Geração e Purificação de INO80 cromatina remodelação Complexos Humanos e subcomplexos

O objetivo deste procedimento é gerar e purificar versões selvagens e mutantes do complexo remodelador da cromatina INO80 multissubunidade. Isso é realizado primeiramente isolando os núcleos de células que expressam proteínas INO80 marcadas com epítopo FLAG. Na segunda etapa, são preparados extratos nucleares, seguidos pela purificação dos complexos remodeladores da cromatina humanos selvagens ou mutantes INO80 por cromatografia com anti-FLAG acros. Por fim, as composições de subunidades dos complexos INO80 purificados podem ser analisadas por western blot ou coloração com prata.

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave sobre como as subunidades dos complexos remodeladores da cromatina MultiPro contribuem para sua atividade geral. Este método foi projetado especificamente para estudar versões selvagens e mutantes do complexo remodelador da cromatina NO 80, mas também pode ser usado para estudar outros complexos nucleares multissubunidade, como o mediador.

O passo mais crítico do procedimento é o passo de extração nuclear. As pessoas geralmente enfrentam problemas porque, durante o passo de extração com sal, tendem a adicionar o sal muito rapidamente ou de forma muito vigorosa. Após o cultivo em frascos rotativos, transfira as células HEC 2 9 3 para um tubo cônico graduado de tamanho apropriado e centrifugue por 10 minutos a 1000 vezes G e quatro graus Celsius. Após a remoção do sobrenadante, meça o volume do pellet celular compactado, então re-suspenda o pellet em cinco volumes de células compactadas do tampão A com pipetagem suave e incube as células no gelo por exatamente 10 minutos.

Após centrifugar as células novamente, meça o pellet celular pela segunda vez; ele deverá ter aumentado até duas vezes o tamanho original. Desta vez, re-suspenda as células em dois volumes de células compactadas do tampão A, transfira a suspensão celular para um homogeneizador de tecidos de tamanho apropriado e homogeneíze a suspensão com o pistilo de vidro solto até que 90% das células apresentem coloração positiva com azul de tripano. Em seguida, centrifugue as células homogeneizadas em um tubo de centrífuga de alta velocidade de 45 mililitros durante 20 minutos a 25.000 × g e 4 graus Celsius, utilizando um rotor de ângulo fixo. Em seguida, remova o sobrenadante contendo as proteínas citosólicas do pellet nuclear para extrair os núcleos com sal.

Agora, adicione 2,5 mililitros do tampão C, mas a cada três mililitros do volume celular compactado inicial, ao precipitado. Em seguida, usando uma pipeta serológica, desprenda o precipitado da parede do tubo e transfira toda a mistura para um homogeneizador Dounce de tamanho apropriado. Homogeneíze a mistura com dois movimentos de um pistilo frouxo para ressuspender os núcleos e, então, transfira a fração nuclear ressuspensa para um béquer gelado de tamanho tal que a suspensão preencha o béquer com pelo menos 0,5 centímetros de profundidade.

Em seguida, calcule o volume de cloreto de sódio cinco molar necessário para levar a solução a uma concentração final de 0,42 molar de cloreto de sódio de acordo com a fórmula a seguir. Agora, adicione gradualmente a solução salina com volume calculado, gota a gota, enquanto mexe suavemente a suspensão com uma haste de vidro em gelo para aumentar a concentração de sal na suspensão até que todo o cloreto de sódio tenha sido adicionado e a solução torne-se muito viscosa. Em seguida, transfira cuidadosamente a suspensão viscosa para tubos de policarbonato de 70 mililitros em um rotor Tipo 45 TI com conjunto de tampa e use um agitador para balançar lentamente os tubos selados a quatro graus Celsius. Após 30 minutos, ultracentrifugue as amostras em um rotor TI 45 por 30 minutos a 40.000 vezes G e quatro graus Celsius, e recolha o extrato nuclear contendo os sobrenadantes em um único recipiente plástico.

Em seguida, divida a solução de extrato nuclear em alíquotas de tamanho conveniente, congele-as rapidamente em nitrogênio líquido e armazene-as a menos 80 graus Celsius. Para preparar as perlas Anti-Flag aros para imunopurificação, comece usando uma pipeta de 200 microlitros com a ponteira cortada para transferir 200 microlitros de uma suspensão de perlas a 50% Anti-Flag aros para um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro. Transfira as perlas pré-lavadas para um tubo cônico contendo 10 mililitros de extrato nuclear recentemente descongelado e incube por horas a 4 graus Celsius com rotação lenta em um rotador de laboratório, e então recolha as perlas Flag aros por centrifugação durante cinco minutos a 1000 vezes G e 4 graus Celsius.

Em seguida, lave o extrato de perlas P em 10 mililitros de tampão lise quatro 50 durante cinco minutos a quatro graus Celsius com agitação suave em um agitador rotativo. Após centrifugar a mistura do extrato de perlas, reutilize novamente. Suspenda o pellet em 100 a 150 microlitros de tampão lise quatro 50 fresco e transfira as perlas para um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro.

Continue a enxaguar o tubo cônico de 15 mililitros com porções de 100 a 150 microlitros de Lysol 50 até que todas as esferas tenham sido transferidas para o tubo de microcentrífuga. Após centrifugar as esferas em uma microcentrífuga, lave-as três vezes com um mililitro de lisado quatro 50 e uma vez com um mililitro de tampão EB 100. Em seguida, para eluir as proteínas ligadas, adicione 200 microlitros de tampão EB 100 contendo o peptídeo flag e incube a amostra a quatro graus Celsius em um agitador rotativo.

Após meia hora, centrifugue as microesferas na microcentrífuga para obter o pellet e, em seguida, transfira o sobrenadante contendo o complexo OAC C eluído para um novo tubo de microcentrífuga. Após repetir a eluição mais quatro vezes, passe o eluato coletado por uma coluna de centrifugação vazia para remover quaisquer microesferas residuais de flag aero da fração proteica. Por fim, utilize um dispositivo de ultrafiltração centrífuga com corte de peso molecular de 50.000 para concentrar a fração proteica eluída aproximadamente 10 vezes.

Como ilustrado nesta figura, a pureza dos complexos NO 80 preparados utilizando as subunidades com marcação flag indicadas, conforme acabado de demonstrar, pode ser avaliada por meio de géis de poliacrilamida SDS corados com prata. Quaisquer proteínas que apareçam nesta faixa controle são contaminantes que se ligam de forma não específica aos flag aerois. Essas etiquetas indicam as faixas correspondentes às subunidades do NO 80 testadas, e estas indicam as mobilidades dos marcadores de peso molecular.

A posição do tipo selvagem NO 80 é indicada pelo quadrado preto, e as posições dos mutantes NO 80 são indicadas pelos círculos vazados. As pistas separadas pela linha preta são provenientes de géis distintos. A composição dos complexos pode ser avaliada por meio de Western blot utilizando anticorpos contra várias subunidades do NO 80.

Por exemplo. Aqui foram avaliados os subunidades do módulo do domínio terminal final, o módulo associado ao centro helicase e o módulo SNF2. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em um dia, começando com a colheita das células e terminando com a purificação dos complexos.

Essa técnica permitirá que pesquisadores purifiquem complexos com múltiplas subunidades e subcomplexos de células de mamíferos, a fim de estudar suas funções. Após assistir a este vídeo, você terá uma compreensão mais clara de como purificar complexos proteicos de remodelação da cromatina e outros complexos proteicos com múltiplas subunidades de células humanas ou outras linhagens celulares de mamíferos.