Name: Super-Resolution Imaging da Neuronal Vesicles Dense-core (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Aprenda a realizar microscopia PALM em neurônios hipocampais para visualizar a organização de vesículas em super-resolução. Este método permite analisar agrupamentos e separação de vesículas com precisão nanométrica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health concede 2 R15 GM061539-02 (a BAS), 2 R15 NS40425-03 (para JEL), MH 66179 (com o Dr. Gary Banker da Oregon Health &amp; Science University / OHSU) e P30 NS061800 (o Dr. Sue Aicher de OHSU). Agradecemos Barbara Smoody para amplo suporte com a cultura de neurônios do hipocampo, e as Dras. Brian Long e James Abney para uma leitura crítica do manuscrito.

1. Exemplo de Preparação <ol><li> Preparar ADN que codifica para uma quimera photoconvertible ou fotoactivável alvo para DCV são, utilizando-se técnicas de biologia molecular convencionais. Nota: Uma possibilidade é o ADN que codifica um activador do plasminogénio tissular-Dendra2 quimera (tPA-Dendra2). Dendra2 é uma proteína photoconvertible que muda de verde para vermelho emissão após a exposição à luz ultravioleta 12. </li><li> Neurônios do hipocampo em cultura de alta performance # 1.5 tampa desliza para ~ 5-10 dias, seguindo protocolos padrão 13. </li><li> Transfectar desenvolvimento neurónios do hipocampo utilizando um reagente lipídico catiónico. Nota: A infecção viral mediada é mais eficaz para os neurónios maduros. Esta abordagem alternativa tem sido descrito em detalhe noutro local 14. <ol><li> Preparar um tubo de 1,5 ml contendo aproximadamente 1 ug de ADN e 250 ul de meio mínimo essencial (MEM) e um segundo tubo de 1,5 mL contendo 4 mL de reagente de lípido catiónico e 250 ulde MEM. </li><li> Incubar as soluções durante 5 min. </li><li> Combina-se as duas soluções e incuba-se a mistura resultante durante mais 30 min. </li><li> Durante a incubação, preparar um prato contendo alguns mililitros de meio de cultura aquecido a 37 ° C. </li><li> Gentilmente transferir lamínulas contendo neurônios para o prato contendo meio quente e adicione a mistura de transfecção. </li><li> Incline o prato delicadamente e, em seguida, colocá-lo em uma incubadora a 37 ° C por 90 min. </li><li> Retornar neurônios ao seu &quot;prato casa&quot; e esperar ~ 12-18 horas. </li></ol></li><li> Fixar as células durante 45 minutos em paraformaldeído a 4% / 4% de sacarose em tampão fosfato salino (PBS, pH 7,4) aquecido a 37 ° C. Nota: Em experimentos de palma, que é importante para conseguir uma boa preservação da ultra-estrutura, e os protocolos de fixação formaldeído padrão utilizados para imunofluorescência normalmente não são suficientes 15. Uma razão importante para a preservação estrutural pobres é insuficiente ftempo ixation porque fixação de formaldeído envolve a formação de aduto e reticulação de proteínas, e este último processo é bastante lento 16. A fixação de 45 min ajuda a mitigar este problema, sem perda induzida pela excessiva fixação detectável de fluorescência. </li><li> Cobertura Wash desliza ~ 10x com filtrada PBS. Nota: Isto reduz contaminantes fluorescentes. Amostras de imagem de forma relativamente rápida após a fixação. Nas células de armazenagem intermédia a 4 ° C em PBS, filtrado em um recipiente à prova de luz. </li><li> Lamínulas montagem contendo neurônios em uma câmara em filtrada PBS. Nota: A amostra tem de ser montado em um meio aquoso, tal como PBS, com índice de refracção mais baixo do que a do vidro, para implementar fluorescência total reflexão interna (TIRF) à base de iluminação. Iluminação baseadas em TIRF é muito útil porque apenas cobertura fluoróforos deslizamento proximal está animado, e há uma grande queda associada na fluorescência de fundo 17. </li></ol> 2. Aquisição de Imagem &lt;/ P&gt; <ol><li> Ligue o sistema de imagem super-resolução. <ol><li> Ligue a lâmpada de arco. </li><li> Virar o &quot;sistema / pc&quot; e