Name: Selecção de alta Scalable Rendimento de bibliotecas de anticorpos em fagos sintética exibida- (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Aprenda a selecionar anticorpos de alta afinidade a partir de bibliotecas de fagos exibidos usando um método escalável de alto rendimento. Esta técnica permite seleções paralelas contra centenas de antígenos simultaneamente.

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Gostaríamos de agradecer o Fundo Comum do NIH - Protein Programa de reagentes de captura para financiar o desenvolvimento da seleção anticorpo recombinante e caracterização gasoduto Antibody Rede e da Fundação Canadense para Inovação para a compra financiamento da plataforma seleção robótico.

<ol><li>Winter, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Man-made+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Man-made antibodies.</a> Nature. 349, 293-299 (1991).</li>
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Os autores não têm nada a revelar.

Ao conduzir em selecções de anticorpos in vitro, os dois principais determinantes do sucesso selecção são 1) o isolamento de alvos antigénicos bem dobradas para a selecção em cima e 2) a disponibilidade de uma biblioteca de anticorpos de alta diversidade funcional. Em muitos casos, a disponibilidade de quantidades suficientes de bem-dobradas, proteína de comprimento completo pode ser limitante. Uma abordagem para superar esta limitação é a utilização de domínios identificados a partir da análise de bio...

Com o início da era pós-genômica, a disponibilidade de reagentes de ligação de alta qualidade para caracterizar e modular proteínas é fundamental para abrir novas pesquisas e avenidas terapêuticas. Os anticorpos continuam a ser fundamentais para ambos os pesquisadores acadêmicos e industriais como a pesquisa básica e ferramentas de diagnóstico e terapêuticas potenciais. Não surpreendentemente, tem havido um crescimento impressionante de empresas de desenvolvimento de anticorpos contrato, a maioria dos que dependem de tecnologias de hibridoma convencionais para gerar anticorpos personalizados. No entanto, a seleção in vitro utilizando bibliotecas de anticorpos exibidos-fago está se tornando uma poderosa tecnologia alternativa que pode oferecer vantagens únicas e sucesso em que as tecnologias convencionais podem enfrentar limitações 1, 2. À luz do que uma considerável procura de anticorpos de alta qualidade como ferramentas de investigação, dois desafios principais para a produção de anticorpos são renováveis ​​1) selecção de transferência e 2) av antigénioailability. Um certo número de grupos têm agora descrito em condutas de selecção in vitro com vista a aumentar o rendimento e a taxa de identificação de anticorpos. Estas descrições detalhe uma variedade de abordagens que incluem seleccionar viáveis ​​em cima ou de comprimento completo como alvo 3,4, 5,6,7 ou domínios estruturalmente relacionado, usando 6,8 ou a placa de base de 3,4-regimes de antigénio de imobilização à base de grânulo. Além disso, o crescente adopção de tecnologias de síntese de genes 9 fez geração antigénio sistemática, particularmente de domínios isolados, razoavelmente