histológico de cada grupo. Para ensaiar a atividade da mieloperoxidase nos tecidos desafiados com DNBS, primeiro homogeneíze os tecidos controle e experimentais congelados rapidamente no tampão de homogeneização de mieloperoxidase, obtendo uma suspensão com 50 miligramas de segmento de cólon por mililitro de tampão. Em seguida, alíquotas da solução homogeneizada em porções de um mililitro e centrifugue-as por dois minutos a 10.000 ×g e 4 °C.

Em seguida, transfira 100 microlitros de cada alíquota para cubetas individuais e adicione 2,9 mililitros de PBS suplementado com IDE, di-hidrocloreto e peróxido de hidrogênio, misturando vigorosamente. Por fim, meça a taxa de absorbância utilizando um espectrofotômetro a 460 nanômetros. Após desafio intrarretal com DNBS conforme acabou de ser demonstrado.

Perda significativa de peso é observada em 48 horas em ratos suplementados com óleo de peixe ou de canola, e em 72 horas em ratos suplementados com óleo de girassol. A perda máxima de peso observada ocorre em 48 horas em ratos suplementados com óleo de peixe, e em 72 horas em ratos suplementados com óleo de canola ou de girassol.

O ganho de peso retomou após 72 horas e, cinco dias após a administração de DNBS, os grupos tratados com óleo de peixe e óleo de cártamo exibiram pesos corporais semelhantes aos valores basais. Ratos controles suplementados com os óleos dietéticos e desafiados com etanol intrarretal ganharam peso progressivamente ao longo de todo o período de estudo de cinco dias. Os danos intestinais provocados pelo DNBS podem ser generalizados.

No entanto, a área de dano máximo geralmente está localizada nos seis centímetros distais do cólon em ratos e nos três centímetros distais em camundongos. Ao exame histológico mais detalhado, observa-se lesão epitelial extensa, incluindo formação de úlceras, infiltração de neutrófilos e linfócitos, esgotamento de muco e edema. Embora esses sinais histológicos de inflamação e dano tecidual sejam evidentes nos três grupos suplementados com óleos dietéticos após desafio com DNBS, o dano mais grave é observado no grupo tratado com óleo de cártamo, seguido pelo grupo tratado com óleo de canola.

Enquanto ratos do grupo com óleo de peixe demonstram lesão epitelial mínima e uma infiltração limitada de células inflamatórias na mucosa. As diferenças no dano histológico entre as amostras podem ser quantificadas para permitir uma melhor comparação entre os grupos. O gráfico ilustra os escores de dano histológico para os três grupos alimentares com óleos durante a colite induzida por DNBS.

Como é observado nas seções coradas com h e e, o grupo suplementado com óleo de cártamo apresenta o maior grau de dano, seguido pelo grupo com óleo de canola. Embora o grupo com óleo de peixe mostre a menor quantidade de dano, o grau de infiltrado de células inflamatórias, particularmente de neutrófilos, pode ser analisado mais detalhadamente mediante ensaio de atividade de mieloperoxidase. Conforme esperado a partir dos escores de dano histológico.

A avaliação da atividade da mieloperoxidase em cólons de ratos no quinto dia após a exposição ao DNBS revela um aumento da atividade nos três grupos, sendo a maior atividade de mieloperoxidase observada no grupo tratado com óleo de cártamo, seguido pelo grupo tratado com óleo de canola e pelo grupo tratado com óleo de peixe. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de anestesiar levemente os camundongos e otimizar as doses de DNBS após o seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para que pesquisadores na área da doença inflamatória intestinal explorassem mecanismos que controlam a inflamação intestinal em modelos animais de DII.

Não se esqueça de que trabalhar com DNBS pode ser extremamente perigoso, portanto, precauções como roupas protetoras, luvas, óculos de proteção e máscaras faciais devem sempre ser usadas durante o preparo da solução.