interruptores &quot;componentes&quot; (no interruptor remoto de energia) para &quot;on&quot;. </li><li> Ligue o computador (após o posto de tablet / encaixe controle microscópio acende). Nota: A estação de base pode ser usado para controlar e monitorar muitos atributos dos óptica e caminho da luz, nomeadamente escolha de objetivo e foco. </li><li> Clique duas vezes no ícone do software e escolha a opção &quot;Sistema start&quot; na caixa de diálogo de login. </li></ol></li><li> Examine a amostra. <ol><li> Abra a parte frontal e painéis de acesso no topo da cabine de segurança laser. </li><li> Incline o braço de luz transmitida para acessar o palco e objetivos. </li><li> Coloque óleo no alfa Plan-Apochromat 100X abertura numérica / NA = 1,46 (TIRF) objetiva. Nota: A maior 63X NA objectivo pode ser utilizado em vez do 100X. </li><li> Monte a amostra no palco, e elevar ªe objetivo em direção à amostra. </li><li> Monitorar a posição da lente usando a função XYZ da estação de ancoragem. Pare quando a lente está no estádio de foco (por exemplo, z ~ 2,50 milímetros). </li><li> Totalmente fechar os painéis de acesso. Nota: Para ativar a segurança do laser. </li><li> Afinar o foco usando as oculares e os botões na guia localizar. Nota: A guia localizar fornece acesso aos botões que produzem iluminação baseados em lâmpada de arco e facilita a observação direta da amostra com as oculares. Da mesma forma, a guia aquisição fornece acesso a ferramentas que produzem iluminação a laser e facilita a captura da imagem pela câmera. <ol><li> Vá até a aba localizar, escolha &quot;Trans On&quot;. </li><li> Clique no símbolo de expansão ocular. Nota: Isso traz um esquema do caminho da luz. Atributos do caminho da luz pode ser alterada clicando esquerda ícones apropriados no esquema ou usando a tela sensível ao toque na docking station. Por exemplo, um filtroapropriada para visualização de emissão de Dendra2 pode ser escolhido usando o ícone refletor revólver. </li><li> Olhe pelas oculares, e trazer as células para o foco usando a estação de ancoragem como um guia. Nota: A amostra será muito pouco povoada com células fluorescentes porque neurônios do hipocampo são difíceis de transfecção, e, portanto, pode ser um pouco complicado de se concentrar com uma iluminação refletida. Se este for o caso, usam iluminação transmitida e a leitura Z da estação de base como um guia. </li><li> Alterne a luz &quot;Off&quot; depois de focar. </li></ol></li></ol></li><li> Identificar uma célula que é bastante brilhante, apresenta ponteada fluorescência, e tem uma morfologia clássico que é indicativo de uma boa saúde. <ol><li> Escolha a luz refletida eo filtro apropriado para a visualização de emissão verde Dendra2. </li><li> Digitalize a lamínula para células expressando quimeras Dendra2 utilizando luz baixa excitação intensidade. </li></ol></li><li> Mude para o ACQguia uisition. <ol><li> Use o &quot;gerente experimento&quot; para carregar uma configuração de aquisição PALM que adequadamente concebido ou modificado facilmente. Nota: Se tais experiências não existir, criar uma configuração experimental começar usando as seguintes configurações como um guia: sliders potência do laser: 405 nm (~ 0,01% para um laser mW 50); 488 nm (~ 3% de um laser de 100 mW); 561 nm (~ 40%, para um laser de 100 mW); Tempo de exposição: ~ 50 ms; Ganho Camera: ~ 200; Aquisição Multidimensional: séries temporais (ciclos = 30.000, interval = 0); Faixas: 488 nm com epi-iluminação, e 561 nm com iluminação baseada em TIRF (veja o passo 2.5.1); Objetivo: 100X (NA = 1,46); Deslizante ângulo TIRF: ângulo de incidência ~ 67-72 °; O tamanho do pixel: 100 nm; Campo de visão: TIRF (as escolhas alternativas produzir intensidades superiores a laser e são utilizados para fluoróforos que são mais difíceis de lixívia). </li><li> Clique em &quot;sim&quot; quando um menu pop-up aparece com uma consulta sobre a mudança em lasers. </li></ol></li><li> Traga a