Super-Resolution Imaging da Neuronal Vesicles Dense-core
2 de julho de 2014
Nós descrevemos como implementar microscopia localização fotoativados (PALM) baseada em estudos de vesículas em fixos, neurônios cultivados. Os principais componentes do nosso protocolo incluem rotulagem vesículas com quimeras photoconvertible, coletando imagens cruas pouco amostradas com um sistema de microscopia de super-resolução e processamento das imagens em bruto para produzir uma imagem de super-resolução.
O objetivo geral do procedimento a seguir é obter imagens de fluorescência com super-resolução que esclareçam aspectos importantes da organização de vesículas com uma resolução que, de outra forma, seria inatingível pela microscopia de fluorescência. Isso é realizado primeiramente seccionando neurônios do hipocampo com DNA que codifica quimeras fotoconvertíveis de cargas vesiculares. Na segunda etapa, imagens brutas amostradas esparsamente são coletadas com o sistema de microscopia de super-resolução.
Em seguida, as imagens brutas são processadas para gerar uma imagem de super-resolução. Na etapa final, os dados são quantificados para elucidar a organização das vesículas. Em última análise, perfis lineares da intensidade de pontos podem ser utilizados para comparar a separação das vesículas com a largura das vesículas, determinando assim se as vesículas estão suficientemente próximas para formar um aglomerado usando este procedimento.
A microscopia de localização ativada por luz com um único cor, ou PALM, pode ser utilizada para estudar a organização de organelas na maioria dos tipos de células cultivadas. Para iniciar o sistema de imagem de super-resolução para a aquisição de imagens, comece ligando a alimentação da lâmpada de arco. Em seguida, ligue o PC do sistema e os interruptores dos componentes no controle remoto de energia.
Ative o equipamento após o tablet de controle do microscópio ligar, ligue o computador e inicie o software. Expanda a janela de status de inicialização para verificar se o sistema está carregando normalmente e selecione a opção de iniciar o sistema na janela de login. Para posicionar a amostra para visualização, abra os painéis frontal e superior do gabinete de segurança a laser e incline o braço de luz transmitida para acessar a platina e os objetivos.
Em seguida, coloque óleo no objetivo alpha plan APO Chromat 100x para reflexão interna total, fluorescência ou turf. Escolha então um objetivo de baixa ampliação para a etapa inicial de foco. Agora, monte a amostra sobre a platina e eleve o objetivo em direção à amostra.
Monitorar a posição da lente utilizando a função X, Y, Z do tablet de controle. Pare quando a lente estiver aproximadamente em foco. Para visualizar a amostra e ajustar finamente o foco.
Abaixe o braço da luz e feche completamente os painéis de acesso. Em seguida, na guia localizar, clique no símbolo de expansão ocular para exibir um esquema do trajeto da luz, escolha trans ligado e verifique se o esquema mostra a luz transmitida da lâmpada incidindo sobre a amostra. Olhe através dos oculares e coloque as células em foco utilizando o tablet de controle como guia.
Em seguida, para identificar as células que expressam o DRA dois, escolha a luz refletida e o filtro apropriado para visualizar a emissão verde do den dois. Analise a lamínula utilizando luz refletida de baixa intensidade até encontrar uma célula saudável e brilhante, e então configure o software para adquirir os dados palm. Alterne para a aba de aquisição e use o gerenciador de experimentos para carregar a configuração apropriada de aquisição palm experimental.
Quando o menu pop-up aparecer com uma pergunta sobre a ativação dos lasers, clique em sim. Em seguida, foque a imagem da célula no plano da câmera. Escolha apenas a faixa de 488. Ajuste os parâmetros de aquisição, como o ganho E-M-C-C-D, e então selecione aquisição contínua.
Em seguida, ajuste a exibição para o brilho desejado e mova a objetiva até que a imagem na tela esteja focada. Depois, para capturar uma imagem convencional de campo amplo, clique no botão capturar e salve a imagem. Para configurar a iluminação turf no canal 488, selecione turf no botão epi turf.
Para otimizar a iluminação baseada em campo claro, escolha a aquisição contínua e ajuste o ângulo do campo claro até que o fundo escureça repentinamente e o espécime possa ser focalizado em apenas um plano. Alterne para o canal 561 com o laser de 405 nanômetros desligado. Ajuste o ganho do E-M-C-C-D em cerca de 200 e o tempo de exposição em aproximadamente 50 milissegundos.
Escolha o filtro de emissão que transmite na faixa vermelha e ajuste a intensidade do laser em cerca de 40%. Verifique novamente o ângulo do prisma para a trilha de 561. Para reduzir o fundo, ilumine a amostra até que o sinal de fundo desapareça. Utilize a trilha de 561 com apenas o laser de 561 ativado.