custo eficaz e potencialmente pode aliviar a dificuldade na obtenção de quantidades suficientes de antigénio purificado, de comprimento completo. Ao utilizar as duas tecnologias em conjunto, um oleoduto auto-contido e geração antigénio escalável e selecção de anticorpos foi concebida que permita o isolamento de anticorpos para paralelo de grandes conjuntos de domínios de antigénios expressos e facilitar o desenvolvimento de reagentes para a characterizing classes inteiras de proteínas estruturalmente ou funcionalmente relacionados. Para atingir esse objectivo, um pipeline integrado que casais em silico identificação de domínios de antigénio, a síntese de genes expressáveis, expressão bacteriana de alto rendimento de antigénios e selecções de anticorpo exibido em fagos tem sido desenvolvido escaláveis. Este gasoduto requer apenas infra-estrutura básica disponível para a maioria dos laboratórios de ciências da vida (incluindo bibliotecas de anticorpos que são cada vez mais disponíveis através de licença ou de transferência de material acordo), mas também é passível de automação para uso em escala industrial. Usando este protocolo, é possível gerar centenas de domínios de antigénio marcado com afinidade, e rotineiramente isolar fragmentos de anticorpos altamente específicos para muitos destes antigénios. A tecnologia de apresentação de fagos demonstrou compatibilidade demonstrado com uma ampla variedade de formatos de reagentes de afinidade recombinantes incluindo Fab, scFv, Fv e domínios autónomos e umcrescente conjunto de pequenos &#39;estruturas alternativas&#39; (proteínas ankyrin repetição projetados (DARPINS), fibronectina (FN), domínios lipocalina e mais 10). Discussão é limitado neste exemplo para o isolamento de fragmentos de anticorpos Fab, embora se presume estes métodos podem ser adaptados a outros tipos de bibliotecas. Utilizando esta tecnologia, os Fabs com baixa afinidade nanomolar para pequeno, marcaram domínios proteicos, incluindo domínios de factor de transcrição, domínios SH2, proteínas e outros ligação RNA foram seleccionadas com sucesso, muitos dos quais se ligam a proteína de comprimento completo e são funcionais em imunoensaios tais como imunofluorescência , imunoprecipitação e imuno-histoquímica. Importante, clones de ligação recombinantes são totalmente renovável e pode ser re-gerada a partir de construções de expressão via oferta de produção bacteriana maior coerência, reprodutibilidade e custo-efetividade, justificando, assim, a despesa de validação clone rigorosa. Neste protOCOL e vídeo acompanhante, métodos básicos para a selecção de anticorpos a partir de bibliotecas exibidas em fagos utilizando domínios de antigénios imobilizados são demonstradas. Este método particular emprega domínios de proteínas marcadas com GST imobilizados por adsorção passiva em placas de micropoços, embora outras marcações 11,12,13 13,14,2 e formatos de selecção, também têm sido utilizados com sucesso. Considerações críticas para a instalação e condução das seleções com acompanhamento paralelo de parâmetros de seleção que visam identificar e isolar anticorpos clonais especificamente enriquecido para validação são detalhados.

