Name: In vivo Clonal Rastreamento de Stem hematopoiéticas e células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes usando confocal e microscopia multifotônica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-06T16:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 8 s
Description: Aprenda a rastrear clones hematopoiéticos marcados com cinco proteínas fluorescentes em tecidos vivos usando microscopia confocal e multifotônica. Este método permite visualizar a evolução clonal e a arquitetura da medula óssea durante a regeneração.

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Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural do Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue dos Institutos Nacionais de Saúde. Agradecemos a Boris Fehse (University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburgo, Alemanha) por fornecer os cinco plasmídeos vetoriais LeGO; Christian A. Combs e Neal S. Young (NHLBI, NIH) pelas discussões, apoio e incentivo ao longo deste estudo, e Andre LaRochelle (NHLBI, NIH) pela assistência com injeções nas veias da cauda.

Todos os animais foram alojados e tratados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Instituto Nacional de Saúde, e matriculou-se em um protocolo de cuidado e uso NHLBI animal Comitê-aprovado. Feminino B6.SJL-Ptprc (d) pep3 (b) / BoyJ (B6.SJL) e C57BL / 6, machos, 6-12 semanas de idade, foram utilizados como dador e receptor, respectivamente. Uma lista de materiais, reagentes, e o equipamento é fornecido na Tabela 1. 1. Lego Transdução de Rato hspCs e Transplante de Medula Óssea Realizar procedimentos descritos abaixo, em um nível de biossegurança certificada 2 (BSL-2) gabinete (cultura de tecidos Hood). <ol><li> Produção de Lego Vetores Encoding 5fps <ol><li> Use o lentiviral &quot;Gene Ontology&quot; (Lego) plasmídeos vetor, cada codifica uma FP diferente de um promotor forte SFFV constitutiva, incluindo Lego-Cer2 (Cerulean), Lego-G2 (EGFP), Lego-V2 (Vênus), a Lego-T2 (tdTomato), e lego-C2 (mCherry) gentilmente cedido pelo Dr. Boris Fehse (University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburgo, Alemanha); agora também disponível a partir Addgene 5-7. </li><li> Para produzir vetores de Lego, sementes de 5 x 10 6 células 293T em placas de 10 cm (use 12 pratos para cada vector) 24 horas antes da transfecção em 8 ml de mídia I10 (IMDM suplementado com 10% SFB e glutamina / penicilina / estreptomicina). </li><li> Transfecção das células com fosfato de cálcio, utilizando recomendações kit CAPHOS ligeiramente modificados: <ol><li> Para cada placa de mistura de 15 mg vetor Lego, 12 mg pCDNA3.HIVgag / pol.4xCTE, 4 mg PREV-TAT, e 1 mg plasmídeos pMD2.G-VSV-G em presença de 50 mL de 2,5 M CaCl2, e adicione água para obter um volume total de 500 ul. </li><li> Plasmídeos de ADN precipitado com 500 ul de 2x HeBS (HEPES-tamponado salino) e incubar durante 20 min à temperatura ambiente antes de se adicionar a cada placa de células 293T. </li><li> Incubar as células para6 h num 37 ° C 5% de CO 2 incubadora; remover a mídia e adicionar fresco cultura da mídia pós 6 hr transfecção. </li></ol></li><li> Recolher os sobrenadantes da cultura contendo partículas lentivirais de cada placa, por dia, durante 3 dias. Cada coleção sobrenadante dia seguinte adicionar mídia I10 fresco para cada placa. <ol><li> Filtrar através de poros de 0,22 um, piscina e concentrar os sobrenadantes por ultracentrifugação num rotor SW28 durante 2 horas a 71.900 xg e 4 ° C. </li><li> Ressuspender o sobrenadante em 1 ml de meio StemSpan. Alíquota os estoques lentivï¿½icos em 200 mL e armazenar a -80 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Titulação de Lentivirus Determinar o título de partículas vetor Lego em sobrenadantes coletados via quantificação de transdução de unidades / ml, utilizando células NIH3T3. Os títulos de permitir o cálculo do volume de cada sobrenadante vector necessária para resultar na desejada relativamente multiplicidade de infecção (MOI) de alvo experimentalcélulas. <ol><li> Placa de 5 x 10 4 NIH3T3 células por poço (placa de 12 poços) em 2 ml de meio I10 um dia antes da titulação. </li><li> Preparar diluições em série de 5 vezes de sobrenadantes contendo vector em meios I10 suplementadas com sulfato de protamina (4 mg / ml é 1.000x). </li><li> Remova a mídia das células, e substituir por 500 mL de diluições do sobrenadante contendo o equivalente a 2, 0,8, 0,32 e 0,128 l de vírus concentrado. </li><li> Determinar o número (n) de células por poço presentes no momento da transdução, contando também um controlo. </li><li> 6 horas após a transdução, adicionar 2 ml de meio de I10 e incubar durante 3 dias a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Colher as células de cada poço utilizando tripsina-EDTA, e determinar a percentagem de células fluorescentes (FP%) através de citometria de fluxo. </li><li> Calcula-se o título como a seguir, a média dos títulos obtidos para cada poço (diluição), resultando num FP% entre 1 e 50%: (título de partículas de vector / ml) = nx% FP / Volume de sobrenadante vetor (ml). Calcule a média dos títulos obtidos para cada diluição, se o FP% é entre 1 e 50%. </li></ol></li><li> Colecção celular Rato, purificação, transdução, e transplantação (mostrado esquematicamente na Figura 1A adaptado de Malide et al. 4). <ol><li> Sacrifício camundongos doadores por um procedimento aprovado. Colheita de medula óssea de membros anteriores e posteriores: dissecar úmeros, o