imagemda célula para o foco no plano da câmara. <ol><li> Escolha a 488 nm epi-iluminação pista laser. Nota: As faixas são configurações de feixe utilizados durante o exame. Aqui, os nomes das faixas são determinadas pelo comprimento de onda de excitação que produz a emissão que é passado para a câmara. Por exemplo, a faixa de 561 nm usa tanto o 405 e 561 linhas de laser nm, mas o cubo de filtro passa apenas emissão de photoconverted Dendra2 animado com 561 nm de luz para a câmera. </li><li> Foque a imagem da célula na câmara usando o botão de aquisição &quot;contínuo&quot;. </li></ol></li><li> Coletar uma imagem de campo amplo convencional. <ol><li> Use o botão &quot;Ajustar&quot;. </li><li> Salve a imagem, indo para o menu &quot;Arquivo&quot; e escolha &quot;Salvar / Salvar como.&quot; </li></ol></li><li> Configure a iluminação à base de TIRF. <ol><li> Escolha a faixa de 488 e mudar para &quot;TIRF&quot; utilizando o botão EPI / TIRF. </li><li> Escolha aquisição &quot;contínuo&quot;. </li><li> Ajuste tele TIRF baseada iluminação slider. Nota: TIRF é conseguido quando existe um escurecimento súbita de fundo E a amostra pode ser focada num plano 18. Se novas características tornam-se aparentes através focando-se na amostra, o ângulo de incidência é muito baixa, porque em TIRF existe apenas um plano de foco. </li><li> Duplo verificar o ângulo TIRF usando a faixa 561 com o laser de 405 nm &quot;off&quot;. </li><li> Ligue o laser de 405 nm de volta &quot;on&quot; antes de iniciar um experimento PALM. </li></ol></li><li> Coletar dados de palma. <ol><li> Hit &quot;start experimento.&quot; Nota: Se desejar, abra a aba &quot;opções de processamento on-line&quot; e marque &quot;PALM linha de processamento&quot; e &quot;Fit Gauss2D&quot; (antes do início do experimento) para monitorar a imagem PALM reconstruído durante a coleta de dados brutos. Isto irá facilitar a avaliação da qualidade dos dados e, consequentemente, o valor de continuar o processo de recolha de dados relativamente demorada. </li><li> Visualmentemonitorar fotoconversão. </li><li> Aumente a intensidade do laser de 405 nm (photoconverting) quando diminui fotoconversão Dendra2 (normalmente após a aquisição de ~ 10.000 imagens RAW). </li><li> Continue o experimento se fotoconversão aumenta. Caso contrário, parar o experimento (sem perda de dados) clicando no botão &quot;stop&quot; atual etapa. </li><li> Salve as imagens quando a coleta de dados seja concluída (após ~ 15 min). </li></ol></li></ol> 3. Processamento de Imagem, Exibição e Análise <ol><li> Na ausência de tratamento, processar imagens RAW online que foram salvos em disco. <ol><li> Clique na aba processamento, abra a guia método, e selecione &quot;PALM&quot;. </li><li> Escolha &quot;PALM&quot; novamente a partir dos quatro sub-opções. </li><li> Vá para o menu arquivo, abrir e visualizar o arquivo de interesse, e clique em &quot;selecionar&quot;. </li><li> Hit &quot;aplicar&quot;. Nota: Isto irá iniciar pico / constatação fluoróforo e pico localização com opti padrãoons. Se necessário, os picos também podem ser agrupados usando a guia &quot;PAL-grupo&quot;. Agrupamento atribui picos que aparecem em várias estruturas consecutivas a uma única molécula, se as coordenadas de pico são suficientemente semelhantes. Além disso, os dados podem ser corrigidos para desvio de amostra usando opção de alinhamento deriva baseado no modelo do software. </li></ol></li><li> Filtre componentes mal localizada e mal incluídos na amostra os dados localizados de pico. <ol><li> Descarte fluoróforos com precisões de localização, σ,&gt; 35 nm usando a função &quot;PAL-Filter&quot;. </li><li> Descarte fluoróforos em áreas onde a distância média entre os picos, d, é muito grande para resolver vesículas de diâmetro, D. <ol><li> Extraia a precisão média de localização, σ, a partir do histograma de precisão de localização. </li><li> Calcule o valor máximo aceitável para d baseado em σ, ea