<table><tbody><tr><td>MATERIAIS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Novo agitador de incubadora empilhável Brunswick Innova44</td><td>Eppendorf</td><td>M1282-0004</td><td></td></tr><tr><td>Liquidator Sistema de pipetagem de bancada manual de 96 canais</td><td>Anachem Ltd</td><td>LIQ-96-200</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de microplacas</td><td>VWR</td><td>12620-926</td><td></td></tr><tr><td>ThermoScientific Sorvall ST-40 centrífuga de bancada</td><td>Thermo Product</td><td></td><td></td>75004525</tr><tr><td>ELx405 Selecione a arruela de microplacas de poço profundo</td><td>Biotek</td><td>ELX405USD</td><td></td></tr><tr><td>Robô automatizado de seleção de fagos de alto rendimento personalizado</td><td>S & P Robotics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de falcão cónico de plástico: 50 ml</td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de plástico cónico Falcon: 15 ml</td><td>VWR</td><td>89039-668</td><td></td></tr><tr>Tubos de <td></td><td>microcentrífuga Axygen de 1,7 ml Placa</td><td>Maxisorp</td> de 96 poços/384 poços Corning <td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>M9410-1CS</td><td></td></tr><tr><td>Bloco de poços profundos com fundo em V de 96 poços Corning</td><td>Corning</td><td>3960</td><td></td></tr><tr><td>Axygen Mini-tubo Microplaca estéril de 96 poços caixa azul</td><td>Corning</td><td>AXY-MTS-06-C-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Película de vedação de placa adesiva respirável</td><td>VWR</td><td>60941-084</td><td></td></tr><tr><td>REAGENTES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de</td><td></td>catálogo</tr><tr><td>polietilenoglicol</td><td>Bioshop</td><td>PEG800.1</td><td></td></tr><tr><td>extrato de levedura</td><td>Bioshop</td><td>YEX401.1</td><td></td></tr><tr><td>bio-triptona</td><td>Bioshop</td><td>TRP402.1</td><td></td></tr><tr><td>N-Z amina</td><td>Sigma</td><td>C7290</td><td></td></tr><tr><td>glicose</td><td>Sigma</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>lactose</td><td>Bioshop</td><td>LAC234</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Bioshop</td><td>GLY001.500</td><td></td></tr><tr><td>carbenicilina&nbsp;</td><td>Bioshop</td><td>CAR544.10</td><td></td></tr><tr><td>canamicina</td><td>Bioshop</td><td>KAN201.25</td><td></td></tr><tr><td>tetraciclina&nbsp;</td><td>Bioshop</td><td>TET701.25</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bioshop</td><td>TWN510.500</td><td></td></tr><tr><td>fosfato de potássio monobásico</td><td>Bioshop</td><td>PPM302.1</td><td></td></tr><tr><td>fosfato de sódio dibásico</td><td>Anachemia</td><td>84486-440</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de sódio</td><td>Bioshop</td><td>SOD001.10</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de potássio</td><td>Bioshop</td><td>POC308.1</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de cálcio</td><td>Bioshop</td><td>CCL302.500</td><td></td></tr><tr><td>sulfato de magnésio</td><td>EMD</td><td>MX0070-1</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de magnésio</td><td>Bioshop</td><td>MAG510.500</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Amresco</td><td>0621-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Bioshop</td><td>SOS513.500</td><td></td></tr><tr><td>ágar</td><td>Bioshop</td><td>AGR001.500</td><td></td></tr><tr><td>SybrSafe DNA gel corante</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>ácido fosfórico</td><td>Acros Organics</td><td>201140010</td><td></td></tr><tr><td>lisozima</td><td>Bioshop</td><td>LYS702.25</td><td></td></tr><tr><td>benzonase</td><td>Novagen</td><td>71205</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td>Bioshop</td><td>TRX506.500</td></tr><tr><td>coquetel inibidor de protease comprimidos</td><td>Roche</td><td>11 836 170 001</td><td></td></tr><tr><td>Resina Ni-NTA&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>1018240</td><td></td></tr><tr><td>estoque de 1.000x fagos auxiliares (M13K07) (1013 fago por ml)</td><td>NEB</td><td>N0315S</td><td></td></tr><tr><td>HRP conjugado com anticorpos específicos M13-HRP (anti-M13-HRP).</td><td>GE Healthcare</td><td>27-9241-01</td><td></td></tr><tr><td>Substrato TMB: misture volumes iguais de substrato TMB e H2O2 peroxidase&nbsp;</td><td>KPL</td><td>50-76-00</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Biobasic</td><td>DD0056</td><td></td></tr><tr><td>Taq polimerase</td><td>Genscript</td><td>E00007</td><td></td></tr><tr><td>Exonuclease</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>EZ0073X-EZ</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatase alcalina de camarão</td><td>GE Healthcare</td><td>E70092Z-EZ</td><td></td></tr></tbody></table>