fémur ea tíbia, completamente remover todos os músculos, ligamentos e excesso de tecido a partir de ossos, corte em todo o final de cada osso mais próximo possível para a articulação, e lave a medula óssea de o osso usando uma agulha G 27-0 em uma seringa contendo mídia I10. </li><li> Agregar as células da medula óssea inteiras durante 10 minutos a 500 xg, a 4 ° C e lisar os glóbulos vermelhos duas vezes com 50 ml de tampão ACK. Suspenda as células em 10 ml de meio I10. </li><li> Purificar (Lin @) células progenitoras linhagem negativa com o kit de exaustão de acordo com a linhagem MACS Protoco um kit modificadol: <ol><li> Utilizar 30 ul de microesferas anti-biotina em vez de 10 mL / 10 7 células; concluir as etapas de lavagem com media I2 (IMDM suplementado com 2% de SFB) em vez de tampão. </li><li> Insira uma etapa de lavagem entre a incubação com Cocktail Biotina-Antibody ea incubação com anti-biotina MicroBeads; e equilibrar a coluna com I10 em vez de tampão. </li></ol></li><li> Cultura de células Lin @ de 48 horas, a uma densidade de partida de 5 x 10 5 células / ml em meio StemSpan suplementado com 10 ng / ml de IL-3 murina, 100 ng / ml de IL-11 de murino, de 100 ng / ml humano Flt-3 ligando, e 50 ng / factor de células estaminais de murino ml. </li><li> Transferência de 1 a 4 x 10 5 células de 12 poços para as placas revestidas com RetroNectin e transdução com sobrenadantes LEGO, cada um com uma multiplicidade de infecção (MOI) de 6-7 para alcançar 50% de eficiência de expressão para cada FP, na presença de StemSpan meios de comunicação e citocinas detalhado acima e 4 ug / ml de sulfato de protamina. </li><li> Transduzir célulascom cada vector LEGO individualmente, conforme descrito no passo 1.3.5 e misturar as células a seguir a transdução (denominado mistura) ou co-transdução de células com todos os sobrenadantes 5 LEGO vector simultaneamente (denominados Co). Remover as células 24 horas depois, lave uma vez com meio StemSpan sem citocinas, e ressuspender-los em mídia StemSpan sem citocinas para o transplante, ou transferi-los para meio fresco com citocinas e cultura durante 96 horas adicionais antes de microscopia confocal e citometria de fluxo. <ol><li> Realizar o transplante de medula óssea através da infusão transduzidas Lin hspCs através de injecção na veia da cauda em 11 Gy em dose única receptores pré-irradiadas (6-18 horas antes do transplante) destinatários, em um volume de 100 mL, a uma dose de células por ratinho correspondendo a 1 células -4 x 10 5 Lin @ banhado originalmente para a transdução. Em cada experimento, o transplante um grupo inteiro de animais com a mesma população de células transduzidas de doadores BM. </li><li> Para a caracterização in vitro de transduzidas HSPEs, a cultura das células para um adicional de 4-5 dias em StemSpan suplementado com citocinas e analisar por citometria de fluxo para a eficiência de transdução, e por microscopia para a diversidade de cores. <ol><li> Sacrifício camundongos individuais e recuperar tecidos e órgãos para a imagem latente, em vários pontos de tempo até 120 dias pós-transplante. <ol><li> Spray com etanol a pele do rato e inciso da pele no lado ventral evitar a disseminação de cabelo. </li><li> Dissecar e de consumo de acordo com os procedimentos padrão do baço, nódulos linfáticos poplíteos, pulmão, coração, pele, tecido adiposo, o músculo esquelético, rim, fígado, bem como a cabeça para o acesso a calvária. </li><li> Como alternativa, use calvaria ou criar uma janela óssea para geração de imagens ao vivo várias vezes ao longo do tempo 2,8,9 ou imagem órgãos superficiais, como os gânglios linfáticos da pele e no animal vivo. </li></ol></li><li> Coloque órgãos individuais em 35 milímetros placas de cultura de número 0 tampa de vidro em 50-10056; l PBS para imagens-los intactos, sem corte, fixação ou processamento adicional, tal como descrito no passo 2.5. </li><li> Para imagem volumétrica, manter os órgãos em em PBS frio até o uso. Para imagens de lapso de tempo proceder de imediato a imagens de órgãos em DMEM, 10% FBS contendo HEPES 20 mM a 37 ° C </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol> 2. confocal e de dois fótons Microscopia e Análise de Imagem <ol><li> Realizar imagem usando um microscópio confocal cinco canais e multiphoton sistema Leica SP5 equipado com multi-linha Argon, diodo 561 nm, 594 nm HeNe e HeNe 633 nm lasers visíveis. Use no modo 2-fótons, um femtosegundo pulsada laser de Ti: Safira (Ti-Sa), ajustável para excitação de 680 a 1080 nm com correção de dispersão. Utilização em experiências envolvendo vermelho-deslocado PQ (tdTomato e mCherry), um oscilador paramétrico óptico (OPO) do laser para alargar a gama de comprimentos de onda de saída, tanto quanto 1,030-1,300 nm, sequencialmente ou em simultâneo com o tele Ti-Sa a laser. </li><li> Imagem de vários tecidos, utilizando um HCX-IRAPO-L 25X / 0,95 NA objectiva de imersão de água (WD = 2,5 mm), um-PLAPO-CS HC 20X / 0,70 NA objectivo seco (WD = 0,6 mm), ou HC-PL-IRAPO 40X /1.1 NA objetiva de imersão em água (WD = 0,6 mm). </li><li> Obter espectros de fluorescência confocal coleta de pilhas lambda (xyλ) da luz emitida em 5 nm-bandas do espectro visível a partir de células da BM transduzidas com um único vetor FP Lego, bem como do controle, não-transplantado BM. <ol><li> Processo de imagens com o software v2.4.1 Leica LAS-AF para criar todos os espectros de referência da PQ 5, bem como de autofluorescência (Figura 2A). Usando