High Yield purificação Plasmodium falciparum Merozoítos Para uso em opsonizantes Anticorpo Ensaios

Medindo função anticorpo é fundamental para compreender a imunidade para Plasmodium falciparum da malária. Este método descreve o purificação dos merozoitos viáveis, e medição da fagocitose dependente de opsonização por citometria de fluxo.

O objetivo geral deste procedimento é gerar maites plasmodium falciparum puros em alto rendimento para quantificação de sua opsonização por anticorpos humanos. Isso é feito inibindo primeiro a ruptura de S schon com E 64 para gerar estruturas de maite fechadas por membrana. Na segunda etapa, os maites livres são colhidos e depois corados com brometo de AUM para quantificação na etapa final, os maites são incubados com várias amostras de plasma humano e THP uma célula monocítica humana.

Em última análise, a opsonização dos maites pelas diferentes amostras de plasma humano pode ser diferenciada por citometria de fluxo. As vantagens desta técnica sobre os ensaios existentes de imunidade funcional à malária meite é que mes intactos são usados e as respostas à fagocitose são robustas e quantificáveis. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunologia da malária, como qual é a importância dos anticorpos oxidantes e da fagocitose para a imunidade contra a malária em indivíduos vacinados ou naturalmente expostos?

A visualização desta técnica é crítica, pois o tempo de E 64 é essencial para garantir a formação de mezo. E porque a preparação e enumeração do mezo é tecnicamente exigente Após a separação magnética do estágio tardio do P falciparum, os trofozoítos avaliam a maturação do parasita fixando um esfregaço fino de parasitas em 100% de metanol por 10 segundos e colorindo-os em Gizé por três minutos. Examine a lâmina de coloração ao microscópio para garantir que os parasitas quase preencham os glóbulos vermelhos e pareçam estar no estágio zen inicial.

Se os parasitas não atingirem o estágio de maturação apropriado, continue a incubá-los até que estejam adequadamente desenvolvidos. Uma vez devidamente maduro, trate o schon isolado com 10 micromolares E 64 e incube-os por mais seis a 10 horas. Após a incubação com E 64, preparar um esfregaço dos parasitas tratados.

Fixe a lâmina em 100% de metanol e core-a com Giza para confirmar que pelo menos 50% dos parasitas formaram membrana. Maites fechados pellet o restante E 64 tratado schon por oito minutos a 1900 Gs à temperatura ambiente. Em seguida, lave os parasitas em 50 mililitros de temperatura ambiente.

Lave o meio para remover qualquer soro humano restante. Depois de descartar o sobrenadante, ressuspenda o pellet do parasita em dois mililitros de meio de lavagem e, em seguida, filtre a suspensão celular através de um filtro de seringa de 1,2 micrômetro, coletando os cristais de maites e hemônio em um tubo de 10 mililitros. Em seguida, conecte uma pequena coluna magnética a um ímã e equilibre-a com 500 microlitros de THP uma mídia.

Passar o filtrado sobre a coluna magnética três vezes, recolhendo as matérias do fluxo de cada vez. Em seguida, enxágue a coluna com dois mililitros de temperatura ambiente. THP uma mídia para coletar quaisquer maitas restantes.

A remoção da hemina é uma etapa crítica para purificar os maites. Se os maites não forem separados do hemin, então os aglomerados de maite hemin se formarão, resultando em contagem imprecisa de maite por citometria de fluxo. As células THP um fagocitam hemin, de modo que os aglomerados de hemin meite também podem ser ceto.

Assim, se a hemina não for removida, o potencial opsonizante do plasma que está sendo testado também será superestimado. Manchar as matérias recolhidas em 10 microgramas por mililitro de brometo de amido à temperatura ambiente, protegido da luz. Após 30 minutos, gire as maitas, descarte o sobrenadante em um recipiente de lixo apropriado e lave o pellet de maite em quatro mililitros de maitas de pellet de THP one.

Em seguida, resus suspenda as células em 15 mililitros de TP um meio protegido da luz. Quantificar os maites por citometria de fluxo. Conte maites em uma em 100, uma em 50 e uma em 25 diluições.