selecção de alta scalable rendimento de bibliotecas de anticorpos em fagos sintética exibida-

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

A demanda por anticorpos que atendam às necessidades de ambas as aplicações básicas e clínicas de pesquisa é alto e vai aumentar drasticamente no futuro. No entanto, é evidente que as tecnologias tradicionais não são monoclonais sozinho até esta tarefa. Isto conduziu ao desenvolvimento de métodos alternativos para satisfazer a procura de alta qualidade e reagentes de afinidade renováveis ​​para todos os elementos acessíveis do proteoma. Para este fim, os métodos de alto rendimento para a realização de seleções a partir de bibliotecas de anticorpos sintéticos exibido em fagos foram concebidos para aplicações que envolvem diversos antígenos e otimizado para o rendimento e sucesso rápido. Nisto, um protocolo é descrito em detalhe que ilustra com demonstração de vídeo a selecção de clones paralelo Fab-fago a partir de bibliotecas de alta diversidade contra centenas de alvos quer utilizando um manipulador de líquidos 96 canal manual ou sistema de robótica automatizado. Usando este protocolo, um único usuário pode gerar centenas de antígenos,selecionar anticorpos para-los em paralelo e validar a ligação do anticorpo dentro de 6-8 semanas. Destacam-se: i) um formato de antígeno viável, ii) caracterização antígeno pré-selecção, iii) passos críticos que influenciam a seleção de clones específicos de afinidade e alta, e iv) formas de eficácia seleção monitoramento e fase inicial de anticorpos clone caracterização. Com esta abordagem, temos obtido os fragmentos de anticorpos sintéticos (FAB) para muitas classes alvo, incluindo os receptores de uma só passagem de membrana, hormônios proteína secretada e proteínas intracelulares multi-domínio. Estes fragmentos são facilmente convertidos em anticorpos de comprimento total e foram validados para apresentar uma elevada afinidade e especificidade. Além disso, eles têm sido demonstrados para ser funcional em uma variedade de imunoensaios convencionais, incluindo Western blot, ELISA, imunofluorescência celular, ensaios de imunoprecipitação e afins. Esta metodologia irá acelerar a descoberta de anticorpos e, finalmente, trazer-nos mais perto de realizar o objetivo of gerar anticorpos qualidade renováveis, elevadas para o proteoma.

O protocolo aqui descrito foi utilizado para isolar fragmentos de anticorpo a uma variedade de ambos os domínios de antigénios structurally- e funcionalmente relacionados com o de bibliotecas combinatórias exibida por fagos de Fab em paralelo. Problemas relacionados com a disponibilidade de antigénio pode ser contornado, em muitos casos, por na identificação de domínios de antigénios silico expressáveis ​​que são apropriados para selecção de anticorpos 23. Ao acoplar a expressão de antigénio para selecção de ...

Um método é descrito com acompanhamento visual para a realização escaláveis, selecções de alto rendimento de bibliotecas combinatórias de anticorpos sintéticos exibidos em fagos contra centenas de antigénios simultaneamente. Usando esta abordagem paralela, isolámos fragmentos de anticorpos que exibem uma elevada afinidade e especificidade para diversos antígenos que são funcionais em imunoensaios convencionais.

Selecção de alta Scalable Rendimento de bibliotecas de anticorpos em fagos sintética exibida-

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

O objetivo geral deste procedimento escalonável é isolar clones de fagos Fab específicos e de alta afinidade a partir de uma biblioteca exibida em fago, utilizando uma abordagem de alto rendimento que permite seleção paralela contra centenas de domínios antigênicos-alvo. Isso é realizado primeiramente imobilizando domínios antigênicos purificados em placas de microplacas. Os próximos passos consistem em expor, capturar, liberar e amplificar clones de fagos Fab que se ligam especificamente ao antígeno imobilizado na microplaca, em rodadas sucessivas de seleção.Durante esse processo, a eficácia da seleção é monitorada utilizando métodos em pool a cada etapa. O passo final consiste em avaliar a especificidade, afinidade e/ou atividade dos clones de fab isolados. Em última instância, fragmentos de fab com alta afinidade e específicos contra um grande número de antígenos são isolados em paralelo, permitindo a geração de anticorpos úteis na análise de classes inteiras de proteínas estrutural ou funcionalmente relacionadas.A importância deste método reside no fato de que ele oferece uma alternativa que pode ajudar a superar as limitações e acelerar o ritmo das tecnologias convencionais de

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Neste vídeo, demonstramos a técnica de exibição de fagos para isolar fagos pré-projetados que expressam proteínas com alta afinidade com a proteína-alvo.

Usando a exibição de fagos para selecionar proteínas com alta afinidade com uma proteína-alvo

A exibição em fagos é uma técnica poderosa para captura de proteínas ou fracções de proteínas que interagem com uma molécula de interesse imobilizada. Uma vez tomada uma decisão sobre o tipo de biblioteca de cDNA de fagos para criar e tela, o protocolo descrito aqui permite a seleção de afinidade eficiente levando à identificação de interagentes.

