Os ensaios bioquímicos para analisar as actividades de ATP-dependente cromatina remodelação Enzimas

O objetivo do seguinte procedimento é medir as diversas atividades bioquímicas de complexos de remodelação da cromatina dependentes de TP. Isso é conseguido por meio da medição do deslizamento dependente de TP de um nucleossomo posicionado de uma extremidade de uma molécula de DNA para uma posição mais central no DNA, utilizando um ensaio de deslocamento eletroforético de mobilidade ou emsa. Um método baseado em EMSA semelhante pode ser usado para monitorar a formação de mononucleossomos ligados ao complexo de remodelação, a fim de avaliar a atividade de ligação ao nucleossomo dos complexos de remodelação da cromatina.

Além disso, a cromatografia em camada delgada pode ser utilizada para medir a atividade de APAs em complexos de remodelação da cromatina dependentes de TP. Em última análise, esses métodos podem ser usados para medir a remodelação da cromatina dependente de TP em complexos humanos de O 80. Neste vídeo, demonstraremos ensaios bioquímicos para o estudo dos complexos de remodelação da cromatina NO 80.

O método semelhante também pode ser aplicado para estudar outros complexos de remodelação da cromatina, bem como para realizar o ensaio de remodelação de nucleossomos dependente de ATP. Primeiro, prepare os substratos de nucleossomos após montar uma reação de PCR de 100 microlitros conforme descrito na tabela. Realize as reações de PCR em um termociclador e, em seguida, passe os produtos das reações duas vezes por colunas de centrifugação livres de nucleases para remover quaisquer nucleotídeos não incorporados.

Em seguida, misture dois ole de fragmentos de DNA 6 0 1 marcados com P 32 com seis microgramas de nucleossomos hilar em 50 microlitros de tampão e incube a mistura a 30 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, dilua sequencialmente a mistura para 0,8 molar, 0,6 molar e 0,4 molar de cloreto de sódio pela adição de 12,5 microlitros, 20,8 microlitros e 41,6 microlitros, respectivamente, de solução tampão tris HCL suplementada com E-D-T-A-P-M-S-F e DTT, incubando por 30 minutos a 30 graus Celsius após cada adição, após a última incubação com 125 e depois 250 microlitros do tampão cloreto de tris. Suplemente adicionalmente com P 40 glicerol não indebt e PSA em mais duas diluições de 30 minutos a 30 graus Celsius, até 0,2 molar e 0,1 molar de cloreto de sódio, respectivamente.

Em seguida, armazene o substrato de mononucleossomo a quatro graus Celsius por até três meses antes de montar os ensaios em géis nativos de poliacrilamida. Depois, para cada reação a ser realizada, combine cerca de 20 nanomolares em oh 80 com a quantidade apropriada de tampão EB 100 suficiente para obter um volume de 4,75 microlitros em um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro silanizado pré-resfriado. Congele imediatamente qualquer fração remanescente contendo NO 80 em pó seco com gelo seco.

Em seguida, distribua 5,25 µL do coquetel mestre recém-preparado para cada tubo de reação, misturando bem por pipetagem para cima e para baixo. Incube então as reações em um bloco térmico a 30 °C. Ao final da incubação, adicione 1,5 µL da mistura removedora recém-preparada a cada tubo para encerrar as reações, e em seguida misture cada tubo de reação.

Centrifugue bem e incube a 30 graus Celsius por mais 30 minutos. Enquanto isso, pré-ecute o gel nativo de poliacrilamida em uma unidade de eletroforese vertical a 100 volts por 30 minutos a quatro graus Celsius, utilizando TBE 0,5X como tampão de corrida com um bastão magnético na câmara inferior para manter uma circulação constante do tampão. Ao final da incubação, após remover a mistura, adicione 2,5 microlitros de corante de carga a cada reação. Após uma breve centrifugação, utilize ponteiras de carga para aplicar as amostras no gel.

Execute o gel a 200 volts durante 4,5 horas a quatro graus Celsius com circulação de tampão. Em seguida, transfira o gel para uma pilha de duas folhas de papel filtro e posicione os filtros com o gel por cima, utilizando filme plástico transparente para detectar o sinal. Exponha o gel a uma tela de armazenamento de fósforo a quatro graus Celsius pelo tempo desejado e, depois, escaneie a tela com um sistema de scanner de imagem isotópica e analise os dados utilizando o software apropriado para realizar os ensaios de APA dependentes de DNA e nucleossomos.

