O uso de cromatografia gasosa para analisar composicional Alterações de ácidos graxos no tecido de fígado de rato durante a gravidez

O objetivo geral deste procedimento é analisar a composição de ácidos graxos do fígado. Isso é feito primeiro pesando uma amostra de fígado e homogeneizando-a. O segundo passo é extrair todo o lipídio da amostra de fígado homogeneizada.

Em seguida, as classes lipídicas individuais, como ésteres de colesterol, são separadas usando extração em fase sólida. A etapa final é a ificação e derivitização das classes lipídicas em ésteres metílicos de ácidos graxos. Em última análise, a cromatografia gasosa é usada para mostrar como a composição de ácidos graxos dos tecidos pode mudar após a intervenção nutricional ou ser influenciada por mudanças no estado fisiológico, como a gravidez.

Embora esse método possa fornecer uma visão sobre a composição dos ácidos graxos do tecido, ele também pode ser aplicado a outros tipos de amostra, como óleo, sementes e alimentos. Geralmente, os usuários novos nessa técnica podem ter dificuldades, pois algumas partes do protocolo exigem destreza manual e precisam de prática, como a coleta repetitiva das fases superior e inferior. Demonstrando o procedimento estarão Hena, Fisk e Annette West, técnica e estudante de doutorado de nosso laboratório.

Primeiro corte aproximadamente 100 miligramas de fígado congelado e pese o tecido. Coloque o lenço em um tubo de plástico em um balde de gelo e adicione 0,5 mililitros de cloreto de sódio a 0,9% gelado. Em seguida, homogeneizar o tecido e transferir para um tubo com tampa de rosca de vidro.

Use mais 0,3 mililitros de cloreto de sódio a 0,9% para transferir qualquer tecido restante para o tubo com tampa de rosca de vidro. Em seguida, adicione 100 microgramas de colesterol padrão de heta dechen dissolvido em dois a um, clorofórmio seco ao metanol ao tubo, seguido por mais cinco mililitros da mesma solução solvente contendo 50 miligramas por litro de hidroxitolueno butilado. Depois de adicionar um mililitro de cloreto de sódio molar, tampe o tubo e misture bem a amostra por vórtice até que pareça uniforme.

Em seguida, centrifugue a amostra a 1000 vezes G por 10 minutos com baixa quebra à temperatura ambiente. Quando terminar, colete a fase inferior usando um copo passando pela pipeta e transfira-a para um novo tubo de vidro com tampa de rosca. Em seguida, seque a amostra sob nitrogênio a 40 graus Celsius.

Neste ponto, conecte o tanque SPE a uma bomba de vácuo e coloque um cartucho de SPE de sílica aminopropil no tanque. Coloque um novo tubo de vidro com tampa de rosca rotulado TAG e CCE no suporte do tanque sob a coluna para coletar a primeira fração. Dissolver o extracto lipídico total num mililitro de clorofórmio seco e misturar a amostra por vórtice.

Em seguida, transfira a amostra para a coluna usando uma pipeta de pasta de vidro e deixe o líquido pingar no tubo com tampa de rosca sob gravidade. Quando o líquido não pingar mais da coluna, remova o líquido restante a vácuo. Em seguida, eluir a fração TAG e CE lavando a coluna duas vezes com um mililitro de clorofórmio seco sob vácuo.

Quando todo o líquido tiver aludido da coluna, secar a fracção TAG e CE sob azoto a 40 graus Celsius. Coloque um novo cartucho de SPE de sílica aminopropílica no tanque de SPE e coloque um tubo de vidro com tampa de rosca na bandeja do tanque sob o cartucho para coletar os resíduos. Lave a coluna com um mililitro de hexano seco três vezes sob vácuo.

Depois de desligar o vácuo, lave a coluna com um último mililitro de hexano H sob gravidade. Depois de substituir o tubo de resíduos por um novo tubo de vidro com tampa de rosca rotulado ce, dissolva a fração seca de TAG e CE em um mililitro de hexano seco e misture a amostra por vórtice. Em seguida, transfira a amostra para a coluna usando uma passagem de vidro ou pipeta e deixe o líquido escorrer pela coluna sob gravidade.

Quando o líquido não pingar mais da coluna, remova o líquido restante sob vácuo sob vácuo. Lavar a coluna duas vezes com um mililitro de hexano seco para eluir o CE e secar a fracção recolhida sob azoto a 40 graus Celsius. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de tolueno seco à fração CE separada e misture a amostra por vórtice.