os espectros FP individual e a diferença no brilho de fluorescência (expressos como% de EGFP) de Cerúlea (79%), Vénus (156%), tdTomato (283%) e mCherry (47%), situado a 5 canais de imagem sequenciais do seguinte modo: Cerulean (458 / 468-482 nm), EGFP (488 / 496-514 nm), Venus (514 / 523-558 nm), tdTomato (561 / 579-597 nm), e mCherry (594 / 618-670 nm) ( <strong&gt; Figura 2B). </li><li> Validar a rigorosa separação PQ, como células transduzidas com cada indivíduo FP são visíveis apenas no canal correspondente e ausente do resto (Figura 2C). Além disso, esta abordagem multi-canal definido cria uma única 5-canais &quot;ColorPrint&quot; que permite a análise de cor e posterior acompanhamento clonal e tem a vantagem de reduzir tempos de aquisição em relação a imagem espectral. </li></ol></li><li> Emissão de fluorescência separado, no modo 2-fótons, de elevada eficiência espelhos costume dicróicas e recolher com quatro canais detector não-descanned (NDD) da seguinte forma: um espelho dicróico em 568 nm seguido por um espelho dicróico em 465 nm, seguido por a 452/45 nm filtro de emissão para SHG ou autofluorescência e Cerulean, um filtro 525/40 nm de emissão para EGFP ou Vênus, e um espelho dicróico 648 nm e 620/60 nm filtro de emissão para tdTomato ou mCherry. <ol><li> Revelar informações estruturais por microscopia de dois fótons iimaging contraste ntrinsic (como descrito acima) de autofluorescência tecido de elastina, NADH, (animado em 780 nm), e segundo harmônico sinal gerado (SHG) do osso e colágeno fibrilar (animado em 920 nm ou 860 nm coletados em um back-espalhados direção) 10,11. </li></ol></li><li> Para visualização volumétrica 3D, recolher série de imagens xyz (tipicamente 1 x 1 x 4 mm 3 de tamanho de voxel) ao longo do eixo z, a intervalos de 5 mm ao longo de um intervalo de profundidades (150-300 um) por toda a medula óssea e outros tecidos, sobre grandes regiões, utilizando a função telha do software para gerar automaticamente volumes que compõem todo um costuradas fossas esterno, aproximadamente 2,5 x 1,2 milímetros 2 (xy) e 300 um (z) (Figuras 2D-2E) e Filme 1. <ol><li> Imagem calota craniana medula diretamente através do crânio, sem o corte 2, 8. </li><li> Seção esterno ao longo do plano sagital (bisection) e depoistransversalmente na articulação entre a imagem 2 esternal fossa e através do corte cara 3,4,12 (Resumo na Figura 1B adaptado de Takaku et ai 3). </li></ol></li><li> Para 4D lapso de tempo, colocar recentemente excisada poplítea nó de linfa, baço, pulmão, ou amostras de ossos de calvária sem cortes para pratos de 35 mm de cultura de número 0 lamela, em 50-100 ul de DMEM, FBS a 10% contendo 20 mM de HEPES a 37 ° C e usar dois fótons Ti-Sa excitação (860 nm), combinada com a excitação confocal (458 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm, 594 nm) e Leica scanner de ressonância (8000 Hz / s), tendo z-stacks (~ 80 mm) em intervalos de 20 seg durante até 1 hora. <ol><li> Por três cores de uso de imagem 2P simultânea Ti-Sa sintonizado em 860 nm simultaneamente com o laser OPO (sintonizado em 1.130 nm para tdTomato; ou 1.140 nm mCherry) (Filme 2). </li></ol></li><li> Reconstrução e análise dos volumes 3D e sequências de tempo 4D <ol><li> Use Imaris x64 softwsão a versão 7.6, ou pacotes de software alternativas para transformar os azulejos-stacks de imagens RAW para prestados volume (3D) de dados de células fluorescentes dentro da medula óssea e tecidos diferentes e exportá-los como filmes 3D-rotação, como descrito anteriormente 3,4 (Filme 1) passo-a-passo exemplo: <ol><li> Em Imaris, abra a imagem z-stack; Selecione &quot;Ultrapasse&quot; para exibir a visualização volume 3D. </li><li> Use &quot;navegar&quot; para aumentar o volume em torno de 360 ​​°. </li><li> Selecione &quot;Animação&quot; para criar uma animação; usar quadros-chave para adicionar vistas selecionadas, zoom, rotações de volume; Visualizar o filme, edite como necessário e salvar o arquivo em um formato de filme desejada (ex: avi, mov). </li></ol></li><li> Para a avaliação quantitativa das células e clone de freqüência 3D, posições, tamanhos e distribuição, outro processo de z-stacks, utilizando os módulos Imaris XT que integram aplicações MATLAB realizando distância de mediçãourements (usando um algoritmo de transformação distância) e clusters de análise, como descrito anteriormente 3,4. Transforme as seqüências de pilhas de imagens ao longo do tempo em quatro dimensões (4D) filmes prestados no volume com software x64 Imaris e usar local e análise de superfície para rastreamento semi-automático de motilidade celular em três dimensões utilizando algoritmos de movimento auto-regressivos. </li><li> Realizar análise multiespectral de células da seguinte forma: extrair o multi-color pontos marcados, adicionando todos os 5 canais através de canal aritmética dos Imaris XT em um novo canal; determinar, para todos os pontos (células), a intensidade de fluorescência média em cada um dos canais do componente 5. Exportar os valores em software Excel para plotar gráficos que indicam o &quot;ColorPrint&quot; único ou seja, a relação% de cada FP em cela individual (Figura 2E gráfico). Corrija o conjunto de dados para a deriva de tecidos, e calcular a velocidade da célula e deslocamento ao longo do tempo, os comprimentos de pista, caminhos e distâncias; valores de exportação em Excel software para traçar gráficos. Montar figuras compostas com software Adobe Photoshop CSS 5. </li></ol></li></ol>