Um protocolo para exibição Fago e Affinity Seleção Usando Iscas proteína recombinante

Os protocolos descritos permitem a construção, caracterização e seleção (contra o destino de escolha), de uma biblioteca de "domainome", feita a partir de qualquer fonte de DNA. Isto é conseguido por um pipeline de pesquisa que combina diferentes tecnologias: a exibição do fago, repórter dobrável e sequenciamento de próxima geração com uma ferramenta web para análise de dados.

Interactome-Seq: Um protocolo para a construção da biblioteca de Domainome, a validação e a seleção por Phage Display e a próxima geração de sequenciamento

Este protocolo descreve um procedimento detalhado para a construção de uma biblioteca de anticorpo sintético do fago-exibido com diversidade sob medida. Anticorpos sintéticos têm aplicações amplas de pesquisa básica para o diagnóstico da doença e terapêutica.

Construção do fago sintética exibida Fab biblioteca com diversidade sob medida

Criar sistemas quimicamente induzidos da dimerização da proteína com afinidade e especificidade desejadas para toda a ligand pequena da molécula dada teria muitas aplicações biológicas da detecção e do atuação. Aqui, descrevemos um método eficiente e generalizável para a engenharia de novo de sistemas de dimerização quimicamente induzidos através da seleção manada de uma biblioteca de anticorpos combinatorial de domínio combinatório exibida por fago.

Criando sistemas de dimerização de proteínas quimicamente induzidas altamente específicos pela seleção de fagos de uma biblioteca de anticorpos de domínio único combinatorial

Este estudo teve como objetivo apresentar uma estratégia para identificar interações medicamentosa-peptídeos. A estratégia envolve o biopanning de peptídeos curtos que reconhecem drogas com base em um biosensor de microequilísã de quartzo-cristal (QCM), seguido de análise bioinformática para avaliação quantitativa das informações obtidas para o reconhecimento de medicamentos e anotação dos locais de ligação medicamentosa em proteínas.

Estratégia de análise de biopanning e bioinformática baseada em biosensor para a validação global de interações medicamentosas-proteínas

A ubiquização é uma modificação pós-translacional de proteínas críticas, que tem sido implicada em inúmeras doenças humanas. Este protocolo detalha como o display phage pode ser utilizado para isolar novas variantes de ubiquitina que podem ligar e modular a atividade de ligaduras E3 que controlam a especificidade, eficiência e padrões de ubiquização.

Usando o Phage Display para desenvolver moduladores variantes de Ubiquitin para Ligases E3

Este protocolo descreve as etapas essenciais para a realização de campanhas de seleção de exibição de superfície de levedura para enriquecer as variantes de proteína que se ligam a um antígeno de interesse.

Engenharia de proteínas por exibição de superfície de levedura

Este método descreve o uso de sistema de imagem de Infravermelhos corante baseada em para a detecção de A H1N1 no bronchioalveolar o lavado de fluido (BAL) de camundongos infectados em uma alta sensibilidade. Esta metodologia pode ser realizado em um 96 - ou 384-bem prato, requer &lt;volume de 10 uL de material de teste e tem o potencial para a triagem concomitante de agentes patogénicos múltiplos.

Alta capacidade método de detecção de vírus Influenza

Dois métodos distintos para as fábricas de tela com nematóides de galha-são descritos. As abordagens descritas incluem alto rendimento telas com nemátodos de uma maneira não destrutiva para facilitar a utilização destas plantas em programas de criação.

Alta e Baixa Screens rendimento com galhas-Nematóides Meloidogyne spp.</em

Aprenda a selecionar anticorpos de alta afinidade a partir de bibliotecas de fagos exibidos usando um método escalável de alto rendimento. Esta técnica permite seleções paralelas contra centenas de antígenos simultaneamente.

Selecção de alta Scalable Rendimento de bibliotecas de anticorpos em fagos sintética exibida-

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