Criterion Shannon-Nyquist 19, tal como consagrado na resolução aproximação 20 R = D =[(2.35σ) 2 + (2-D) 2] 1/2. </li><li> Definir o limite do &quot;Remover discrepantes PALM&quot; ferramenta para eliminar picos cercados por menos de πD 2 / (4d 2) vizinhos dentro de um círculo de raio D / 2. </li></ol></li><li> Converta os dados PALM transformado em uma imagem PALM usando a função &quot;PAL-Rendering&quot;; veja a Figura 1. </li><li> Quantificar os tamanhos e separações, escolhendo a função &quot;Perfil&quot;. <ol><li> Verifique a linha de associado e opções de tabela, e desenhar uma linha ao longo da direção desejada na imagem. </li><li> Quantificar diâmetros, determinando medida da largura à meia máxima intensidade. </li><li> Quantificar separações determinando pico-a-pico espaçamentos de perfis de intensidade. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Goldstein, A. Y., Wang, X., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+and+the+delivery+of+pre-synaptic+components%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components.</a> Curr Opin Neurobiol. 18, 495-503 (2008).</li>
<li>Combs, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%3A+a+concise+guide+to+current+imaging+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods.</a> Curr Protoc Neurosci. , (2010).</li>
<li>Sengupta, P., Van Engelenburg, S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+cell+structure+and+function+with+point-localization+superresolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing cell structure and function with point-localization superresolution imaging.</a> Dev Cell. 23, 1092-1102 (2012).</li>
<li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlberts%2C+B+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22">Molecular Biology of the Cell</a>. , Garland Science Publishing. (2007).</li>
<li>Bury, L. A., Sabo, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+trafficking+of+synaptic+vesicle+and+active+zone+proteins+prior+to+synapse+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Coordinated trafficking of synaptic vesicle and active zone proteins prior to synapse formation.</a> Neural Dev. 6, 24 (2011).</li>
<li>Matsuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+activity-dependent+secretion+of+brain-derived+neurotrophic+factor+from+axon+and+dendrite%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential activity-dependent secretion of brain-derived neurotrophic factor from axon and dendrite.</a> J Neurosci. 29, 14185-14198 (2009).</li>
<li>Tao-Cheng, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+localization+of+active+zone+and+synaptic+vesicle+proteins+in+a+preassembled+multi-vesicle+transport+aggregate%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural localization of active zone and synaptic vesicle proteins in a preassembled multi-vesicle transport aggregate.</a> Neuroscience. 150, 575-584 (2007).</li>
<li>Zhai, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembling+the+presynaptic+active+zone%3A+a+characterization+of+an+active+zone+precursor+vesicle%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Assembling the presynaptic active zone: a characterization of an active zone precursor vesicle.</a> Neuron. 29, 131-143 (2001).</li>
<li>Ahmari, S. E., Buchanan, J., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+presynaptic+active+zones+from+cytoplasmic+transport+packets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Assembly of presynaptic active zones from cytoplasmic transport packets.</a> Nat Neurosci. 3, 445-451 (2000).</li>
<li>Garner, C. C., Zhai, R. G., Gundelfinger, E. D., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+CNS+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of CNS synaptogenesis.</a> Trends Neurosci. 25, 243-251 (2002).</li>