Inicie combinando de 10 a 50 nanomolares dos subcomplexos imunopurificados com uma quantidade suficiente de tampão eeb 100 para obter um volume de 2,2 microlitros em um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro pré-resfriado e lubrificado para cada reação, e em seguida, congele imediatamente quaisquer frações contendo NO 80 em gelo seco pulverizado. Em seguida, misture suavemente 2,8 microlitros do coquetel sub recém-preparado contendo nucleossomos de DNA ou nenhum deles aos tubos de reação contendo a enzima por pipetagem para cima e para baixo e transfira os tubos para um bloco térmico a 30 graus Celsius. A seguir, use um lápis para traçar uma linha bem leve a pelo menos 1,5 centímetro da borda inferior de um polietileno 20 por 10.

Quero dizer cromatografia em camada delgada ou placa TLC. Em seguida, aplique 0,5 microlitros de cada mistura de reação na linha aos 5, 15, 30 e 60 minutos após a incubação, devolvendo imediatamente cada amostra ao bloco de aquecimento, para que vários pontos de tempo possam ser coletados de um único tubo. Após aplicar a última amostra, use um secador de cabelo para secar a placa e, em seguida, transfira a placa para uma câmara de vidro contendo o suficiente.

Fosfato de potássio 0,375 molar para permitir que os 0,5 centímetros inferiores da placa de TLC fiquem submersos na solução. Cubra a câmara e desenvolva a reação até que o frente da fase líquida atinja o topo da placa de TLC, momento em que a placa deve ser imediatamente secada com jato de ar e exposta a uma tela fosfoimagerizadora em temperatura ambiente. Por fim, escaneie a tela com um sistema de imagem de isótopos para determinar a quantidade de substrato a TP radioativo e produto a DP.

Este primeiro experimento demonstra que o complexo purificado por meio da bandeira IES duas bandeiras, N-O-A-T-E e bandeira NO 80 delta N, apresenta atividades de deslizamento de nucleossomos semelhantes, indicando que a extremidade N-terminal do NO 80 e/ou suas subunidades associadas são dispensáveis para a remodelação de nucleossomos pelo complexo NO 80. Em contraste, o complexo purificado por meio da bandeira NO 80 delta n delta HSA é inativo neste ensaio, indicando que a atividade de remodelação depende do domínio HSA das APAs do NO 80 e/ou de suas subunidades associadas. Utilizando uma modificação do procedimento do ensaio de deslizamento de NUCLEOSSOMO, pode-se medir a atividade de ligação ao nucleossomo de complexos remodeladores da cromatina.

Neste experimento, a incubação dos nucleossomos com quantidades crescentes de complexos NO 80 intactos, purificados por meio da subunidade E do NO 80, levou à desaparição dependente da dose da banda correspondente aos mononucleossomos livres e ao surgimento de uma nova espécie deslocada que migrou próximo ao topo do gel. Em contraste, quando os nucleossomos foram incubados com complexos menores, purificados por meio do NO 80 delta N e que careciam de um subconjunto de subunidades do NO 80, a espécie deslocada migrou mais rapidamente, sugerindo que a mobilidade relativa da banda superdeslocada é determinada pelo tamanho dos complexos no ensaio. Neste experimento final, são apresentados os resultados de um ensaio que compara as atividades de APAs ativadas por DNA e por NUCLEOSSOMOS de dois subcomplexos diferentes do NO 80.

As manchas que migram mais lentamente correspondem ao TP alfa marcado com 32P no ponto inicial, e as espécies que migram mais rapidamente são os produtos da reação ADP, com as áreas indicando a direção da migração do solvente. Ao utilizar esses procedimentos, é importante lembrar-se de realizar ensaios que variem no tempo de duração e que contenham diferentes concentrações de enzima. Isso garantirá que as medições sejam feitas quando as curvas de resposta do produto em função do tempo e da dose forem lineares.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como analisar as atividades de ligação ao nucleossomo e deslizamento do nucleossomo em complexos de remodelação da cromatina purificados. Não se esqueça de que trabalhar com materiais radioativos pode ser perigoso. Deve-se tomar precauções, como usar jaleco e proteção ocular, monitorar contaminação radioativa e descartar adequadamente os resíduos radioativos.