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<li>Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+a+novel+tool+to+study+cell+biology+in+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy a novel tool to study cell biology in living animals.</a> Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+MYH9-related+disease+mutations+in+nonmuscle+myosin+II-A%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mouse models of MYH9-related disease mutations in nonmuscle myosin II-A.</a> Blood. 119, 238-250 (2012).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Descrevemos aqui os detalhes de uma metodologia poderosa recentemente concebido para rastreamento de células clonal, combinando a grande diversidade gerada pela marcação com vetores Lego-codificação 5PQ e de imagem com confocal tandem e microscopia dois fótons para alcançar volumétrica e imagens dinâmicas em tecidos vivos combinatória. Isto estendeu o uso de cores baseada em FP marcação gravando confocal identidade espectral em 5 &quot;distintas&quot; canais de 8-bits. Assim, a proporção relativa de Cerulean, EGFP, Vênu...

A correction was made to <a href="/video/51669">In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy</a>. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.
This was corrected in the discussion from:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and &#8220;on-the-fly&#8221;) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 30 &#956;m, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.
to:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and &#8220;on-the-fly&#8221;) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 300 &#956;m, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.

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Erratum: In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

A produção de células sanguíneas, denominado hematopoiese, é mantida por uma pequena população de células estaminais e progenitoras hematopoéticas (hspCs). Estas células residir dentro da medula óssea (BM) em um nicho microambiental complexo que consiste em osteoblastos, células do estroma, tecido adiposo e estruturas vasculares, todos implicados no controlo da auto-renovação e diferenciação 1,2. Como intacta BM tem sido tradicionalmente inacessível para observações diretas, as interações entre HSPC e seu microambiente permanece em grande parte não caracterizada in vivo. Anteriormente, nós estabelecemos uma metodologia para visualizar a arquitetura 3D da BM intacto usando microscopia de fluorescência confocal e reflexão 3. Foram caracterizados expansão de hspCs EGFP-marcados na MC, mas o uso de apenas um único FP impedida análise de regeneração a um nível clonal. Muito recentemente, aproveitou a Lentivirus Gene Ontology (Lego) vetores expressando constitutivamente flproteínas uorescent (FPS) para marcar de forma eficiente as células 4,5. A co-transdução de HSPC com três ou cinco vectores gera uma paleta de cores diversas combinatórias, permitindo a localização de vários clones de HSPC individuais. Marcado HSPC combinado com nova tecnologia de imagem permitido traçar homing indivíduo HSPC e enxerto na BM de ratos irradiados. Vetores Lego foram usadas para marcar HSPC com 3 ou 5 fps diferentes (de Cerulean, eGFP, Vênus, tdTomato e mCherry) e seguir o seu enxerto ao longo do tempo na BM por microscopia confocal e dois fótons, que permite a visualização nítida de ossos e outros estruturas de matriz, e a relação de clones HSPC de componentes do seu microambiente. HSPC foram purificados como a linhagem de células negativas de camundongos C57BL / 6 BM, transduzidas com vetores de Lego, e infundidas por injeção na veia da cauda em ratos congênitas ablated-mielo. Através do monitoramento de grandes volumes de tecido esterno BM visualizamos o enxerto intra-ósseo que ocorre no inícioBM regeneração. Grupos de células com espectros cor diversificada, parece, inicialmente, em estreita proximidade com o osso e progrediu centralmente ao longo do tempo. Curiosamente, após mais de 3 semanas, a medula consistiu de aglomerados clonais macroscópicas, sugerindo propagação da hematopoiese derivado de hspCs individuais contiguamente na medula, em vez de difusão generalizada de hspCs através da corrente sanguínea. Havia menos diversidade de cores em pontos de tempo de atraso, sugerindo dificuldade na transdução de longo prazo repovoar células com múltiplos vetores. Além disso, hspCs aglomerados formados no baço, um órgão também responsável para a hematopoiese em ratinhos. Células individuais derivadas de HPSC poderia ser resolvido no timo, nódulos linfáticos, baço, fígado, pulmão, coração, pele, músculo esquelético, tecido adiposo, e renal bem. As imagens em 3D pode ser avaliada qualitativamente e quantitativamente a apreciar a distribuição de células com perturbações mínimas dos tecidos. Por fim, ilustramosd a viabilidade de estudos dinâmicos ao vivo em 4D, combinando multiphoton digitalização ressonante e confocal de imagem time-lapse. Esta metodologia permite que não-invasivo de alta resolução, multidimensional célula-destino traçado do espectro marcados populações de células em sua arquitetura intacta 3D, fornecendo uma ferramenta poderosa no estudo da regeneração de tecidos e patologia.