Ensaios Repórter Massively Parallel em células de mamíferos cultivadas

O objetivo geral deste procedimento é testar as atividades reguladoras gênicas de milhares de sequências de DNA em paralelo. Isso é feito primeiro construindo uma biblioteca repórter onde as sequências de DNA de interesse estão ligadas a genes repórteres com uma ou mais tags de sequência de identificação em seus três principais ur. A segunda etapa do procedimento é transfectar essa biblioteca repórter em uma população de células.

A etapa final é contar o número de ocorrências de cada uma das tags de sequência de identificação nos mRNAs repórter e na biblioteca repórter correspondente por sequenciamento profundo. Em última análise, os resultados podem ser usados para inferir a relação entre a sequência de DNA e as atividades dos elementos reguladores do gene por meio da análise computacional das contagens de tags de sequência. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como luciferase ou ensaios repórter baseados em GFP, é que ela permite testar milhares de sequências regulatórias em um único prato de células cultivadas.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da regulação gênica, como quais nucleotídeos dentro do promotor ou intensificador atividade baseada em essenciais. Este método pode ser usado para uma ampla variedade de outros projetos de experimento, como a triagem de uma grande biblioteca de elementos reguladores putativos para atividade em estados celulares específicos. Demonstrando o procedimento de construção da biblioteca repórter estará Peter Rugo, um pesquisador associado sênior de laboratórios de biotecnologia, demonstrando a biblioteca repórter TRANSFECT e recuperação de RNA será Lee Wang, um pesquisador associado sênior do meu grupo, Ensaios de repórter massivamente paralelos doravante referidos como NPRA, começam com o projeto e síntese de sequências a serem testadas para atividade regulatória.

E tag denota uma ou mais tags de identificação. Os locais de restrição KPN um e XBA um estão situados no meio. Ressuspenda a biblioteca de oligonucleotídeos sintetizados em 100 microlitros de tampão TE 0,1.

Execute a biblioteca de oligonucleotídeos em um gel de poliacrilamida desnaturante de ureia a 10% TBE. Carregue cerca de um ole em cada pista e analise o gel com uma mancha fluorescente sensível ao DNA de fita simples. Se houver uma proibição discreta correspondente aos oligonucleotídeos de comprimento total, corte-a e elua os oligos em 100 microlitros de TE 0,1 durante a noite à temperatura ambiente e agitando usando a biblioteca de oligonucleotídeos purificada em gel ou bruta.

Configure uma PCR de emulsão para amplificar a biblioteca e adicionar SI one tails. Configure reações de 50 microlitros conforme descrito na tabela dois. Em seguida, combine a mistura de reação de 50 microlitros com 300 microlitros de óleo e mistura de surfactante do kit de emulsão e purificação my DNA por cinco minutos a quatro graus Celsius mistura de vórtices em uma emulsão.

Em seguida, distribua a emulsão em tubos ou placas de PCR como reações de 50 microlitros e execute 20 ciclos de PCR após a PCR. Junte as emulsões de 350 microlitros novamente. Em seguida, adicione um mililitro de isobutanol e vórtice à mistura.

Purifique brevemente o produto de amplificação usando uma coluna de purificação de DNA e execute um Eloqua em um gel de 2% ou 4% para avaliar sua qualidade. A amplificação sérica de bibliotecas de óleo complexas pode introduzir viés de representação, RIC Applicon e outros artefatos. É essencial minimizar o número de ciclos de PCR usados para controle de qualidade adicional.

Recomenda-se fazer a biblioteca de sequenciamento completa antes de prosseguir para as próximas etapas para preparar o backbone do plasmídeo linearizado. Primeiro P digestivo pra um vetor com SFI um a 50 graus Celsius por duas horas. Em seguida, execute os produtos digeridos em um gel de 1% e colete o DNA da banda de backbone de 2,5 KILOBASE usando uma coluna de centrifugação de purificação de gel.

Em seguida, digerir os produtos de PCR de emulsão da mesma forma e recolher também os produtos com a coluna de purificação de ADN. Agora configure uma reação de ligação com 100 nanogramas de PCR digerido e 50 nanogramas de plasmídeo linearizado. Use T quatro ligase e execute a reação durante a noite a 16 graus Celsius no dia seguinte.

Inative a reação de ligação aquecendo-a a 65 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, transforme duas alíquotas de microlitros dos produtos da reação de ligação em alíquotas de 50 microlitros de equalizadores eletrocompetentes. Recupere as células em 800 microlitros de meio SOC a 37 graus Celsius com agitação por uma hora.

