Transgênicos Rodent Ensaio para Quantificação celular germinativas masculinas Mutant Frequency

O objetivo geral deste procedimento é medir a frequência de mutações induzidas em um gene repórter recuperado das células germinativas de camundongos transgênicos machos após a exposição a um mutagênico químico ou físico. Isso é feito expondo primeiro camundongos machos a um mutagênico de células germinativas suspeito. O segundo passo é coletar as células germinativas depois que elas progrediram pelos estágios desejados da espermatogênese.

Em seguida, o DNA contendo o transgene que relata a mutação é recuperado das células germinativas. A etapa final é empacotar os genes repórteres recuperados em partículas de fago lambda. Em última análise, um ensaio de seleção positiva in vitro é usado para medir a proporção de genes repórteres recuperados das células germinativas que foram mutadas.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como o teste do locus específico ou o teste do dominó little, é que as mutações são medidas diretamente nas células germinativas, em vez de pontuar a prole mutante. Um grande número de células germinativas pode ser investigado a partir de um único macho, melhorando a sensibilidade do ensaio em relação aos métodos tradicionais, ao mesmo tempo em que reduz drasticamente o número de recursos e tempo dos animais. Este método pode abordar questões-chave no campo da toxicologia genética e mutagênese, como a identificação de agentes mutagênicos para células germinativas e a elucidação de seus modos de ação.

Embora descrevamos o método para o modelo de camundongo Muta, ele pode ser facilmente aplicado a outros sistemas de roedores transgênicos que carregam vetores de relatório de mutação de fagos de bactérias. Além disso, embora o método descreva o processo para células germinativas masculinas, ele tem aplicabilidade geral a tecidos somáticos e, mais importante, é coberto por uma diretriz de teste harmonizada internacionalmente publicada pela OCDE. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades com o tempo da parte in vitro do ensaio porque várias das etapas têm longos períodos de espera.

As etapas devem ser cuidadosamente planejadas e coordenadas para concluir esse método em tempo hábil. Demonstrando o procedimento estará John Gingrich e Linda Soper biólogo em meu laboratório Antes de iniciar o experimento. Três variáveis experimentais críticas devem ser selecionadas, o tempo de administração, o tempo de amostragem e a população de células germinativas coletadas.

Essas variáveis podem ser ajustadas para interrogar os efeitos da exposição em vários tipos de células germinativas e em diferentes fases da espermatogênese. Para iniciar este procedimento, distribua aleatoriamente camundongos machos transgênicos de oito a 12 semanas de idade em um grupo de controle e grupos de tratamento com um mínimo de cinco por grupo. Em seguida, trate os camundongos com um composto de teste e um controle relevante por meio de uma via de exposição apropriada para o tempo de administração selecionado.

Em seguida, escolha o tempo de amostragem apropriado de acordo com o tipo de célula metagênica do esperma de interesse. Então, após o tempo de amostragem, eutanasiar os camundongos por luxação cervical sob anestesia com flúor. Para remover os testículos, faça uma incisão no abdômen, localize a almofada de gordura epidérmica.

Puxe cuidadosamente a almofada de gordura para retirar os testículos e o epidídimo do escroto. Em seguida, retire o epidídimo da cota. Congele o epidídimo Cota em nitrogênio líquido e armazene a 80 graus Celsius negativos para uso posterior.

Quando estiver pronto para processar o esperma de Cota, descongele o epidídimo de Cota no gelo e transfira a cota descongelada para uma placa de Petri. Em seguida, use um bisturi ou lâmina de barbear para picar completamente a coda Epidídimo pipeta 700 microlitros de DPBS em temperatura ambiente na placa de Petri. Em seguida, use uma ponta de pipeta de 1000 microlitros de diâmetro largo para liberar o esperma da coda desenhando e liberando a suspensão aproximadamente 10 vezes ou até que o DPBS fique turvo com esperma, filtre a suspensão de esperma através de um filtro de malha de aço inoxidável em um tubo fresco de 1,5 mililitro e, em seguida, centrifugue o tubo a 11, 000 vezes G por três minutos.