Para coletar os dados do palm, ligue o laser de 405 nanômetros para a faixa de 561 e ajuste a intensidade do laser de 405 a aproximadamente 0,01%. Para monitorar a imagem palm computada durante a aquisição, expanda o menu de opções de processamento online e marque processamento online palm para processar com os parâmetros padrão. Clique em iniciar experimento para começar a aquisição; durante a coleta de dados, monitore visualmente a fotoconversão, aumentando a intensidade do laser fotoconversor de 405 nanômetros. Quando a fotoconversão começar a diminuir.
Quando a conversão fotográfica deixar de aumentar após um aumento na intensidade do laser, clique em finalizar etapa atual. Para encerrar o experimento, salve o arquivo. Para processar as imagens salvas, clique na guia de processamento, expanda o menu de método e expanda o submenu palm.
Escolha novamente a palma entre as quatro subopções. Selecione a imagem apropriada para que ela apareça na janela de visualização. Expanda os parâmetros do método e clique em selecionar para inserir a imagem, expanda o campo de configurações e escolha padrão para executar a detecção de picos e localização com as opções padrão.
Pressione aplicar na guia de processamento para calcular a imagem palm, que aparecerá em uma guia separada na janela de visualização, a fim de filtrar quaisquer componentes mal amostrados nos dados. Utilize o teorema de amostragem de Nyquist e a ferramenta remover outliers palm para excluir picos em regiões onde a distância média entre picos, d minúsculo, é muito grande para resolver uma vesícula de diâmetro D maiúsculo. Com a imagem palm na janela de visualização, clique em selecionar para inserir a imagem e clique em aplicar. A nova imagem aparecerá em uma guia separada na janela de visualização para filtrar quaisquer flora.Fours mal localizados.
Vá até a guia do filtro PAL e delimite a flora aceita. Quatro precisões de localização com um sigma inferior a 35 nanômetros. Para escolher um modo de exibição para a imagem PAL, acesse a guia de renderização PAL, selecione uma resolução de pixel e o modo de exibição desejado.
Nesta imagem, um produto final representativo da palma do vesículo de núcleo denso neuronal ou VND, obtido pelo imageamento e processamento, é mostrado em vermelho. As coordenadas laterais das localizações detectadas em branco são exibidas usando o modo de exibição Centro, e a imagem de super-resolução do vesículo associado é mostrada usando o modo de exibição Gaussiano. Nesta segunda figura, são exibidas imagens análogas de campo amplo em verde e de palma em vermelho dos corpos celulares e processos proximais de um neurônio hipocampal em cultura de oito dias que expressa tpa, um marcador do compartimento dois.
Características importantes das imagens incluem a extensa correspondência um a um e sobreposição em amarelo entre os pontos e as imagens convencionais e PALM. O tamanho significativamente menor dos pontos PALM e a resolução ocasional de um único ponto de campo amplo em múltiplos pontos PALM. Aqui, uma imagem PALM de D cvs ao longo de parte de um processo de um segundo neurônio do hipocampo que expressa tpa.
DENDRA dois é mostrado. Observe o pequeno diâmetro e a aparência homogênea dos pontos, bem como a observação infrequente de pontos estreitamente opostos, que representam aglomerados putativos de VDCs. Nesta figura final, é descrito um método quantitativo simples para determinar se duas ou mais VDCs estão suficientemente próximas para compor um aglomerado.
Perfis lineares das intensidades dos pontos são gerados conforme mostrado nos gráficos, os quais podem então ser usados para quantificar a separação entre DCVs e a largura das DCVs. Se a separação exceder significativamente a largura, as DCVs não estão em contato uma com a outra. Por outro lado, se a separação for aproximadamente igual à largura, as DCVs podem estar em contato. Com base nesses critérios, as DCVs nesta imagem foram classificadas como não em contato, enquanto as DCVs nesta imagem foram classificadas como em contato, seguindo este procedimento.
Outros métodos, como a palma de duas cores, podem ser utilizados para estudar a localização relativa de estruturas distintas.
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Visão Geral
Este artigo descreve um protocolo para implementar a microscopia de localização por ativação fotônica (PALM) no estudo da organização de vesículas em neurônios cultivados e fixados. O método permite aos pesquisadores obter imagens de fluorescência com super-resolução que revelam detalhes sobre o arranjo das vesículas, os quais não são visíveis com a microscopia de fluorescência convencional.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Microscopia de Super-resolução
Antecedentes
- As vesículas desempenham um papel crucial na comunicação neuronal.
