Transgênicos Rodent Ensaio para Quantificação celular germinativas masculinas Mutant Frequency

O objetivo geral deste procedimento é medir a frequência de mutações induzidas em um gene repórter recuperado de células germinativas de camundongos machos transgênicos após exposição a um agente mutagênico químico ou físico. Isso é realizado primeiramente expondo camundongos machos a um agente mutagênico suspeito em células germinativas. O segundo passo é coletar as células germinativas após elas terem progredido pelas fases desejadas da espermatogênese.

Em seguida, o DNA contendo o transgênio repórter de mutação é recuperado das células germinativas. O passo final consiste em empacotar os genes repórter recuperados em partículas de fago lambda. Por fim, um ensaio de seleção positiva in vitro é utilizado para medir a proporção de genes repórter recuperados das células germinativas que sofreram mutação.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o teste de locus específico ou o teste dominó, é que as mutações são medidas diretamente em células germinativas, ao contrário da contagem de descendentes mutantes. Um grande número de células germinativas pode ser analisado a partir de um único macho, o que melhora a sensibilidade do ensaio em comparação com os métodos tradicionais, ao mesmo tempo em que reduz drasticamente o número de animais, recursos e tempo necessários. Este método pode abordar questões fundamentais na área da toxicologia genética e mutagênese, como a identificação de agentes mutagênicos para células germinativas e a elucidação de seus modos de ação.

Embora descrevamos o método para o modelo de camundongo Muta, ele pode ser facilmente aplicado a outros sistemas de roedores transgênicos que carregam vetores de relatores de mutação de fagos bacterianos. Além disso, embora o método descreva o processo para células germinativas masculinas, ele possui aplicabilidade geral a tecidos somáticos, e, importante, é abrangido por uma diretriz de teste internacionalmente harmonizada publicada pela OCDE. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades com o cronograma da parte in vitro do ensaio, pois vários dos passos possuem longos períodos de espera.

Os passos devem ser cuidadosamente planejados e coordenados para concluir este método de forma oportuna. Demonstrará o procedimento John Gingrich e Linda Soper, biólogos em meu laboratório, antes de iniciar o experimento. Três variáveis experimentais críticas devem ser selecionadas: o tempo de administração, o tempo de amostragem e a população de células germinativas coletada.

Essas variáveis podem ser ajustadas para investigar os efeitos da exposição em diversos tipos de células germinativas e em diferentes fases da espermatogênese. Para iniciar este procedimento, distribua aleatoriamente camundongos machos transgênicos com idade entre oito e doze semanas em um grupo controle e grupos de tratamento, com no mínimo cinco animais por grupo. Em seguida, trate os camundongos com um composto em teste e um controle relevante por meio de uma via de exposição apropriada durante o tempo de administração selecionado.

Em seguida, escolha o tempo de coleta apropriado de acordo com o tipo celular metagênico de espermatozoide de interesse. Após o tempo de coleta, eutanazie os camundongos por dislocação cervical sob anestesia com isoflurano. Para remover os testículos, faça uma incisão no abdômen e localize o tecido adiposo epididimal.

Puxe cuidadosamente a bolsa de gordura para retirar os testículos e o epidídimo do escroto. Em seguida, excise a túnica epididimal. Congele a túnica epididimal em nitrogênio líquido e armazene a menos 80 graus Celsius para uso posterior.

Quando estiver pronto para processar o esperma de Cota, descongele o epidídimo de Cota em gelo e, em seguida, transfira o cota descongelado para uma placa de Petri. A seguir, use um bisturi ou lâmina de barbear para picar completamente o epidídimo caudal; pipete 700 microlitros de DPBS à temperatura ambiente para dentro da placa de Petri. Em seguida, use uma ponteira de pipeta larga de 1000 microlitros para liberar os espermatozoides do epidídimo, aspirando e dispensando a suspensão aproximadamente 10 vezes ou até que o DPBS fique turvo com espermatozoides, filtre a suspensão de espermatozoides através de um filtro de malha de aço inoxidável para um tubo novo de 1,5 mililitro e, então, centrifugue o tubo a 11.000 × g por três minutos.