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Produção de vírus</td></tr><tr><td>LeGO-Cer2</td><td>Addgene</td><td>27338</td><td>Expressão de Cerulean</td></tr><tr><td>LeGO-G2</td><td>Addgene</td><td>25917</td><td>Expressão de eGFP</td></tr><tr><td>LeGO-V2</td><td>Addgene</td><td>27340</td><td>Expressão de Vênus</td></tr><tr><td>LeGO-T2</td><td>Addgene</td><td>27342</td><td>Expressão de tdTomato</td></tr><tr><td>LeGO-C2</td><td>Addgene</td><td>27339</td><td>Expressão do</td></tr><tr><td>Kit de Transfecção de Fosfato de Cálcio</td> mCherry <td>Sigma</td><td>CAPHOS-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco, Life Technology</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino Inativado</td><td>por Calor Sigma</td><td>F4135-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Caneta Strep Glutamina</td><td>Gibco, Life Tecnologia</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>SW28 Ultracentrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>L60</td><td></td></tr><tr><td>Millex Unidade de Filtro Acionado por Seringa (0.22 &micro; m)</td> <td>Millipore</td><td>SLGS033SS</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Coleta, purificação, transdução e transplante de células de camundongo</td></tr><tr><td>ACK tampão de lise</td><td>Quality Biologicals Inc.</td>Kit de Depleção de Células Lineage <td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>(mouse)</td><td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td><td>130-090-858</td><td></td></tr><tr><td>LS colunas + tubos</td><td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td><td>130-041-306</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de Pré-Separação (30 &micro; m)</td> <td>Miltenyi Biotec Inc. EUA</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM meio sem soro para cultura e expansão de células hematopoiéticas (500 ml)</td> <td>StemCell Technologies Inc&nbsp;</td><td>9650</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL-11 CF</td><td>R & D Systems Inc</td><td>418-ML-025/CF</td><td>100 &micro; g/ml é 1.000x</td></tr><tr><td>SCF murino recombinante</td><td>RDI Divisão da Fitzgerald Industries Intl&nbsp;</td><td>RDI-2503</td><td>100 &micro; g/ml é 2.000x</td></tr><tr><td>IL-3 murina recombinante</td><td>R & D Systems Inc</td><td>403-ML-050</td><td>20 &micro; g/ml é 2.000x</td></tr><tr><td>FLT-3 Ligante</td><td>Miltenyi Biotec Inc. EUA</td><td>130-096-480</td><td>100 &micro; g/ml é 1.000x</td></tr><tr><td>placas de 12 poços, Costar</td><td>Corning Inc.</td><td>3527</td><td></td></tr><tr><td>Retronectina</td><td>Takara Bio Inc</td><td>T100A/B</td><td>Ressuspender em 50 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>Sulfato de Protamina</td><td>Sigma</td><td>P-4020</td><td>4 &micro; g/ml é 1.000x</td></tr><tr><td colspan="4">Microscopia confocal e de dois fótons</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hepes</td><td>Cellgro, Mediatech Inc.</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>Prato de cultura com fundo de vidro P35G-0-20-C</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Prato de cultura com fundo de vidro P35G-0-14-C</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Vidro de borosilicato; 4 poços</td><td>Thermo Scientific</td><td>155383</td><td></td></tr><tr><td>Coverwashs 22 mm No 2</td><td>Thomas Scientific</td><td>6662-Q55</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 AOBS microscópio confocal e multifotônico de cinco canais</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Vision II -TiSaph alcance do laser 680-1.080 nm</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Alcance compacto do laser OPO 1.030-1.350 nm</td><td>Coerente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCX-IRAPO-L 25X/0,95 NA objetiva de imersão em água (WD=2,5 mm)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objetiva seca HC-PLAPO-CS 20X/0,70 NA (WD=0,6 mm)</td>Objetiva de imersão em água <td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HC-PL-IRAPO 40X/1,1 NA (WD=0,6 mm)</td>Software <td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris versão 7.6</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo clonal rastreamento de stem hematopoiéticas e células progenitoras marcado por cinco proteínas fluorescentes usando confocal e microscopia multifotônica

