Selecção de alta Scalable Rendimento de bibliotecas de anticorpos em fagos sintética exibida-

O objetivo geral deste procedimento escalável é isolar clones de fagos fabulosos específicos e de alta afinidade de uma biblioteca exibida de fagos usando uma abordagem de alto rendimento que permite a seleção paralela contra centenas de domínios-alvo antigênicos. Isso é feito pela primeira imobilização de domínios antigênicos purificados em placas de micropoços. Os próximos passos são expor, capturar, liberar e amplificar clones de fagos fab que se ligam especificamente ao antígeno imobilizado em microplacas em rodadas sucessivas de seleção.

Durante esse processo, a eficácia da seleção é monitorada usando métodos agrupados em cada etapa. A etapa final é avaliar a especificidade, afinidade e/ou atividade dos clones fab isolados. Em última análise, fragmentos específicos de fab de alta afinidade contra um grande número de antígenos são isolados em paralelo, permitindo a geração de anticorpos úteis na análise de classes inteiras de proteínas estrutural ou funcionalmente relacionadas.

A importância desse método reside no fato de oferecer uma alternativa que pode ajudar a superar as limitações e acelerar o ritmo das tecnologias convencionais de desenvolvimento de anticorpos em um laboratório acadêmico ou industrial. A principal vantagem dessa técnica sobre as técnicas convencionais de desenvolvimento de anticorpos, como o hibridoma, inclui que ela não requer o uso de animais. Pode ser usado para praticamente qualquer proteína, incluindo proteínas tóxicas e não imunogênicas.

Como veremos, ele é facilmente paralelizado e, em última análise, produz DNA recombinante renovável que codifica um anticorpo de alta afinidade específico para um antígeno específico e imunoensaios funcionais e padrão em apenas seis a oito semanas. Dada a importância dos anticorpos na pesquisa em biomedicina, vimos uma oportunidade de adaptar e dimensionar a geração de antígenos e a seleção e identificação de anticorpos para uma abordagem de alto rendimento, mantendo a acessibilidade a laboratórios que variam em tamanho e recursos disponíveis. Na manhã do dia da seleção do fago, escolha uma única colônia de células T e coli resistentes a fagos.

Adicione-o a um mililitro de dois meios yt com tetraciclina a 50 microgramas por mililitro. Deixe a colônia incubar tremendo a 200 RPM em um agitador orbital de 2,5 centímetros. Uma vez que o crescimento da cultura seja visualmente evidente, transfira as células para o volume necessário de meio suplementado com tetraciclina.

É preciso haver o suficiente para 100 microlitros por poço de seleção, ou aproximadamente 10 mililitros por 96. A placa de poço expande alíquotas da cultura para penicilina de carbono e meios suplementados com canina. Essas culturas protegem contra a pré-infecção nas células a serem usadas para amplificação.

Quando a absorbância óptica da cultura chega a 0,4 a 0,8 a 595 nanômetros. Após cinco a sete horas, as células estão prontas para serem aplicadas às placas de antígeno. Para que este protocolo assegure a cobertura desejada da biblioteca, prepare placas de antígenos replicados suficientes e placas de proteínas de controle não específicas.

Usando os detalhes de cálculo exibidos são fornecidos no protocolo de texto. Após a imobilização noturna das proteínas-alvo e de controle inespecífico, remova a solução proteica da placa. Adicione 200 microlitros de tampão de bloqueio e bloqueie por uma hora agitando e lave a placa quatro vezes antes de adicionar a biblioteca de fagos enquanto as células estão crescendo.

No dia da seleção do fago, pré-limpamos o fago de ligação inespecífico ou específico da etiqueta exibiu clones FAB da biblioteca, transferindo 100 microlitros da biblioteca de fagos para as placas de seleção negativa para seleção negativa adicionada. Remova o fago de ligação de tags adicionando um excesso de tag de afinidade solúvel. Para fazer isso, adicione uma concentração final de 10 micromolares de GST solúvel a cada um.

Bem, então incube as placas por uma a duas horas em uma coqueteleira em temperatura ambiente. Para preparar a placa de proteína alvo aspirar a solução de proteína da placa, adicione 200 microlitros de tampão de bloqueio e bloqueie por uma hora agitando e lave quatro vezes antes de adicionar a biblioteca de fagos. Após a incubação, colete o snat do fago das placas.

Usando um manipulador de líquido de 96 canais, transfira o fago supinato para placas revestidas de antígeno. Em seguida, incube as placas por uma a duas horas em uma coqueteleira em temperatura ambiente. Após a incubação, remova o fago não ligado lavando os poços de oito a 15 vezes usando tampão PT.

Isso pode ser feito manualmente ou com uma lavadora automática de placas. Então, pouco antes de adicionar as células, remova todo o excesso de tampão de lavagem quando as células e as placas de antígeno estiverem prontas. Eluir o fago adicionando 100 microlitros de células em crescimento a cada poço e deixar as placas incubarem a 37 graus Celsius por meia hora.