Decante cuidadosamente o sobrenadante para fora do tubo sem perturbar o precipitado. Em seguida, adicione um mililitro de citrato de sódio salino a 1x frio e vortexe o tubo até que o precipitado seja completamente ressuspenso. A seguir, adicione 15 microlitros de SDS a 10% ao tubo e agite vigorosamente o tubo por 30 segundos para romper as células não espermáticas.

Em seguida, centrifugue o tubo a 11.000 × g durante dois minutos. Após a centrifugação, decante cuidadosamente o sobrenadante do tubo e adicione 940 microlitros de citrato de sódio salino frio 0,2 x, e vortexe o tubo novamente até que o precipitado seja ressuspenso. Adicione 120 microlitros de beta-mercaptoetanol, 100 microlitros de SDS 10%, 20 microlitros de EDTA 0,5 molar pH 8 e 20 microlitros de 60 miligramas por mililitro.

Protease K ao esperma ressuspenso. Misture bem a solução e, em seguida, coloque o tubo em um rotador durante a noite a 37 graus Celsius para digestão. Após a digestão noturna, extraia o DNA do esperma seguindo as etapas descritas no protocolo textual para realizar uma extração com fenol-clorofórmio. Após a extração, prossiga conforme indicado.

Dissolva o precipitado de DNA em 40 a 100 microlitros de tampão tris EDTA pH oito e armazene a quatro graus Celsius. Aguarde vários dias para que o DNA se dissolva completamente antes de prosseguir para a próxima etapa no dia. Antes de realizar o ensaio de mutação LAX Z, prepare e autoclave uma quantidade suficiente de ágar inferior ao número de amostras que serão processadas.

Em seguida, de forma asséptica, despeje o ágar em placas de Petri de 90 milímetros e deixe o ágar solidificar em um tubo de 50 mililitros. Adicione 10 mililitros de caldo LB, 100 microlitros de solução de maltose a 20%, 25 microlitros de ampicilina a 20 miligramas por mililitro e 20 microlitros de canamicina a cinco miligramas por mililitro. Em seguida, inocular o tubo com E. coli LAX Z negativo GAL e negativo, e cultivar durante a noite a 37 graus Celsius sob agitação a 240 RPM. No primeiro dia do ensaio, subcultivar as células preparando uma diluição de 1 para 100 da cultura de overnight em LB fresco sem antibióticos.

Incube a cultura a 37 graus Celsius com agitação a 240 RPM por cerca de três horas ou até que a DO 600 atinja um. Quando a DO 600 atingir um, divida a suspensão celular igualmente em tubos de 50 mililitros e centrifugue a 1.300 ×g a 15 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda as células em metade do volume original de LB contendo sulfato de magnésio 10 milimolar.

Deixe as células de lado enquanto os outros reagentes são preparados. Embale o DNA em partículas de fago Lambda primeiramente pipetando. Quatro microlitros do DNA extraído do esperma de coda usando uma pipeta de orifício largo em um tubo de 1,5 mililitro.

Descongele o primeiro tubo de um kit de extrato de embalagem de fagos à temperatura ambiente e, em seguida, pipete 4,8 microlitros do extrato de embalagem para o tubo contendo o DNA. Em seguida, agite suavemente a solução com a ponta da pipeta e incube o tubo em banho-maria a 30 graus Celsius por 1,5 hora. Depois, descongele o segundo tubo de extrato de embalagem e, novamente, pipete 4,8 microlitros para o tubo contendo o DNA.

