Geração e Purificação de INO80 cromatina remodelação Complexos Humanos e subcomplexos

O objetivo deste procedimento é gerar e purificar versões selvagens e mutantes da subunidade múltipla no complexo de remodelação da cromatina oh 80. Isso é feito isolando primeiro os núcleos das células que expressam o epítopo da bandeira marcado nas proteínas O 80 Na segunda etapa, os extratos nucleares são preparados e, em seguida, o tipo selvagem ou humano mutante nos complexos de remodelação da cromatina O 80 é purificado por cromatografia anti-Flag aros. Em última análise, as composições de subunidades dos complexos purificados de NO 80 podem ser analisadas por western blot ou coloração de prata.

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre como as subunidades dos complexos de remodelação da cromatina MultiPro contribuem para sua atividade geral. Este método foi projetado especificamente para estudar versões selvagens e mutantes do complexo de remodelação da cromatina NO 80, mas também pode ser usado para estudar outros complexos nucleares de múltiplas subunidades. Como o mediador.

A etapa mais crítica do procedimento é a etapa de extração nuclear. As pessoas geralmente têm problemas porque, durante a etapa de extração do sal, as pessoas tendem a adicionar sal muito rapidamente ou muito vigorosamente Após a cultura Em garrafas de rolo, transfira as células HEC 2 9 3 para um tubo cônico graduado de tamanho adequado e gire-as por 10 minutos a 1000 vezes G e quatro graus Celsius. Depois de remover o supinato, medir o volume do grânulo de células compactadas, suspender novamente o grânulo em cinco volumes de células de tampão A com uma pipetagem suave e incubar as células no gelo durante exactamente 10 minutos.

Depois de girar as células novamente, meça o pellet celular uma segunda vez, ele deve ter aumentado até duas vezes de tamanho. Desta vez, suspenda novamente as células em dois volumes de células de tampão A, em seguida, transfira a suspensão celular para um homogeneizador de tecido de tamanho apropriado e homogeneize a suspensão celular com o pilão de vidro solto até que 90% das células corem positivamente com centrífuga azul trian, as células homogeneizadas em um tubo de centrífuga de alta velocidade de 45 mililitros por 20 minutos a 25, 000 vezes G e quatro graus Celsius em um rotor de ângulo fixo. Em seguida, remova o SUP

Agora adicione 2,5 mililitros de tampão C, mas a cada três mililitros de volume inicial de células compactadas ao pellet. Em seguida, usando uma pipeta sorológica, desaloje o pellet da parede do tubo e transfira toda a mistura para um homogeneizador de tamanho apropriado. Homogeneizar a mistura com duas pinceladas de um pilão solto para suspender novamente os núcleos e, em seguida, transferir a fração nuclear nu ressuspensa para um béquer resfriado de tamanho tal que a suspensão encha o béquer até pelo menos 0,5 centímetros de profundidade.

Em seguida, calcule o volume de cloreto de sódio de cinco molares necessário para levar a solução a uma concentração final de cloreto de sódio molar de 0,42 de acordo com a seguinte fórmula. Agora, adicione gradualmente o volume calculado da solução salina gota a gota, enquanto estrela suavemente a suspensão com uma haste de vidro no gelo para aumentar a concentração de sal da suspensão até que todo o cloreto de sódio tenha sido adicionado e a solução se torne muito viscosa. Em seguida, transfira cuidadosamente a suspensão viscosa para tubos de policarbonato de 70 mililitros em um rotor TI Tipo 45 com conjunto de tampa e use um mutador para balançar lentamente os tubos selados a quatro graus Celsius Após 30 minutos, ultracentrifugar as amostras em um rotor TI 45 por 30 minutos a 40.000 vezes G e quatro graus Celsius, e puxe o extrato nuclear contendo sobrenadantes para um único recipiente de plástico.

Em seguida, divida a solução de extrato nuclear em alíquotas de tamanho conveniente, congele-as em nitrogênio líquido e armazene-as a 80 graus Celsius negativos. Para preparar o Anti-Flag aros para imunopurificação, comece usando uma pipeta de 200 microlitros com o corte da ponta para transferir 200 microlitros sobre uma pasta de esferas Anti-Flag aros de 50% para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Transfira as esferas pré-lavadas para um tubo cônico contendo 10 mililitros de extrato nuclear recém-descongelado antes de horas de quatro graus Celsius com rotação lenta em um rotador de laboratório e, em seguida, colete o aros da bandeira por centrifugação por cinco minutos de 1000 vezes G e quatro graus Celsius.

Em seguida, lave o extrato de esferas P em 10 mililitros de piolhos, quatro tampão de 50 por cinco minutos de quatro graus Celsius com balanço suave em um mutador. Então, depois de girar a mistura de extrato de esferas, reutilize novamente. Suspenda o pellet em 100 a 150 microlitros de piolhos frescos quatro 50, transfira as contas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Continuando a enxaguar o tubo cônico de 15 mililitros com 100 a 150 microlitros de Lysol 50 até que todos os grânulos tenham sido transferidos para o tubo da microcentrífuga. Depois de girar as contas em uma microcentrífuga, lave-as três vezes com um mililitro de lys four 50 e uma vez com um mililitro de EB 100. Em seguida, para eluir as proteínas ligadas, adicione 200 microlitros de tampão EB 100 contendo peptídeo bandeira e incube a amostra a quatro graus Celsius em uma noz.

Depois de meia hora, coloque as esferas na microcentrífuga que você ganha e, em seguida, transfira o SUP natant contendo o eluído no complexo OAC C para um novo tubo de microcentrífuga. Depois de repetir o eluciano mais quatro vezes, passe o eluato puxado por uma coluna de centrifugação vazia para remover quaisquer grânulos aerodinâmicos residuais da fração de proteína. Finalmente, use um dispositivo de ultrafiltração centrífuga com um corte de 50.000 pesos moleculares para concentrar a fração de proteína aludida aproximadamente 10 vezes.

Conforme ilustrado nesta figura, a pureza dos complexos NO 80 preparados usando as subunidades de etiqueta de bandeira indicadas, como acabamos de demonstrar, pode ser avaliada usando géis de poliacrilamida SDS corados com prata. Quaisquer proteínas que apareçam nesta faixa de controle são contaminantes que se ligam não especificamente a aeros de bandeira. Estes rótulos indicam as proibições correspondentes às subunidades NO 80 ensaiadas e estas indicam as mobilidades dos marcadores de peso molecular.

A posição do tipo selvagem NO 80 é indicada pelo quadrado preto, e as posições dos mutantes NO 80 são indicadas pelos círculos abertos. As faixas separadas pela linha preta são de géis separados. A composição dos complexos pode ser avaliada por Western blott usando anticorpos contra várias subunidades NO 80.

por exemplo. Aqui estão as subunidades do módulo de domínio do terminal final, o módulo associado ao centro Helicase e o módulo SNF dois foram avaliados. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em um dia, começando com a colheita de células e terminando com a purificação de complexos.

Esta técnica permitirá aos pesquisadores purificar complexos de múltiplas subunidades e subcomplexos para células de mamíferos, a fim de estudar suas funções. Depois de assistir a este vídeo, você terá uma melhor compreensão de como purificar a remodelação da cromatina e outros complexos de proteínas de múltiplas subunidades de células humanas ou outras linhagens de células de impulso.