<li>Chuang, J. Z., Milner, T. A., Zhu, M., Sung, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+29+kDa+intracellular+chloride+channel+p64H1+is+associated+with+large+dense-core+vesicles+in+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A 29 kDa intracellular chloride channel p64H1 is associated with large dense-core vesicles in rat hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 19, 2919-2928 (1999).</li>
<li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+photoactivatable+fluorescent+protein+Dendra2+to+track+protein+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement.</a> Biotechniques. 42, (2007).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Scalettar, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hindered+submicron+mobility+and+long-term+storage+of+presynaptic+dense-core+granules+revealed+by+single-particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Hindered submicron mobility and long-term storage of presynaptic dense-core granules revealed by single-particle tracking.</a> Dev Neurobiol. 72, 1181-1195 (2012).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putting+super-resolution+fluorescence+microscopy+to+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Putting super-resolution fluorescence microscopy to work.</a> Nat Methods. 6, 21-23 (2009).</li>
<li>Helander, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+binding+in+brain+and+kidney%3A+A+kinetic+study+of+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histotechnology%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde binding in brain and kidney: A kinetic study of fixation.</a> Journal of Histotechnology. 22, 317-318 (1999).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology.</a> Traffic. 2, 764-774 (2001).</li>
<li>Toomre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alignment+and+calibration+of+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Alignment and calibration of total internal reflection fluorescence microscopy systems.</a> Cold Spring Harb Protoc. 4, 504-509 (2012).</li>
<li>Shannon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Communication+in+the+presence+of+noise%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+IRE%22%5BJournal%5D)">Communication in the presence of noise.</a> Proc IRE. 37, 10-21 (1949).</li>
<li>Hess, S. T., Gould, T. J., Gunewardene, M., Bewersdorf, J., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh+resolution+imaging+of+biomolecules+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh resolution imaging of biomolecules by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Methods Mol Biol. 544, 483-522 (2009).</li>
<li>Sengupta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+protein+heterogeneity+in+the+plasma+membrane+using+PALM+and+pair+correlation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis.</a> Nat Methods. 8, 969-975 (2011).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> J Cell Biol. 190, 165-175 (2010).</li>
<li>Zhong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivated+localization+microscopy+%28PALM%29%3A+an+optical+technique+for+achieving+%7E10-nm+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Photoactivated localization microscopy (PALM): an optical technique for achieving ~10-nm resolution.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).</li>
<li>Lochner, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+copackaging+and+cotransport+yields+postsynaptic+colocalization+of+neuromodulators+associated+with+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Efficient copackaging and cotransport yields postsynaptic colocalization of neuromodulators associated with synaptic plasticity.</a> Dev Neurobiol. 68, 1243-1256 (2008).</li>
<li>Geisler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drift+estimation+for+single+marker+switching+based+imaging+schemes%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Drift estimation for single marker switching based imaging schemes.</a> Optics Express. 20, 7274-7289 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