Agite suavemente a solução com a ponta da pipeta e, em seguida, incube o tubo em banho-maria a 30 graus Celsius por 1,5 hora. Re-suspenda as partículas de fago embaladas em 500 microlitros de tampão salino com magnésio e coloque os tubos em um agitador rotativo por 30 minutos a 20 RPM. Após a rotação, vorteie brevemente as amostras e, em seguida, centrifugue a 11.000 vezes G por 30 segundos para recolher as amostras no fundo do tubo.

As partículas de fago estão agora prontas para infecção. Em seguida, prepare oito mililitros de ágar superior para cada placa de titulação e cada placa mutante. Mantenha os ágares superiores a 50 graus Celsius antes de adicionar sulfato de magnésio até 10 milimolar e adicione três gramas por litro do agente seletivo PGAL para a seleção de mutantes.

Use somente o agitador rotativo antes da infecção das células. Rotule dois tubos de 50 mililitros por amostra, um como mutante e outro como título. Em seguida, rotule oito placas de agitação por amostra, quatro como mutante e quatro como título.

Em seguida, pipete dois mililitros de células ressuspendidas em cada tubo de 50 mililitros. Adicione 500 microlitros de partículas de fago embaladas em um tubo de 50 mililitros rotulado como mutante. Misture suavemente o tubo e deixe as partículas de fago infectarem as células por 30 minutos à temperatura ambiente.

Após a incubação de 30 minutos, vortexe brevemente as células infectadas e, em seguida, transfira 15 microlitros das células infectadas para o tubo de titulação de 50 mililitros correspondente. Adicione 30 mililitros de ágar superior de titulação a 50 graus Celsius ao tubo de titulação de 50 mililitros. Distribua imediatamente a mistura de ágar e células entre as quatro placas de titulação.

Certifique-se de que três gramas por litro de P gal foram adicionadas ao auger de seleção de mutantes a 50 graus Celsius. Em seguida, adicione 30 mililitros do auger de seleção de mutantes contendo PGAL ao tubo mutante de 50 mililitros. Então, distribua imediatamente a mistura de auger e células entre as quatro placas de mutantes.

Deixe as placas solidificarem e, em seguida, inverta-as e incube a 37 graus Celsius durante a noite. Após a incubação noturna, conte o número de placas nas placas de mutante e de titulação. Em seguida, estime a frequência de mutantes dividindo o número total de placas de mutantes contadas, obtido nas quatro placas de mutantes, pelo número estimado total de unidades formadoras de placas no volume total de células infectadas, determinado a partir das placas de titulação.

Um ensaio típico de mutação em células germinativas de roedores transgênicos resulta em pouquíssimas placas nas placas de mutante auger, especialmente nos grupos-controle de dose. Por outro lado, centenas de placas são detectadas nas placas de titulação. A exposição de machos de camundongos mutt a uma única dose oral aguda de 0,25, 50 e 100 miligramas por quilograma de ENU, seguida por um período de amostragem de 70 dias, permitiu a mensuração dos eventos mutacionais em células-tronco espermatogoniais.

A dose baixa de ENU induziu um aumento de 2,6 vezes na frequência de mutantes em relação aos controles, e a dose máxima provocou um aumento de 4,4 vezes. Ao planejar experimentos que utilizam este procedimento, é importante sempre levar em consideração o cronograma. O ciclo metagênico espermático, o momento da administração, o momento da coleta e o tipo de célula coletado devem ser cuidadosamente selecionados para observar efeitos provenientes do tipo celular metagênico espermático desejado.

Após este procedimento, o sequenciamento de DNA pode ser realizado nos pláques mutantes para caracterizar as mutações e identificar mutantes que possam ter se originado a partir de eventos de expansão clonal. Esta técnica abre caminho para pesquisadores na área de toxicologia genética identificarem mutágenos que possam atingir a linhagem germinativa. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como determinar a frequência mutante induzida em células germinativas ou em camundongos machos transgênicos expostos a um mutágeno.

Este ensaio possui aplicações potenciais em testes regulatórios para mutagênicos de células germinativas, bem como em investigações mecanicistas mais direcionadas.