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Nós desenvolvida e validada uma metodologia de marcação para rastreamento clonal de células tronco e progenitoras hematopoéticas (hspCs) com alta resolução espacial e temporal para estudar in vivo hematopoiese usando o transplante de medula óssea de camundongos modelo experimental fluorescente. Marcação usando lentivirais que codificam proteínas fluorescentes (FPS) combinatória genética permitem o mapeamento do destino da célula através de imagens de microscopia avançada. Vetores que codificam cinco PQ diferentes: Cerulean, EGFP, Vênus, tdTomato e mCherry foram utilizados para a transdução simultaneamente hspCs, criando uma paleta variada de cores de células marcadas. Imagem por microscopia confocal híbrido / two-photon permite a avaliação alta resolução simultânea de células marcadas com exclusividade e seus descendentes em conjunto com os componentes estruturais dos tecidos. Análise volumétrica ao longo de grandes áreas revelam que as células derivadas de HSPC espectralmente codificados podem ser detectados de forma não invasiva, em vários tecidos intactos, incluindo a medula óssea (BM), Por extensos períodos de tempo a seguir ao transplante. Estudos ao vivo combinando multiphoton taxa de vídeo e confocal de imagem time-lapse em 4D demonstrar a possibilidade de rastreamento de celular e dinâmica clonal de uma forma quantitativa.

Whole-mount 3D confocal / 2 fótons reconstruções de microscopia do curso esternal tempo de medula óssea revelou o enxerto e expansão de transplantados co-5fps em um padrão com características marcantes: clones apareceram claramente delineados, de forma homogênea marcado com ampla paleta de cores inicialmente e progresso ao longo do tempo para conter preferencialmente células de uma grande parte da cor. Configuração microscopia confocal e exemplos representativos de imagem 5ips-HSPC marcado na medula óssea do esterno est...

Combinatória 5 proteínas fluorescentes marcação de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas permite in vivo de rastreamento via clonal confocal e microscopia de dois fótons, fornecendo insights sobre medula óssea hematopoiética arquitetura durante a regeneração. Este método permite o mapeamento destino não-invasivo de espectro codificados células hspCs derivados em tecidos intactos por longos períodos de tempo após o transplante.

In vivo Clonal Rastreamento de Stem hematopoiéticas e células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes usando confocal e microscopia multifotônica