Em primeiro lugar, dispense 940, 930 e 910 microlitros de PBS mais BSA em três tubos de fax diferentes e adicione 10, 20 e 40 microlitros de maites purificados a cada tubo, respectivamente. Em seguida, conte os grânulos à temperatura ambiente do vórtice por 30 segundos e, em seguida, adicione 50 microlitros dos grânulos a cada tubo de fax contendo as maitas diluídas. Execute as três amostras de maita diluídas em um citômetro de fluxo equipado com um laser de 488 nanômetros, definindo uma porta rigorosa para as maites com base no brometo de aterio e na porta de fluorescência dupla GFP as esferas em um canal separado e adquira eventos até que 2000 contas tenham sido coletadas.

Para quantificar o número de maites em cada diluição, calculam a média das três medições de concentração de maite. Em seguida, resus suspenda os maites em oito vezes 10 elevado a seis maites por mililitro em THP um meio para garantir uma proporção final de quatro maites por THP uma célula para medir a fagocitose dos maites. Primeiro pellet suficiente THP uma célula para o ensaio e resus suspendê-los em 6,7 vezes 10 elevado à quinta célula por mililitro em THP um meio.

Em seguida, a 150 microlitros de THP, uma célula por poço em triplicata para cada condição a ser testada para uma placa inferior em U de 96 poços bloqueada por FCS para uma concentração final de 10 a quinta células por poço. Coloque o prato na incubadora até a hora de adicionar as maites. Em seguida, adicione 150 microlitros dos maites isolados em oito vezes 10 elevado aos sextos mililitros por concentração de poço em uma placa inferior em U de 96 poços bloqueada FCS separada em um poço por condição a ser testada.

Adicione 10 microlitros de amostras de plasma diluído preparadas a cada poço dos maites misturando bem para garantir uma solução homogênea. Em seguida, adicione 50 microlitros da solução de plasma maite a cada poço do THP uma placa em triplicado para cada amostra de plasma que está sendo testada. Misture bem as amostras e, em seguida, incube as coculturas cobertas em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono.

Após 40 minutos, gire as amostras em uma centrífuga pré-resfriada para interromper a fagocitose. Em seguida, lave as células duas vezes em tampão de fax gelado após a segunda lavagem. Fixe as células em 90 microlitros de fixador de fax e deixe-as no gelo.

Protegido da luz até a aquisição. O estágio de maturação dos parasitas antes do tratamento com E 64 é crítico para gerar maitos fechados por membrana. Os parasitas devem ser grandes, quase encher o glóbulo vermelho e mostrar manchas de gemas.

A adição de E 64 nesta fase produzirá maites fechados em membrana após incubação por seis a 10 horas. Se E 64 for adicionado mais cedo aos parasitas em estágio de trofozoítos, não serão geradas matérias fechadas por membrana. Se E 64 for adicionado posteriormente a schon schon, a ruptura é desinibida.

É necessário um alto nível de sincronia do parasita. Caso contrário, uma variedade de todos os três resultados descritos será observada após a medição da fagocitose do tratamento com E 64 por fluorescência de brometo de aum permitir uma resolução superior da fagocitose do parasita em relação à fluorescência de GFP isoladamente. Aumentar a proporção de maites para células TP um resulta em um aumento da adesão dos maites às células THP one.

Na ausência de anticorpos específicos para maite, o aumento da proporção de uma célula MEITE para THP também resulta em um aumento na fagocitose entre zero e 78% A opsonização dos maites foi observada usando amostras de plasma de Papua Nova Guiné em uma proporção de quatro para um MAITE para THP uma célula. Esses dados mostram exemplos dos quatro quartis de respostas ácidas de PHA de quatro indivíduos representativos de Papua Nova Guiné. Os anticorpos opsonizantes medidos usando este ensaio demonstraram estar associados à imunidade clínica à malária durante a tentativa deste procedimento.

Os pontos-chave a serem lembrados para garantir o sucesso da citose de PE são ter parasitas altamente sincronizados para obter meita totalmente amadurecida e intacta e manter as culturas de células t HB um adequadamente. A técnica de purificação de meite descrita neste procedimento pode ser adaptada a qualquer aplicação que exija malária de alta qualidade, como marizona, invasão, ensaios, proteômica ou sorologia. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar o método E 64 para purificar maites e investigar anticorpos opsonizantes medindo a fagocitose por células THP one.