Adicionar um mililitro de um reagente de metilação previamente preparado à amostra dissolvida em tolueno seco. Em seguida, tampe o tubo com segurança e misture Aqueça suavemente a amostra por duas horas a 50 graus Celsius. Assim que as amostras esfriarem à temperatura ambiente, adicione um mililitro de solução neutralizante.

Em seguida, adicione um hexano seco à amostra Após a centrifugação em vórtice, as amostras a 250 vezes G por dois minutos com baixa interrupção à temperatura ambiente. Quando terminar, colete a fase superior de fama e transfira-a para um novo tubo de vidro descartável sem tampa de rosca. Seque a amostra de fama coletada sob nitrogênio a 40 graus Celsius.

Depois de colocar um tubo de resíduos no tanque de SPE e um gel de sílica, cartucho de SPE no tanque, lave a coluna três vezes com um mililitro de hexano seco sob vácuo e um mililitro de hexano seco sob gravidade. Após a remoção das lavagens de resíduos. Adicione um novo tubo de resíduos no tanque e, em seguida, dissolva a amostra de fama CE em um mililitro de hexano seco.

Depois de misturar a amostra por vórtice, transfira-a para a coluna usando uma passagem de vidro ou pipeta. Uma vez que o líquido tenha gotejado através da coluna sob gravidade, lave a coluna três vezes com um mililitro de hexano sob vácuo. Em seguida, remova as lavagens residuais e coloque um novo tubo sem tampa de rosca rotulado CE fame no tanque.

Eluir a fração de fama CE com dois mililitros de 95 a cinco hexano seco para éter etílico. Em seguida, seque a fração coletada sob nitrogênio a 40 graus Celsius, dissolva a fração seca em 75 microlitros de hexano seco e misture a amostra por vórtice após a amostra ter sido misturada por vórtice. Transfira-o para um frasco de amostra automática GC após repetir a etapa anterior.

Analise a amostra em um cromatógrafo de fase gasosa se o protocolo for seguido com sucesso. Deve obter-se um cromatograma com picos claros, simétricos e bem definidos e com ruído de fundo mínimo, como ilustrado aqui. Se tiver ocorrido contaminação, o cromatograma mostrará picos adicionais e exibirá picos assimétricos ou distorcidos, como mostrado aqui.

A contaminação do colesterol livre ocorrerá ao correr fama derivada do CE, a menos que o colesterol seja removido. O uso de uma mistura de calibração preparada permite a identificação do fame na amostra. A mistura de calibração é executada usando as mesmas configurações do instrumento que as amostras, para que o cromatograma possa ser comparado com a amostra e os picos identificados com base em seus tempos de retenção, conforme ilustrado aqui.

O pico zero 16 é destacado aqui para ilustrar a comparação dos tempos de retenção da mistura de calibração no cromatograma superior com os ácidos graxos. No traço da amostra inferior, permitir a marcação correta da área de pico de ácidos graxos é usado para calcular a porcentagem de ácidos graxos específicos dentro do total. Depois que os dados forem coletados, é útil inspecioná-los em busca de valores discrepantes, conforme mostrado aqui.

As amostras anómalas podem então ser investigadas mais aprofundadamente e a extração e/ou análise repetidas, se necessário. Como mostrado aqui, a fama no CE do fígado de rato é descrita como uma porcentagem do total de ácidos graxos no CE do fígado. Esses dados descrevem os ácidos graxos CE no fígado de ratos virgens ou prenhes alimentados por 20 dias em uma das três dietas diferentes.

A análise estatística usando o Innova de dois fatores revela efeitos significativos da dieta e da gravidez sobre a proporção de vários ácidos graxos, bem como interações significativas entre dieta e gravidez. Como ilustração, o teor de ácido cônico do CE hepático em ratas prenhes é mais influenciado pela dieta do que pelo de fêmeas virgens. Esta técnica permite que 20 amostras por dia sejam concluídas do início ao fim, se for realizada corretamente.

Uma vez dominado, o lote de amostras pode aumentar o rendimento e dobrar a quantidade processada em uma semana. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como analisar a composição de ácidos graxos de classes lipídicas individuais usando extração em fase sólida e cromatografia gasosa. Não se esqueça de que trabalhar com solventes pode ser extremamente perigoso e precauções como trabalhar em capelas e usar EPI adequado devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.