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

O objetivo geral deste procedimento é acompanhar clones hematopoiéticos marcados com fluorescência em tecidos vivos, incluindo a medula óssea, utilizando uma nova estratégia de microscopia confocal e de dois fótons. Para isso, células progenitoras e células-tronco hematopoiéticas de camundongos são isoladas e co-transduzidas com vetores lentivirais de ontologia genética ou vetores Lego que codificam cinco proteínas fluorescentes: Ian, EGFP, Venus, TD-tomato e mCherry. As células transduzidas são então transplantadas em camundongos receptores mieloablatados e, após períodos de até 120 dias, a medula óssea e órgãos são coletados dos camundongos receptores e é realizada microscopia confocal combinada com microscopia de dois fótons.As imagens resultantes são reconstruídas em 3D para rastrear a localização de clones transplantados e células marcadas com fluorescência ao longo do tempo. Isso facilita o estudo da evolução clonal durante a hematopoese e o destino de células derivadas da medula óssea em outros órgãos. A principal vantagem desta técnica em relação ao corte físico de tecidos é que ela combina os benefícios da imagem de alta resolução com o corte óptico por microscopia confocal e a visualização de componentes estruturais por ampliação dupla na microscopia.Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área da hematologia, como a análise clonal espacial e temporal da hematopoiese durante a regeneração da medula óssea a partir do enxerto inicial, com manutenção geográfica dos clones em expansão ao longo do tempo. É possível examinar volumes muito grandes de tecido denso intacto. Por exemplo, aproximadamente 3000 imagens foram reconstruídas computacionalmente para visualizar clones marcados por cores em um esterno de camundongo. Embora este método possa fornecer informações sobre a arquitetura clonal na hematopoiese normal e alterada, ele também pode ser aplicado ao estudo da regeneração de órgãos, respostas imunes ou padrões de metástase tumoral.Neste procedimento, vetores lentivirais de ontologia gênica ou vetores Lego codificam cinco proteínas fluorescentes: Ian EGFP, Venus, TD tomato e M Cherry. Cada proteína fluorescente é expressa a partir de um forte promotor constitutivo do vírus da formação de focos no baço, ou promotor SFFV. Após produzir os vetores Lego que codificam as proteínas fluorescentes e titular os partículas virais, colete a medula óssea dos membros anteriores e posteriores de camundongos doadores sacrificados mediante a dissecação dos fêmures e tíbias.Use um bisturi para remover completamente todos os ligamentos musculares e tecidos em excesso dos ossos. Em seguida, corte a extremidade de cada osso o mais próximo possível da articulação. Usando uma agulha de calibre 27 acoplada a uma seringa contendo meio I 10, lave a medula óssea para dentro de um tubo cônico de centrífuga de 50 mililitros e centrifugue a 500 G e quatro graus Celsius para obter o pellet celular.Após descartar o sobrenatante para lisar as células vermelhas, adicione 50 mililitros de um tampão CK, centrifugue como antes, então descarte o sobrenatante e repita após descartar o segundo sobrenatante. Re-suspenda as células em 10 mililitros de meio I 10. Em seguida, utilize um kit de esgotamento de linhagem máximo para purificar células progenitoras negativas para linhagem de acordo com o protocolo modificado do kit detalhado no documento anexo.Uma vez que as células negativas para linhagem tenham sido purificadas, plaque-as em um frasco T75 numa densidade de cinco vezes 10 à quinta células por mililitro em meio StemSpan suplementado com IL-3 murina, IL-11 murina, ligante FL humano e fator de células-tronco murino; incube a 37 graus Celsius e 5% de CO₂ por 48 horas. Após dois dias, utilize um espátula celular para ressuspender as células e transfira uma a quatro vezes 10 à quinta células por poço de uma placa de 12 poços; adicione os vetores com uma MOI de seis a sete, cada um em meio StemSpan com citocinas e quatro microgramas por mililitro de sulfato de protamina às células.Para atingir um volume total de um mililitro em cada poço, certifique-se de preparar um controle de cor única para cada proteína fluorescente. Após 24 horas, ressuspenda as células utilizando uma espátula e transfira-as para um tubo de centrífuga de cinco mililitros. Em seguida, centrifugue e ressuspenda-as em meio stem span sem citocinas, centrifugue novamente e ressuspenda as células em 100 microlitros de meio stem span sem citocinas por injeção ou para microscopia confocal ou citometria de fluxo.Transfira-os para placas de 12 poços contendo meio fresco com citocinas e cultive por mais 96 horas. Em preparação para o transplante de medula óssea, coloque os camundongos receptores irradiados em uma gaiola sob uma luz de aquecimento enquanto os animais se aquecem. Prepare as seringas para injeção com uma a quatro vezes 10 à quinta potência de células negativas para linhagem em 100 microlitros de stem span por camundongo.Prepare uma seringa para cada camundongo. Quando as veias da cauda estiverem dilatadas, os camundongos estarão prontos para serem injetados. Coloque o camundongo a ser injetado em um dispositivo de contenção para camundongos e desinfete a cauda com uma gaze embebida em etanol 70%.Este passo também permite uma melhor visualização da veia caudal. Em seguida, injete as células na veia caudal. Transplante um coorte inteiro de animais com a mesma população de células de medula óssea doadora transduzidas em diversos momentos até 120 dias após o transplante.Recupere os tecidos e órgãos para imagem intacta sem corte. Coloque órgãos individuais em placas de cultura de 35 milímetros número zero. Cubra as placas com lâminas de vidro com 50 a 100 microlitros de PBS frio para imagem de lapso de tempo.Coloque os órgãos em DMEM com 10% de FBS contendo 20 milimolares de heaps a 37 graus Celsius e realize a imagem imediatamente. Aqui, a microscopia é realizada usando um sistema confocal invertido Leica SP cinco com cinco canais e sistema multiphoton equipado com laser de argônio multilinha, diodo 561 nanômetros, hélio-neônio 594 nanômetros e hélio-neônio 633 nanômetros no espectro visível. Coloque uma das amostras individuais transduzidas com Lego na platina do microscópio e foque.Colete pilhas de imagens lambda em intervalos de largura de banda de cinco nanômetros, abrangendo todo o espectro luminoso. Em seguida, use o software para selecionar uma região de interesse na imagem e visualize o histograma do espectro de referência. Salve esses dados.Em seguida, repita este processo para cada proteína fluorescente no experimento. Depois, utilize os espectros coletados das proteínas fluorescentes individuais para definir as larguras de banda no modo de canal. Para fazer isso em cada canal, clique no controle deslizante preto e insira a largura de banda a ser utilizada.A largura de banda escolhida deve abranger a região de pico de cada espectro de excitação de