DNBS / TNBS Colite Modelos: elucidando sua Doença Inflamatória Intestinal e Efeitos de gordura na dieta

O objetivo geral deste procedimento é oferecer um método alternativo e barato para estudar a doença inflamatória intestinal ou DII usando DY nitro benzeno, ácido zônico ou DNBS. Isso é feito pela administração intrarretal do DNBS por meio de inserção suave no ânus. Na segunda etapa, seções de tecido do intestino grosso são adquiridas para triagem histológica e para avaliar a atividade da mielo peroxidase dos tecidos desafiados com DNBS, em última análise, os efeitos dos óleos dietéticos na perda de peso e colite podem ser avaliados por métodos macroscópicos e microscópicos.

A principal vantagem deste assunto sobre o método de sulfato de sódio dextron existente é que o método DNBS é fácil de executar, menos caro e altamente reprodutível. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de pesquisa da DII, como quais são os papéis do estresse e da depressão na recorrência da DII, ou quais são os mecanismos subjacentes na lesão e reparo intestinal. Para a instalação retal de DNBS em camundongos, comece conectando uma seringa de um mililitro a uma agulha de calibre 19. Equipado com um cateter de polietileno 50, aspire o DNBS recém-preparado para o cateter.

Em seguida, aplique gel lacrimal em um camundongo anestesiado e aplique uma leve pressão com as pontas dos dedos na extremidade posterior do animal para remover qualquer fezes presente no cólon distal. Agora injete uma pequena quantidade da solução DNBS para lubrificar o cólon para facilitar a inserção enquanto insere suavemente o cateter intra-retal cerca de três a quatro centímetros. Uma vez que o cateter esteja no lugar, injete 100 microlitros de DNBS ou um volume igual de 50% de etanol para os animais de controle.

Em seguida, posicione a cabeça do animal para baixo por 90 segundos para evitar a perda dos reagentes. Após a administração de DNBS, alimente os animais com 8% de água de sacarose em 0,2% de solução salina para evitar a desidratação durante a primeira semana. Monitorar cuidadosamente o animal diariamente quanto à perda de peso, desidratação ou angústia durante o experimento no momento desejado.

Após o desafio com DNBS, abra a cavidade abdominal do animal sacrificado e remova todo o intestino grosso. Em seguida, abra o intestino longitudinalmente. As úlceras macroscópicas da mucosa devem ser observadas a aproximadamente dois a três centímetros proximais da extremidade distal do cólon.

Colete cortes de 0,5 centímetros proximais ao local de dano macroscópico máximo nos animais experimentais e segmentos do cólon dos locais anatômicos correspondentes dos animais de controle. Em seguida, congele 0,5 centímetros de uma seção de controle e tratada com NBS 1D em nitrogênio líquido para avaliação da atividade da mielo peroxidase e fixe as outras seções em forma tamponada a 10% neutra durante a noite ou análise histológica. Na manhã seguinte, lave os tecidos fixados em formalina com etanol a 70% e coloque em um para enviar a uma unidade de histologia para serem incluídos em parafina e corados com hematina e eoína para pontuação histológica.

Em seguida, marque pelo menos três seções de tecido de cada animal sob um microscópio óptico para determinar os escores de dano histológico para cada grupo Para testar a atividade da mielo peroxidase dos tecidos desafiados pelo DNBS. Primeiro, homogeneizar o controle congelado e os tecidos experimentais em tampão de homogeneização da mielo peroxidase para obter um segmento de cólon de 50 miligramas por mililitro de suspensão de tampão de homogeneização. Em seguida, alíquota da solução homogeneizada em porções de um mililitro e centrifugue-as durante dois minutos a 10 000 vezes g e quatro graus Celsius.

Em seguida, transfira 100 microlitros de cada alíquota para cubetas individuais e adicione 2,9 mililitros de PBS suplementado com IDE, dicloridrato e peróxido de hidrogênio misturando vigorosamente. Finalmente, meça a taxa de absorbância usando um espectrofotômetro a 460 nanômetros. Após o desafio intra-retal com DNBS, como acabamos de demonstrar.

Perda de peso significativa é observada em 48 horas em ratos suplementados com óleo de peixe ou canola e em 72 horas em ratos suplementados com óleo de cártamo. A perda de peso máxima observada ocorre em 48 horas em óleo de peixe, suplementado em ratos, e em 72 horas em ratos. Suplementado com óleo de canola ou cártamo.

O ganho de peso foi retomado após 72 horas e cinco dias após a administração de DNBS, os grupos tratados com óleo de peixe e óleo de cártamo exibiram pesos corporais semelhantes aos seus valores basais. Ratos de controle suplementados com os óleos dietéticos e desafiados com etanol intra-retal ganharam peso de forma constante durante todo o período de estudo de cinco dias. Os danos intestinais causados pela DNBS podem ser generalizados.

No entanto, a área de dano máximo é geralmente localizada nos seis centímetros distais do cólon em ratos e nos três centímetros distais em camundongos. Após uma avaliação histológica mais detalhada, observa-se lesão epitelial extensa, incluindo a formação de úlceras, infiltração de neutrófilos e linfócitos, depleção de muco e edema. Embora esses sinais histológicos de inflamação e dano tecidual sejam evidentes em todos os três grupos suplementados com óleo dietético após o desafio com DNBS, o dano mais grave é observado no grupo do óleo de cártamo, seguido pelo grupo do óleo de canola.

Considerando que os ratos do grupo do óleo de peixe demonstram lesão epitelial mínima e uma infiltração limitada de células inflamatórias na mucosa cosa. As diferenças no dano histológico entre as amostras podem ser quantificadas para permitir uma melhor comparação entre os grupos. O gráfico ilustra os escores de danos histológicos para os três grupos de óleos dietéticos durante a colite DNBS.

Como é observado nas seções coradas com h e e, o grupo suplementado com óleo de cártamo exibe a maior extensão de dano, seguido pelo grupo do óleo de canola. Embora o grupo do óleo de peixe mostre a menor quantidade de danos, a extensão do infiltrado de células inflamatórias, particularmente de neutrófilos, pode ser examinada com a realização de um ensaio de atividade da mielo peroxidase. Como esperado dos escores de danos histológicos.

A avaliação da atividade da mielo peroxidase no cólon de ratos no quinto dia após a exposição ao DNBS revela um aumento na atividade em todos os três grupos, com a maior atividade da mielo peroxidase observada no grupo do óleo de cártamo, seguido pelo grupo do óleo de canola e do grupo do óleo de peixe. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de anestesiar levemente os camundongos e otimizar as doses de DNBS após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da doença inflamatória intestinal explorarem mecanismos que controlam a inflamação intestinal em modelos animais de DII.

Não se esqueça de que trabalhar com DNBS pode ser extremamente perigoso, portanto, precauções como roupas de proteção, luvas, óculos de proteção e tratamentos faciais devem sempre ser usadas ao preparar a solução.