PALM e técnicas de microscopia de fluorescência de super-resolução relacionados surgiram recentemente como um complemento valioso para as formas mais bem estabelecidos da microscopia óptica e microscopia eletrônica (EM) 22-24. Atributos positivos da PALM incluem a preparação da amostra relativamente simples e mínima perturbação da amostra. Em princípio, PALM também pode ser usado para estudar as células vivas. Provavelmente, o principal atributo negativo da Palm é a aquisição de dados demorada, o que dificult...

Um número de processos celulares dependem de tráfico de vesículas mediada preciso e eficiente de biomoléculas a destinos específicos subcelulares. Um exemplo proeminente é a montagem sináptica, que é precedida de longo alcance, a entrega mediada por vesículas sinápticas de eleitores a partir de sites de biogênese na soma neuronal para pré e pós-sinápticos locais potencialmente distais 1. A microscopia de fluorescência é um método poderoso e popular de estudar tráfico vesícula. Pontos fortes da técnica incluem a sua sensibilidade, especificidade e compatibilidade com imagens ao vivo 2. Infelizmente, até há relativamente pouco tempo, a técnica tem sofrido com uma grande fraqueza, resolução de difração limitada 2, o que dificulta os estudos de estruturas com dimensões menores do que ~ 250 nm. Recentemente, a resolução lateral em microscopia de fluorescência ultrapassou a barreira de difração com a introdução de super-resolução mi de fluorescênciatécnicas croscopy, como PALM 3. A resolução lateral do PALM, dezenas de nanômetros, é ideal para o estudo de vesículas, que têm dimensões que variam tipicamente de ~ 50-250 nm 4. Assim, é agora possível a utilização de fluorescência, com seus pontos fortes inumeráveis, para elucidar um espectro de atributos anteriormente inacessíveis de vesículas, incluindo alguns aspectos de seu tráfico para sites subcelulares específicos. PALM não é trivial de implementar, e estratégias bem sucedidas, muitas vezes deve ser adaptado para o tipo de sistema em estudo. Aqui nós descrevemos como implementar estudos palma da estruturas vesiculares, e demonstrar a eficácia da nossa abordagem para o caso de as DCV são em neurônios do hipocampo. Em particular, podemos usar PALM para tratar a hipótese de que o tráfico de DCV são de sinapses em neurónios do hipocampo é mediada por grupos DCV 5-8. Tráfico mediada pelo Cluster de vesículas de sinapses no desenvolvimento de neurons é uma possibilidade intrigante, pois pode facilitar a rápida estabilização sináptica e montagem 9,10. Os defensores do tráfico em cluster do DCV são citar o grande tamanho aparente de puncta fluorescente extrasynaptic abrigar carga DCV exógena como provas agrupamento 6. No entanto, estes pontos lacrimais aparecem em imagens geradas utilizando técnicas de microscopia de fluorescência limitada de difração, que não são adequados para os efeitos do tamanho de distinção decorrentes da difracção dos que resultem do agrupamento. Para resolver esse problema, foram coletadas fluorescência widefield convencional e imagens palma da neurônios que expressam quimeras direcionados para as DCV são. A análise destas imagens revelaram que&gt; 92% dos clusters DCV extrasynaptic putativos em imagens convencionais são resolvidos como 80 nm (individual porte DCV-) 11 puncta em imagens de palma. Assim, estes dados largamente invalida a hipótese de agrupamento aplicado a DCV são no desenvolvimento hippocaMpal neurônios.