Não se espera que as primeiras rodadas de seleção produzam um enriquecimento significativo, mas a quantificação dos títulos de fagos de saída pode garantir a ilusão das concentrações mínimas de fagos necessárias para seleções bem-sucedidas. Para fazer isso, uma alíquota de células pode ser removida antes da adição do fago auxiliar, a fim de aumentar a saída do fago, preparando e plaqueando diluições em série das células em placas de ágar suplementadas com antibióticos. Depois de incubar por meia hora, adicione M 13 K oh sete fagos auxiliares a cada poço para uma concentração de 10 bilhões de unidades formadoras de colônias por mililitro.

Deixe as placas incubarem mais 45 minutos, desta vez agitando a 200 RPMs. Em seguida, transfira as células para um bloco de poço de 96 poços de profundidade com um fundo em V contendo 1,2 mililitros de dois meios YT suplementados por poço. Deixe as placas de poços profundos incubarem a 37 graus Celsius durante a noite com agitação a 200 RPMs no dia seguinte.

Pulverize as bactérias girando as placas a 4.000 GS por 15 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, de cada placa replicada, transfira volumes iguais de sobrenadante contendo o fago para um minitubo. Caixa azul de microplaca de 96 poços para ser usada como entrada para rodadas subsequentes de seleção para o fago agrupado, adicione um 10º volume de 10 XPBT e misture para neutralizar.

Agora, repita o processo de seleção da biblioteca. Pré-depuração e incubação de fagos de antígenos três a quatro vezes usando fagos amplificados da rodada anterior de seleção. Faça isso até que o enriquecimento de ligação ao alvo seja observado em comparação com a ligação de proteínas de controle não específicas por Eliza Micro placas de poços codificadas com dois microgramas por mililitro de antígeno ou proteína de controle, conforme descrito anteriormente na pré-liberação da biblioteca e incubação de fagos de antígenos, são então bloqueadas e lavadas como antes para bloquear e lavar placas revestidas de antígenos e proteínas de controle, aplique 100 microlitros de fago diluído nos poços e deixe as placas incubarem com agitação para 15 minutos à temperatura ambiente Após a incubação, lave as placas oito vezes com tampão PT.

Em seguida, após as lavagens, adicione 100 microlitros de anticorpo anti M 13 HRP a uma a 5.000 luções em PBT para cada poço incubar por meia hora para permitir a ligação do anticorpo ao fago ligado ao antígeno. Em seguida, lave as placas com tampão PT seis vezes e mais duas vezes com PBS direto, prepare, misture e aplique 100 microlitros de substrato TMB de um a um em cada um dos poços. Deixe isso reagir por cinco a 15 minutos, interrompendo as reações quando houver uma mudança significativa de cor.

Pare as reações adicionando 100 microlitros de ácido fosfórico molar. Agora leia a absorbância nos poços a 450 nanômetros e compare os sinais de ligação do alvo com os sinais de ligação das proteínas de controle Após o enriquecimento. Clones individuais podem ser isolados e caracterizados por fago sequencial, conversão de DNA de fago ligado a fab livre e avaliação da ligação direta ao alvo usando FabuLisa clonal, conforme explicado na parte de texto do protocolo.

Para laboratórios nos quais é necessário maior rendimento, essa metodologia pode ser dimensionada e automatizada. Com esse objetivo em mente, foram desenvolvidas robóticas personalizadas que podem expandir a capacidade de seleção automatizando todos os aspectos do procedimento, incluindo bloqueio, fago, ligação e eluciano e muito mais. Uma abordagem para obter antígeno para uso em seleções de anticorpos é o uso de tecnologias de genes sintéticos para obter construções para expressão de domínios proteicos isolados.

Na maioria dos casos, isso permite a expressão de alto rendimento e o isolamento de quantidades adequadas de antígeno purificado suficientemente puro para seleção. Durante as rodadas sucessivas do processo de seleção, as concentrações de fagos iludidas e o enriquecimento do fago que se ligou especificamente ao antígeno foram monitorados por titulação de fagos como mostrado anteriormente ou monitorados com pools de fagos. Em um ensaio ELA, uma taxa de ligação maior que dois geralmente indica a presença de clones de ligação específicos.

Por outro lado, uma proporção mais baixa pode ajudar a determinar a causa de uma falha na seleção. A caracterização da ligação do clone usando um ensaio aminométrico colormétrico permite a comparação da ligação do fago fab ou fab ao antígeno imobilizado em comparação com a proteína de controle negativo de ligação, produzindo assim uma medida de especificidade ao dimensionar e automatizar seleções com unidades robóticas de manuseio de líquidos. O uso de cromóforos absorventes pode ajudar a detectar quando canais específicos nos fluidos estão entupidos ou perderam sua vedação, resultando em entrega parcial de volume, e auxiliar na solução de problemas durante a otimização dos procedimentos de lavagem, o uso de clones de ligação conhecidos garante que a ligação do alvo seja mantida enquanto a ligação de fundo é removida durante as lavagens.

Além disso, protocolos de descontaminação eficazes garantem a ausência de contaminação cruzada de rodadas sucessivas de seleção ou diferentes procedimentos de seleção e são recomendados parâmetros adicionais de solução de problemas são revisados no protocolo de texto. Ao dimensionar esta técnica para aplicação industrial, esperamos permitir que os pesquisadores explorem classes inteiras de proteínas estrutural ou funcionalmente relacionadas, acelerando a seleção e identificação de anticorpos renováveis de alta afinidade com o objetivo final de alcançar a cobertura máxima do proteoma.