A purificação cromatográfica do não-polipéptidos recombinantes Elastina semelhantes e suas fusões com Peptídeos e Proteínas de Escherichia coli

O objetivo geral deste procedimento é purificar polipeptídeos semelhantes a elastina recombinante de e coli por ciclo de transição inversa. Isso é feito primeiro coletando o lisado de células de e coli que expressaram elastina recombinante como polipeptídeo e removendo detritos celulares insolúveis por centrifugação. O segundo passo é remover contaminantes solúveis induzindo a transição polipeptídica semelhante à elastina com a adição de sal ou calor.

Em seguida, coletando a elastina como polipeptídeo coate por centrifugação e descartando o sobrenadante. Esta etapa é chamada de giro quente. Em seguida, a solução polipeptídica semelhante à elastina ressuspensa é centrifugada para remover os contaminantes insolúveis.

O polipeptídeo solúvel semelhante à elastina no sobrenadante é retido e o pellet é descartado. Esta etapa é denominada centrifugação a frio, ciclos repetidos de centrifugações quentes e frias até que a pureza satisfatória do polipeptídeo semelhante à elastina seja alcançada. Em última análise, o ciclo de transição inversa produz produtos polipeptídicos semelhantes à elastina pura que podem ser caracterizados para uso em uma variedade de aplicações biomédicas.

Os polipeptídeos semelhantes à elastina purificados por esta técnica têm várias aplicações úteis, incluindo biossensoriamento, engenharia de tecidos e administração de medicamentos, onde a temperatura de transição e a arquitetura do biopolímero do polipeptídeo semelhante à elastina podem ser ajustadas especificamente para cada aplicação. Para começar, expresse o plasmídeo codificador ELP desejado em e coli usando as condições descritas no protocolo de texto que o acompanha. Depois de agitar uma cultura de um litro em uma incubadora por 24 horas a 37 graus Celsius, transfira a cultura para uma garrafa de centrífuga de um litro e, em seguida, centrifugue a garrafa a 2000 Gs por 15 minutos a quatro graus Celsius.

Em seguida, descarte o sobrenadante e resus. Suspenda o pellet em água PBS ou outro tampão desejado até um volume total de 45 mililitros. Em seguida, transferiu a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mililitros.

Coloque a suspensão da célula no gelo e, uma vez resfriada, sonice por um total de nove minutos em ciclos de 10 segundos ligado e 20 segundos desligado. Com uma potência de saída de 85 watts. Deixe a amostra esfriar no gelo por aproximadamente 10 minutos após a primeira rodada de sonicação e, em seguida, repita o ciclo de sonicação de nove minutos.

Transferir o lisado para um tubo de centrifugação de fundo redondo de 50 ml. Em seguida, adicione dois mililitros de 10% de peso por volume de polietileno para cada litro de cultura e agite o tubo para misturar em seguida, centrifugue o tubo a 16.000 GS por 10 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, transferir o sobrenadante para um tubo de centrifugação de fundo redondo limpo de 50 ml e rejeitar o sedimento.

Adicione cloreto de sódio cristalino à amostra para induzir a transição ELP. Uma vez que o sal tenha se dissolvido, a solução ficará turva, o que indica a separação de fases do ELP da solução. Em seguida, faça a pelota do ELP centrifugando a amostra a 16.000 GS por 10 minutos.

À temperatura ambiente, o pellet ELP pode parecer opaco a princípio, descartar o sobrenadante e, em seguida, adicionar de um a cinco mililitros do tampão desejado após o resfriamento. O pellet ELP pode parecer translúcido e de cor marrom. Resus suspenda o pellet pipetando ou girando o tubo a quatro graus Celsius.

Em seguida, pipete alíquotas de um mililitro da solução ELP ressuspensa em tubos de microcentrífuga limpos de 1,5 mililitro. Centrifugue os tubos a 16.000 GS por 10 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, transfira o sobrenadante para um tubo limpo e descarte os pellets.

Induza a transição ELP com a adição de cloreto de sódio. Se o ELP tiver uma temperatura de transição alta que não possa ser induzida apenas com sal, incube a amostra em um bloco de calor por 15 minutos a uma temperatura acima da temperatura de transição do ELP. Em seguida, centrifugue a amostra a 16.000 GS por 10 minutos a uma temperatura acima da temperatura usada para a etapa de transição do ELP.

Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet ELP em 500 a 750 microlitros do tampão desejado pipetando ou girando o tubo a quatro graus Celsius até que o pellet seja solubilizado novamente. Em seguida, centrifugue a amostra a 16.000 GS por 10 minutos a quatro graus Celsius para pulverizar quaisquer contaminantes insolúveis. Em seguida, transfira o snat para um tubo limpo e descarte o pellet Repita o ciclo de transição inversa até que nenhum pellet contaminante seja observado.

Isso normalmente requer de dois a cinco ciclos. Preparar uma série de diluições de soluções ELP em PBS ou noutro tampão desejado. Em seguida, use um espectrofotômetro UV v com temperatura controlada para medir a densidade óptica a 350 nanômetros em uma faixa de temperaturas enquanto aquece a amostra a uma taxa de um grau Celsius por minuto.

Se não for observado nenhum aumento na densidade óptica, a temperatura de transição pode exceder o limite superior de temperatura. Em seguida, meça a diminuição da densidade óptica na mesma faixa de temperaturas a uma taxa de resfriamento de um grau Celsius por minuto. Para verificar a reversibilidade do gráfico de transição ELP, a densidade óptica versus a temperatura, determine a temperatura de transição do homopolímero ELP.

Ao identificar o ponto de inflexão neste perfil de turbidez, a purificação bem-sucedida de LPs é confirmada pela página SDS, como pode ser visto aqui. O número de contaminantes é muito maior no lisado de E coli inicial em comparação com a amostra após uma rodada de ciclo de transição inversa. A temperatura de transição ELP é caracterizada pela turbidez programada por temperatura para um polímero homo ELP.

O perfil de turbidez exibe um único aumento acentuado na densidade óptica, que define a temperatura de transição em uma determinada concentração. A natureza reversível da transição ELP é confirmada com uma varredura de turbidez de resfriamento. Os copolímeros de bloco de matriz ELP exibem um perfil de turbidez mais complexo do que os LPs de polímero homo.

Medições dinâmicas de espalhamento de luz podem então ser feitas para confirmar o comportamento desses LPs que é inferido do arquivo de perfil de turbidez. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como purificar a elastina recombinante como polipeptídeos de e coli usando o ciclo de transição inversa. Não, não, não, não, não.