<table><tbody><tr><td>Zeiss PALM</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Elyra PS.1</td><td>Com software Zeiss Efficient Navigation (ZEN) e filtro de fluorescência Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633&nbsp;</td></tr><tr><td>Reagente de Transfecção de Lipofectamina 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Tecnologias de Vida Média Essencial</td><td></td><td>Mínima 11095-080</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered</td><td>Saline Life Technologies</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>19208</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-8501</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas de Vidro de Crescimento 18 mm 1.5D</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0059095</td><td></td></tr></tbody></table>

super-resolution imaging da neuronal vesicles dense-core

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

<html> A detecção de fluorescência fornece a base para muitas técnicas de microscopia amplamente utilizados e rápido avanço empregados em aplicações biológicas e médicas modernas. Forças de fluorescência incluem a sua sensibilidade, especificidade e compatibilidade com imagens ao vivo. Infelizmente, as formas convencionais de microscopia de fluorescência sofrem de uma grande fraqueza, a resolução de difração limitada no plano de imagem, o que dificulta os estudos de estruturas com dimensões menores do que ~ 250 nm. Recentemente, essa limitação foi superada com a introdução de técnicas de microscopia de fluorescência de super-resolução, como a microscopia localização fotoativados (PALM). Ao contrário de suas contrapartes convencionais, PALM pode produzir imagens com uma resolução lateral de dezenas de nanômetros. É, portanto, agora possível a utilização de fluorescência, com os seus pontos fortes inumeráveis, para elucidar um espectro de atributos anteriormente inacessíveis da estrutura celular e organização. _content &quot;&gt; Infelizmente, PALM não é trivial de implementar, e estratégias bem sucedidas, muitas vezes deve ser adaptado para o tipo de sistema em estudo. Neste artigo, vamos mostrar como implementar estudos PALM uma única cor de estruturas vesiculares, em neurônios cultivados fixos. PALM é ideal para o estudo de vesículas, que têm dimensões que variam tipicamente de ~ 50-250 nm. As principais etapas da nossa abordagem incluem a rotulagem de neurônios com photoconvertible (verde para vermelho) quimeras de carga vesícula, coletando imagens cruas pouco amostradas com um sistema de microscopia super-resolução e processamento de imagens RAW para produzir imagem PALM de alta resolução. Nós também demonstrar a eficácia da nossa abordagem, apresentando imagens excepcionalmente bem-resolvidos de vesículas densa-core (DCVS) em neurônios do hipocampo em cultura, que refutam a hipótese de que o tráfico de DCV são extrasynaptic é mediado em grande parte por grupos DCV.

A Figura 1 mostra um produto final de imagem e processamento. Nesta imagem PALM, coordenadas laterais fluorophores localizados são mostrados usando o modo de exibição centróide, ea imagem de super-resolução da DCV associado é mostrado usando o modo de exibição de Gauss. Figura 2A mostra widefield análogo e imagens palma da soma e processos proximais de oito dias em neurônio hipocampo vitro expressando tPA-Dendra2. Características importante...

Nós descrevemos como implementar microscopia localização fotoativados (PALM) baseada em estudos de vesículas em fixos, neurônios cultivados. Os principais componentes do nosso protocolo incluem rotulagem vesículas com quimeras photoconvertible, coletando imagens cruas pouco amostradas com um sistema de microscopia de super-resolução e processamento das imagens em bruto para produzir uma imagem de super-resolução.

Super-Resolution Imaging da Neuronal Vesicles Dense-core

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

O objetivo geral do procedimento a seguir é obter imagens de fluorescência com super-resolução que esclareçam aspectos importantes da organização de vesículas com uma resolução que, de outra forma, seria inatingível pela microscopia de fluorescência. Isso é realizado primeiramente seccionando neurônios do hipocampo com DNA que codifica quimeras fotoconvertíveis de cargas vesiculares. Na segunda etapa, imagens brutas amostradas esparsamente são coletadas com o sistema de microscopia de super-resolução.Em seguida, as imagens brutas são processadas para gerar uma imagem de super-resolução. Na etapa final, os dados são quantificados para elucidar a organização das vesículas. Em última análise, perfis lineares da intensidade de pontos podem ser utilizados para comparar a separação das vesículas com a largura das vesículas, determinando assim se as vesículas estão suficientemente próximas para formar um aglomerado usando este procedimento.A microscopia de localização ativada por luz com um único cor, ou PALM, pode ser utilizada para estudar a organização de organelas na maioria dos tipos de células cultivadas. Para iniciar o sistema de imagem de super-resolução para a aquisição de imagen

super-resolution-imaging-of-neuronal-dense-core-vesicles

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Imagens de células vivas é de utilidade particular quando se estuda a dinâmica do tráfico organela. Aqui nós descrevemos um protocolo para geração de imagens ao vivo de vesículas com núcleo denso em neurônios cultivados com grande campo de microscopia de fluorescência. Este protocolo é flexível e pode ser adaptado para outras organelas imagem, tais como mitocôndrias, endossomos, e peroxissomos.