Decantar cuidadosamente o sobrenadante para fora do tubo sem perturbar o sedimento. Em seguida, adicione um mililitro de frio, um citrato de sódio salino e vortex o tubo até que o pellet esteja completamente ressuspenso. Em seguida, adicione 15 microlitros de 10% SDS ao tubo e agite vigorosamente o tubo por 30 segundos para romper as células não espermatozóides.

Em seguida, centrifugue o tubo a 11 000 vezes G durante dois minutos. Após a centrifugação, decantar cuidadosamente o sobrenadante para fora do tubo e adicionar 940 microlitros de citrato de sódio salino frio 0,2 x e vortex o tubo novamente até que o pellet seja ressuspenso. Adicione 120 microlitros Um beta mer capto etanol 100 microlitros de 10% SDS 20 microlitros de 0,5 molar EDTA pH oito e 20 microlitros de 60 miligramas por mililitro.

Proteinase K para o espermatozóide ressuspenso. Misture bem a solução e, em seguida, coloque o tubo em um rotador durante a noite a 37 graus Celsius para digerir após a digestão durante a noite. Extraia o DNA do esperma da coda seguindo as etapas descritas no protocolo de texto para realizar uma extração de fenol clorofórmio após a extração.

Dissolva o precipitado de DNA em 40 a 100 microlitros de tampão tris EDTA PH oito e armazene a quatro graus Celsius. Aguarde vários dias para que o DNA se dissolva completamente antes de prosseguir para a próxima etapa do dia. Antes de realizar o ensaio de mutação LAX Z, prepare e autoclave uma quantidade suficiente de sem-fim inferior para o número de amostras que estão sendo processadas.

Em seguida, assepticamente, despeje a broca em placas de Petri de 90 milímetros e deixe a broca solidificar em um tubo de 50 mililitros. Adicione 10 mililitros de caldo LB, 100 microlitros de solução de maltose a 20%, 25 microlitros de 20 miligramas por mililitro de ampicilina e 20 microlitros de cinco miligramas por mililitro. A micina pode então inocular o tubo com LAX Z negativo GAL e e e coli negativo e crescer durante a noite a 37 graus Celsius enquanto agita a 240 RPM no primeiro dia do ensaio subcultiva as células preparando uma diluição de um a 100 da cultura noturna em LB fresco sem antibióticos.

Incube a cultura a 37 graus Celsius com agitação a 240 RPM por cerca de três horas ou até que o OD 600 seja igual a um. Quando o OD 600 atingir um, divida a suspensão da célula uniformemente em tubos de 50 mililitros e centrifugue a 1.300 vezes G a 15 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda as células na metade do volume original de LB contendo 10 milimolares de sulfato de magnésio.

Coloque as células de lado enquanto os outros reagentes são preparados. Empacote o DNA em partículas de fago Lambda por pipetagem primeiro. Quatro microlitros do DNA extraído do esperma da coda usando uma pipeta de calibre largo em um tubo de 1,5 mililitro.

Descongele o primeiro tubo de um kit de extrato de embalagem de fago em temperatura ambiente e, em seguida, pipete 4,8 microlitros do extrato de embalagem no tubo que contém o DNA. Em seguida, agite suavemente a solução com a ponta da pipeta e, em seguida, incube o tubo em banho-maria a 30 graus Celsius por 1,5 horas. Em seguida, descongele o segundo tubo de extrato da embalagem e, novamente, pipete 4,8 microlitros no tubo que contém o DNA.

Agite suavemente a solução com a ponta da pipeta e, em seguida, incube o tubo em banho-maria a 30 graus Celsius por 1,5 horas. Ressuspenda as partículas de fago embaladas em 500 microlitros de tampão de magnésio salino e coloque os tubos em um rotador por 30 minutos a 20 RPM. Após a rotação, vórtice breve as amostras e centrifugue a 11 000 vezes G durante 30 segundos para recolher as amostras no fundo do tubo.