Em seguida, agrupe todas as transformações paralelas e avalie-as por meio de diluições seriadas em ágar LB com 50 a cem microgramas de penicilina de carbono por mililitro. Incubar as placas durante a noite a 37 graus Celsius e estimar o total de UFC no dia seguinte. Imediatamente após a transformação, use o restante das células transformadas para inocular 200 mililitros de LB suplementados com 100 microgramas de carbono por mililitro.

Cultive as células a 37 graus Celsius durante a noite e, com agitação no dia seguinte, isole o DNA plasmático seguindo os procedimentos padrão para confirmar a presença de inserções. Digerir uma alíquota da biblioteca isolada com SFI one e esgotar os produtos em um gel 1%aros Linearizar a biblioteca de plasmídeos com digestões seriais usando KPN one e XBA one primeiro digerir com KPN one a 37 graus Celsius por uma hora e purificar os produtos usando esferas magnéticas. Em segundo lugar, digerir um produto com XBA um mais uma unidade de fosfatase alcalina de camarão a 37 graus Celsius por duas horas depois.

Inative a reação a 65 graus Celsius por cinco minutos e, em seguida, purifique os produtos usando esferas magnéticas. Execute uma alíquota em um gel de 1% e, se algum plasmídeo não cortado for visível, purifique o fragmento linearizado agora para gerar uma biblioteca NPRA adequada para transfecção em células de mamíferos. Primeiro, prepare um fragmento de quadro de leitura compatível para abrir o doador PMPRA de um.

Digerir este plasmídeo com KPN um e XBA um a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, execute os produtos em um gel 1%AGROS. Extirpar o fragmento de quadro de leitura aberto, neste caso, a 1,7 quilobases e purificar usando uma coluna de centrifugação de purificação em gel.

Em seguida, ligue o quadro de leitura aberto linearizado na biblioteca intermediária linearizada, conforme descrito para a ligação anterior. Transforme os produtos de ligação em células E coli e isole a biblioteca final de plasmídeos NPRA conforme descrito anteriormente. Se você não for cuidadoso, transfira.

Os plasmídeos ajustados e os produtos subplatados podem reduzir bastante a proporção de construções corretas no pool de plasmídeos final. Certifique-se de isolar a banda correta e verificar o plano de fundo antes de prosseguir para as próximas etapas. Como verificação, digerir um Eloqua de um ou dois microgramas da biblioteca NPRA com KPN um.

Execute isso em um gel de 1% e, se for executado como uma única banda, prossiga. Caso contrário, consulte o protocolo de texto sobre como lidar com a contaminação de células cultivadas transfectadas. Com o NPRA.

As condições dos plasmídeos devem ser otimizadas para cada tipo de célula. Por exemplo, 5 milhões de células HK 2 93 T 17 crescidas a cerca de 50% de confluência em uma placa de cultura de 10 centímetros podem ser transfectadas com 10 microgramas de DNA plasmidial em um mililitro de ofm, um meio de soro reduzido usando 30 microlitros de lipo LTX e 10 microlitros de reagente plus. Nesse caso, remova a mistura de transfecção cerca de cinco horas e deixe as células se recuperarem por um ou dois dias depois, colha as células e use um kit para isolar o mRNA polipositivo.

Em seguida, faça uma tag, busque a biblioteca de sequenciamento e analise os resultados. O NPRA facilita a dissecção quantitativa de alta resolução das relações de atividade de sequência de elementos reguladores transcricionais. Um experimento NPRA bem-sucedido normalmente produz medições altamente reprodutíveis para a maioria das sequências na biblioteca Transfected.

Se a reprodutibilidade for baixa, a concentração de mRNAs repórteres no RNA recuperado é provavelmente muito baixa. Isso pode acontecer devido à baixa atividade absoluta entre as sequências do ensaio ou devido à baixa eficiência de transfecção. Nesses n PRAs bem-sucedidos, 37.000 variantes de uma sequência de 1 45 pares de bases a montante do gene do interferon beta humano foram analisadas com ou sem exposição ao vírus sendi

A caixa Tata promotora e o potenciador proximal conhecido podem ser claramente identificados como regiões ricas em informações de maneira dependente do vírus. Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita em cerca de uma semana se for realizada corretamente Após este procedimento. Outros métodos, como EMCE e captura de afinidade de DNA de proteína, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como qual fator de transcrição está se ligando a nucleotídeos críticos dentro de uma sequência de DNA ativa.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar bibliotecas repórter para testar as atividades reguladoras de genes de milhares de sequências de DNA em paralelo.