proteínas fluorescentes, garantindo que não haja sobreposição entre os canais fluorescentes. Ajuste o ganho e o deslocamento para cada detector de modo que a faixa dinâmica da saída da amostra esteja em um nível detectável, semelhante entre as proteínas fluorescentes e sem saturação. Por exemplo, a proteína M cherry é cerca de metade tão brilhante quanto a EGFP, portanto, o ganho e o deslocamento devem ser ajustados para fornecer uma faixa dinâmica semelhante para ambas.Por fim, no modo de canal, capture uma imagem de cada amostra controle de cor única com todos os cinco canais e verifique se cada proteína fluorescente é visível apenas no canal correspondente e ausente nos demais. Após a validação dos espectros para todos os canais, salve as configurações. Essas configurações podem ser importadas e utilizadas em experimentos futuros que utilizem as mesmas proteínas fluorescentes e tecido da amostra.Aqui, demonstra-se a microscopia combinada confocal e de dois fótons utilizando medula óssea de esterno, obtida com bisturi e pinça mediante secção do esterno ao longo do plano sagital. Em seguida, faça um corte transversal na articulação entre duas fossas esternais. Coloque os ossos com a face cortada voltada para baixo em uma placa de cultura de 35 milímetros com lamínula número zero, contendo 50 a 100 microlitros de PBS frio; a aquisição de imagens ocorrerá através da face cortada.Verifique a posição dos ossos em um microscópio estereoscópico. Posicione a amostra na platina do microscópio. Em seguida, configure o software de imagem para capturar sequencialmente dois fótons com sinal gerado por harmônica secundária.Em seguida, excitação confocal de cinco cores. Defina os limites da área de coleta Zack com um tamanho de passo de cinco mícrons ao longo de 150 a 300 mícrons. Utilize a função de mosaico para instruir o software a gerar automaticamente volumes compostos que compreendam todo o esterno Fosse, aproximadamente 2,5 por 1,2 milímetros quadrados na direção XY.Inicie a captura para coletar sequencialmente imagens X, Y, Z em todos os cinco canais, além da microscopia de dois fótons com sinal de harmônico secundário gerado a partir do osso e do colágeno fibrilar, para a aquisição de imagens temporizadas em 4D. Coloque amostras recém-excizadas e não cortadas de linfonodo poplíteo, baço, pulmão ou osso calvarial em placas de cultura de 35 milímetros com lamínula número zero. Cubra as placas com 50 a 100 microlitros de DMEM contendo 10% de FBS e 20 milimolares de HEPES, a 37 graus Celsius.Coloque a amostra sobre a platina aquecida do microscópio. Em seguida, no software, altere os parâmetros de captura para utilizar a excitação de dois fótons com safira de titânio em 860 nanômetros combinada com excitação confocal e o scanner ressonante da Leica a 8.000 hertz por segundo. Para obter pilhas Z de 80 mícrons em intervalos de 22º durante até uma hora, para imageamento simultâneo de três cores com dois fótons, instrua o software a usar a safira de titânio ajustada em 860 nanômetros simultaneamente com o laser OPO ajustado em 1.130 nanômetros para TD tomate ou em 1.140 nanômetros para M cereja.Por fim, inicie a captura para coletar quatro imagens em 4D. Como antes, uma vez que todas as imagens tenham sido coletadas, realize a reconstrução e análise tridimensional e quadridimensional usando o software Amer versão 64 bits ou software similar. Abra a imagem Zack, selecione surpass para exibir o visualizador de volume 3D.Em seguida, utilize Navegar para rotacionar o volume em 360 graus. Depois, selecione animação. Use quadros-chave para adicionar as visualizações selecionadas, zoom e rotações do volume.Visualize o vídeo e edite conforme necessário. Por fim, salve o arquivo em um formato de vídeo desejado para rastrear a história clonal de células-tronco e progenitoras hematopoéticas marcadas com fluorescência. Células doadoras co-transduzidas com cinco vetores Lego diferentes foram transplantadas em um camundongo receptor e a medula óssea esternal foi imageada e analisada conforme descrito neste vídeo.Quatro dias após o transplante, agrupamentos de células marcadas em uma grande variedade de cores eram visíveis em proximidade próxima à borda óssea, que é mostrada em branco. No dia 31, um grande clone de cor verde-amarelada única havia se expandido para ocupar toda a Fossa, conforme ilustrado nas imagens sobrepostas e também nas imagens de canal único. A análise de conteúdo de FPS demonstrou marcação homogênea por duas variantes de FPS: EGFP e Venus.Este vídeo de reconstrução 3D demonstra a arquitetura espacial dos clones marcados contidos no osso esternal. Esta imagem mostra um exemplo de células derivadas da medula óssea no linfonodo poplíteo 120 dias após o transplante. Células dispersas são majoritariamente marcadas em amarelo e vermelho e estão perifericamente rodeadas por fibras de colágeno mostradas em branco no coração visto do lado epicárdico.Várias células individuais são visíveis, dispersas entre os cardiomiócitos mostrados em branco, visualizados por sua autofluorescência de dois fótons a 780 nanômetros. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em vários dias, se for executada corretamente após o seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de regeneração e desenvolvimento de órgãos e para a biologia em geral, permitindo explorar os arranjos espaciais e temporais de elementos celulares e estruturais clonalmente complexos por meio de marcação multicolorida e de imagens confocais e de dois fótons.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como desenvolver uma metodologia de marcação por fluorescência para rastrear a marcação clonal de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas em órgãos vivos.

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Fonte: Gómez-Villafuertes, R., et. al., imagens ao vivo seguidas de rastreamento de célula única para monitorar a biologia celular e a progressão da linhagem de várias populações neurais. J. Vis. exp. (2017) O O vídeo demonstra o processo de preparação, imagem e rastreamento de células-tronco neurais adultas em tempo real para estudar comportamentos celulares, incluindo divisão e diferenciação.

 Imagens ao vivo e rastreamento de célula única para monitorar a linhagem neural em células-tronco neurais adultas

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Desenvolvimento, expansão e<em&gt; In vivo</em&gt; Monitorização das células NK humanas de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e e induziu células-tronco pluripotentes (iPSCs)

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In vivo Clonal Rastreamento de Stem hematopoiéticas e células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes usando confocal e microscopia multifotônica (Vídeo) | JoVE Journal

In vivo Clonal Rastreamento de Stem hematopoiéticas e células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes usando confocal e microscopia multifotônica

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