As partículas de fago agora estão prontas para infecção. Em seguida, prepare oito mililitros de broca superior para cada titulação e placa mutante. Mantenha as brocas superiores a 50 graus Celsius antes de adicionar sulfato de magnésio a 10 milimolares e adicione três gramas por litro do agente seletivo PGAL à seleção de mutantes.

Sem-fim superior apenas antes da infecção das células. Rotular dois tubos de 50 mililitros por amostra, rotular um mutante e um título. Em seguida, rotule oito placas helicoidais por amostra, quatro mutantes e quatro titulantes.

Em seguida, pipete dois mililitros de células ressuspensas em cada tubo de 50 mililitros. Adicione 500 microlitros de partículas de fago embaladas em um tubo de 50 mililitros rotulado como mutante. Misture suavemente o tubo e deixe as partículas de fago infectarem as células por 30 minutos em temperatura ambiente.

Após a incubação de 30 minutos, faça um vórtice breve das células infectadas e, em seguida, transfira 15 microlitros das células infectadas para o tubo de titulação de 50 mililitros correspondente. Adicione 30 mililitros de sem-fim superior de titulação de 50 graus Celsius ao tubo de titulação de 50 mililitros. Distribua imediatamente a mistura de sem-fim e célula entre as quatro placas de titulação.

Certifique-se de que três gramas por litro P gal foram adicionados ao sem-fim de seleção de mutantes de 50 graus Celsius. Em seguida, adicione 30 mililitros do sem-fim de seleção mutante contendo PGAL ao tubo mutante de 50 mililitros. Em seguida, distribua imediatamente a quantidade de mistura de trado e célula para as quatro placas mutantes.

Deixe as placas solidificarem e, em seguida, inverta as placas e incube a 37 graus Celsius durante a noite. Após a incubação durante a noite, conte o número de placas nas placas mutantes e tituladas. Em seguida, estime a frequência mutante dividindo o número total de placas mutantes contadas, contadas nas quatro placas mutantes pelo número total estimado de unidades formadoras de placas no volume total de células infectadas determinado a partir das placas de título.

Um ensaio típico de mutação de células germinativas de roedores transgênicos resulta em muito poucas placas nas placas de trado mutantes, especialmente nos grupos de dose de controle. Por outro lado, centenas de placas são detectadas nas placas de titulação. A exposição de machos de camundongos vira-latas a uma dose oral aguda única de 0, 25, 50 e 100 miligramas por quilograma de ENU, seguida de um tempo de amostragem de 70 dias, permitiu a medição dos eventos mutacionais em células-tronco de espermatogônias.

A baixa dose de ENU induziu um aumento de 2,6 vezes na frequência de mutantes acima dos controles, e a dose máxima provocou um aumento de 4,4 vezes. Ao projetar experimentos que usam esse procedimento, é importante sempre levar em consideração o momento em que ele é reproduzido. O ciclo metagênico do esperma, o tempo de administração, o tempo de amostragem e o tipo de célula coletada devem ser cuidadosamente selecionados para observar os efeitos originados do tipo de célula metagênica do esperma desejado.

Após este procedimento, o sequenciamento de DNA pode ser realizado nas placas mutantes para caracterizar as mutações e identificar mutantes que podem ser derivados de eventos de expansão clonal. Essa técnica abre caminho para pesquisadores no campo da toxicologia genética identificarem mutagênicos que possam atingir a linha germinativa. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como determinar a frequência mutante induzida nas células germinativas ou camundongos machos transgênicos expostos a um mutagênico.

Este ensaio tem aplicações potenciais em testes regulatórios para mutagênicos de células gemas e em investigações mecanicistas mais direcionadas.