- Compreender a organização das vesículas é essencial para obter insights sobre a função sináptica.
- A microscopia convencional não possui a resolução necessária para estudar efetivamente a dinâmica das vesículas.
- A microscopia de localização por ativação fotônica (PALM) oferece uma solução ao fornecer capacidades de imagem de super-resolução.
Objetivo do Estudo
- Elucidar a organização de vesículas em neurônios.
- Comparar a separação e a largura das vesículas utilizando perfis lineares da intensidade dos pontos.
- Aprimorar a compreensão do agrupamento de vesículas e suas implicações para a transmissão sináptica.
Métodos Utilizados
- Transfectar neurônios do hipocampo com DNA codificando quimeras fotoconvertíveis.
- Coletar imagens brutas com amostragem esparsa usando um sistema de microscopia de super-resolução.
- Processar imagens brutas para gerar imagens de super-resolução.
- Quantificar dados para analisar a organização de vesículas.
Resultados Principais
- Imagem bem-sucedida da organização de vesículas em super-resolução.
- A análise quantitativa revelou informações sobre o agrupamento de vesículas.
- Os perfis lineares indicaram relações entre a separação e a largura das vesículas.
- Os achados contribuem para uma melhor compreensão dos mecanismos sinápticos.
Conclusões
- O protocolo baseado em PALM é eficaz para estudar a organização de vesículas.
- A imagem de super-resolução fornece informações valiosas sobre a função neuronal.
- Estudos futuros podem se basear nesta metodologia para explorar ainda mais a dinâmica sináptica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A imagem de super-resolução permite a caracterização precisa de estruturas subcelulares abaixo do limite de difração, preenchendo uma lacuna crítica na validação de alvos para a descoberta de fármacos em neurociência. Ao resolver a organização de vesículas de núcleo denso em escala nanométrica, este método auxilia na redução de riscos mecanicistas de alvos sinápticos e melhora a confiança preditiva na identificação de compostos líderes. Ele fornece um sistema relevante para a doença na avaliação dos efeitos de compostos sobre o tráfego de vesículas e a maquinaria de liberação.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da visualização da organização de vesículas com resolução inferior a 250 nm.
- Valor Científico: Apoia a redução de riscos biológicos por meio da observação direta dos estados de agrupamento de vesículas de núcleo denso.
- Valor Científico: Esclarece o envolvimento de vias nos mecanismos de liberação de vesículas sinápticas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara modelos neuronais validados para triagem de alto conteúdo de moduladores que afetam a dinâmica de vesículas.
- Valor Científico: Fornece leituras quantitativas e reprodutíveis por meio da análise de perfil linear da intensidade e separação de pontos.
- Valor Científico: Estabelece a padronização do ensaio por meio de parâmetros definidos de fotoativação e aquisição de imagens.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Utiliza um sistema de neurônios do hipocampo relevante para doenças, alinhando-se a fenótipos de disfunção sináptica.
- Valor Científico: Oferece potencial translacional como biomarcador por meio de métricas de separação de vesículas que se correlacionam com a probabilidade de liberação.
- Valor Científico: Permite decisões de avanço ajustadas ao risco ao quantificar os efeitos do composto no agrupamento de vesículas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao fornecer validação de super-resolução do engajamento do alvo em modelos neuronais antes da otimização do composto líder.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre vias de tráfego de vesículas por meio de visualização direta em escala nanométrica.
- Triagem: Permite a preparação de ensaios por meio de amostragem esparsa e imagem de super-resolução de carga fotoconvertível.
- Análises: Gera medidas quantitativas de variáveis dependentes (separação de pontos, largura) para comparação entre condições.
- Pesquisa Translacional: Estabelece conexão com a continuidade pré-clínica por meio de um modelo de neurônio hipocampal relevante para distúrbios da memória e da cognição.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade de super-resolução reutilizável para múltiplos alvos associados a vesículas em diversos programas de neurociência.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade mecanicista na sinalização mediada por vesículas.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de protocolos padronizados de fotoativação e processamento de imagens.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não ao fornecer evidências estruturais de modulação do alvo.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco com base em fenótipos de organização de vesículas.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em microscopia de super-resolução e no manuseio de proteínas fotoconvertíveis.
- Necessita de um sistema de microscopia de super-resolução com linhas a laser de 405 nm, 488 nm e 561 nm.
- Exige padronização entre equipes nos parâmetros de aquisição e processamento de imagens.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes modelos neuronais e cargas de vesículas.
- Inclui limitações práticas, como fotobranqueamento e eficiência de marcação que afetam a densidade do sinal.