Imagens ao vivo de vesículas com núcleo denso na Primária Cultivadas neurônios do hipocampo

Microscopia Multiphoton de órgãos inteiros de rato é possível através opticamente limpando o órgão antes de imagem, mas nem todos os protocolos de preservar o sinal de fluorescência de proteínas fluorescentes. Usando um método de compensação óptica com base de etanol a desidratação e álcool benzílico: benzil benzoato de compensação, que mostram imagens de alta resolução multifotônica de cérebro de rato inteiro expressando YFP.

Microscopia multifotônica do cérebro do rato Cleared Expressando YFP

Quadridimensional (4D) de imagem é utilizada para estudar o comportamento e as interacções entre os dois tipos de endossomas em terminais nervosos vertebrado vivo. O movimento destas pequenas estruturas é caracterizado em três dimensões, permitindo a confirmação de eventos, tais como a fusão do endossoma e exocitose.

Visualização de endosome Dynamics em Viver terminais nervosos com quatro-dimensional imagens de fluorescência

Apresenta-se um protocolo para a utilização do método de coloração de Golgi-Cox em secções do cérebro de espessura, a fim de visualizar os neurónios com árvores dendriticas longos contidos dentro de amostras de tecidos individuais. Duas variantes deste protocolo são também apresentados que envolvem cresilo contracoloração violeta, e a congelação dos cérebros não transformadas, para o armazenamento a longo prazo.

Neurônios de imagem dentro de seções do cérebro grossas usando o método de Golgi-Cox

Aqui nós apresentamos um protocolo baseado em microscopia para imagens de alta resolução e uma reconstrução tridimensional do mouse unidade neurovascular e barreira hemato - encefálica usando seções flutuantes de cérebro. Este método permite a visualização, análise e quantificação das organelas intracelulares no BBB.

De alta resolução de imagem latente Confocal da barreira sangue - cérebro: geração de imagens, reconstrução 3D e quantificação de Transcytosis

Volume é um parâmetro importante sobre células características fisiológicas e patológicas. Nós descrevemos um método de exclusão fluorescente permitindo a medição de campo integral em vitro neuronal volume com sub micrométrica resolução axial, necessária para a análise de neuritos e estruturas dinâmicas implicadas em crescimento neuronal.

De alta resolução Volume Imaging de neurônios pela exclusão da utilização da fluorescência método e dedicado Microfluidic dispositivos

Este protocolo mostra como empregar microscopia de super-resolução para estudar a co-localização de proteínas em culturas neuronais primárias.

Imagem de super-resolução para estudar co-localização de proteínas e marcadores sinápticos em neurônios primários

A morfologia dendrítica neuronal muitas vezes está por trás da função. De fato, muitos processos de doenças que afetam o desenvolvimento de neurônios se manifestam com um fenótipo morfológico. Este protocolo descreve um método simples e poderoso para analisar arbores dendríticas intactas e suas espinhas associadas.

Imagem e quantificação de dendritos neuronais intactos via clareza de tecido

A microscopia de reconstrução óptica estocástica direta (dSTORM) é usada para contornar o limite típico de difração de microscopia leve e para visualizar exosóis na escala de nanômetros. Pode ser empregado em duas e três dimensões para caracterizar exossomos.

Microscopia de Reconstrução Óptica Estocástica Direta de Vesículos Extracelulares em Três Dimensões

O protocolo fornece um método detalhado de imagem neuronal na fatia cerebral usando um método de limpeza tecidual, ScaleSF. O protocolo inclui preparação de tecidos cerebrais, esclarecimento de tecidos, manuseio de fatias limpas e microscopia de varredura a laser confocal de estruturas neuronais de níveis mesoscópicos a microscópicos.

Um método de limpeza de tecidos para imagens neuronais de escalas mesoscópicas a microscópicas

Aprenda a realizar microscopia PALM em neurônios hipocampais para visualizar a organização de vesículas em super-resolução. Este método permite analisar agrupamentos e separação de vesículas com precisão nanométrica.

Super-Resolution Imaging da Neuronal Vesicles Dense-core

Explorar mais vídeos