Name: Os ensaios bioquímicos para analisar as actividades de ATP-dependente cromatina remodelação Enzimas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Aprenda ensaios bioquímicos para analisar enzimas de remodelação cromatina dependente de ATP usando EMSA e cromatografia em camada fina. Este método permite medir deslizamento de nucleossomos e atividade ATPase.

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O trabalho no laboratório dos autores é apoiado por uma doação do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (GM41628) e por uma doação para o Instituto Stowers de Pesquisa Médica do Fundo de Pesquisa Médica Helen Nelson da Greater Kansas City Community Foundation.

1. ATP-dependentes nucleossoma Remodelação Ensaios Para medir as actividades de ATP-dependente nucleossoma remodelação, imunopurificada INO80 ou subcomplexos INO80 são incubados com ATP e um substrato mononucleosomal, que contém um único nucleossoma posicionado numa extremidade de um fragmento de ADN de 216 pb, 32 P-marcado. Os produtos da reacção são então sujeitos a electroforese em géis de poli-acrilamida nativo. <ol><li> Para gerar o, &#39;601&#39; fragmento de ADN marcado com 32 P, a partir de amplificar pGEM-3Z-4 601 um fragmento de ADN de 216 pb que contém uma sequência de 601 posicionamento nucleossoma posicionada-final, utilizando os oligonucleótidos 5&#39;-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG e 5&#39;-como AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG frente e verso, primers. <ol><li> Defina-se uma reacção de PCR de 100 ul, tal como descrito na Tabela 1. </li><li> Realizar as reacções de PCR num termociclador utilizando o seguinte programa: 1 min a 96 ° C, followed por 45 seg a 94 ° C, 30 seg a 57 ° C, 60 segundos a 72 ° C durante 30 ciclos; terminando com 7 min a 72 ° C. </li><li> Após a reacção de PCR é terminado, remover os nucleótidos não incorporados fazendo passar os produtos de reacção duas vezes através de colunas de giro livre de nuclease. </li><li> Executar 5 ul do produto de PCR purificado em gel de agarose a 1,2% para confirmar que a reacção de PCR gerado a ~ 216 pb Fragmento de ADN desejado. </li><li> Dilui-se 5 ul do produto de PCR purificado de 20 vezes, e medir a concentração de ADN, utilizando um espectrofotómetro de UV. O rendimento médio é de aproximadamente 40 ng / mL. </li><li> Medir a radioactividade de 1 ul do produto de PCR purificado em um contador de cintilação. Estimar a eficiência de marcação pelo cálculo do cpm / ng. A reacção de marcação bem sucedida é esperado para produzir ~ 15,000 cpm / ng de fragmento de ADN 601. </li></ol></li><li> Transferir nucleossomas células HeLa na rotulada 601 DNA utilizando um método de diluição em série 5. <ol><li> Misture 2 pmol de32 601 fragmento de ADN marcado com P com 6 ug de nucleossomas Hela (preparado tal como descrito 5) em 50 ul de um tampão contendo 1,0 M de NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, EDTA 1 mM, PMSF 0,1 mM e 1 mM TDT e incubar a 30 ° C durante 30 min. </li><li> Sequencialmente diluir a mistura a 0,8 M, 0,6 M e 0,4 M de NaCl por diluição com 12,5 mL, 20,8 mL, e 41,6 ul, respectivamente, de 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), EDTA 1 mM, PMSF 0,1 mM, e 1 mM de DTT, com uma incubação de 30 min a 30 ° C depois de cada diluição. </li><li> Diluir a mistura de 0,2 M e, em seguida, para NaCl 0,1 M por adição de 125 mL e, em seguida, 250 ul do mesmo tampão contendo 0,1% de Nonidet P-40, 20% de glicerol, e 200 ug / ml BSA, com uma incubação de 30 min a 30 ° C entre as duas diluições finais. Armazenar o substrato mononucleosome a 4 ° C durante até 3 meses. </li></ol></li><li> Realizar as reacções de nucleossomas deslizante dependentes de ATP num volume total de 10 ul. A reaction componentes estão listados na Tabela 2. vez que a concentração de NaCl para a actividade óptima remodelação nucleossoma INO80 ~ é NaCl 50 mM (resultados não publicados), ajustar a concentração total de cada reacção em NaCl a 50 mM, tendo em conta a quantidade de NaCl contido nas preparações de nucleossomas e enzima. <ol><li> Antes de começar a configurar os ensaios, lança gel de poli-acrilamida nativas (18 x 16 cm). Para preparar um único gel contendo 5% de acrilamida (acrilamida: bisacrilamida a 37,5: 1), TBE 0,5 x (45 mM Tris borato, 1 mM EDTA), 0,01% de persulfato de amónio (APS), e 0,001% de N, N, N &#39;, N&#39;-tetrametiletilenodiamina (TEMED), mistura dos ingredientes listados na Tabela 3. Permitir que o gel de polimerizar durante pelo menos 2 horas à temperatura ambiente. </li><li> Entretanto, para cada reacção a ser realizada, combinar num tubo siliconizado microcentrífuga de 1,5 ml pré-arrefecido ~ 20 nM ou INO80 INO80 subcomplexo (preparado como descrito 3) com uma quantidade de tampão EB100 ( <strong&gt; Tabela 4) suficiente para dar um volume de 4,75 mL. Imediatamente re-congelar qualquer restantes fracções contendo INO80 em gelo seco em pó ou em azoto líquido. </li><li> Defina-se um cocktail mestre com o resto dos ingredientes, ampliação de um factor de &#39;X&#39; (em que X = número total de reacções 3). A quantidade de cada ingrediente necessário para uma única reacção de 10 uL é listada na Tabela 5; a receita deve ser dimensionado de acordo com o número de reacções a serem realizadas. Misture bem, tocando o tubo ou pipetando para cima e para baixo com um Pipetman e girar o tubo por alguns segundos em uma microcentrífuga de bancada. </li><li> Dispensar 5,25 ul do cocktail de mestre para cada um dos tubos de reacção estabelecidas no passo 1.3.2. Misture bem pipetando para cima e para baixo. Iniciar as reacções através da transferência de tubos de reacção para um banho de 30 ° C de calor bloco ou água e incubar durante 2 horas. </li><li> Enquanto isso, a preparar »removendo mistura &#39;cocktail contendo ADN competidore nucleossomos, ampliação por um fator de X (X = número total de reações + 4). A quantidade de cada ingrediente necessário para a preparação de 1,5 ul da mistura para remoção de uma única reacção está listado na Tabela 6; a receita deve ser aumentado de acordo com o número de ensaios a serem realizados. </li><li> Terminar reações adicionando 1,5 mL da mistura de remover. Misture bem, girar para baixo, e incuba-se a 30 ° C durante mais 30 min. </li><li> Enquanto isso, a pré-rodar o gel de poliacrilamida nativa, em uma unidade de electroforese vertical, a 100 V durante 30 min a 4 ° C, usando TBE 0,5 x como tampão de corrida com uma barra de agitação magnética no interior da câmara inferior para manter a circulação tampão constante. </li><li> Para carregar a amostra, adicionar 2,5 l de corante de carga contendo TBE 3x, 30% de glicerol, 0,25% azul de bromofenol e 0,25% xileno cianol FF. Misture bem, girar rapidamente as amostras, e carregar no gel usando dicas de carregamento. </li><li> Submeter o gel a 200 V durante 4,5 horas a 4 ° C com tampão de circulação.</li><li> Para detectar o sinal, a transferência do gel para uma pilha de duas folhas de papel de filtro. Envolver o papel de filtro com o gel no topo usando plástico transparente, e, em seguida, expô-la a um ecrã de fósforo de armazenamento a 4 ° C durante o tempo desejado. </li><li> Digitalize o ecrã com um sistema de scanner de imagens isótopo e analisar os dados utilizando software apropriado. </li></ol></li></ol> 2. Mononucleosome Ensaios de Ligação Para ensaiar a afinidade de ligação de um dado complexo INO80 para mononucleosomes, realizar um deslocamento Electrophoretic Mobility Assay (EMSA), utilizando o substrato mononucleosomal gerado no passo 1.2. <ol><li> Configure a reação Misturas para ensaios de ligação, tal como descrito para os ensaios de remodelação nucleossomos, mas omitir o ATP e remover mix das reações; incubar a 30 ° C durante 30 min. </li><li> Adicionar 2,5 uL de corante de carga de cada uma das misturas de reacção, e aplicam-se a um gel de poliacrilamida nativa, contendo 3,5% de acrilamida (acrilamida: bis 37,5: 1), 1% de glicerol, TBE 0,5 x, 0,01% APS, 0,001% e TEMED. </li><li> Usando 0,5 x TBE como tampão de corrida, correr o gel a 200 V durante 2,5 horas a 4 ° C com tampão de circulação e expor a um ecrã de fósforo de armazenamento. </li></ol> 3. ADN e Nucleosome-ATPase Os ensaios dependentes Realizar ensaios ATPase em misturas de reacção contendo 5 ul de 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 60 mM de NaCl, 6,6 mM de MgCl2, 0,8 mM EDTA, 0,015% de Nonidet P-40, 2,5% de glicerol, 0,1 mg / ml de BSA, 1 DTT, 0,1 mM de PMSF, 2 mM ATP, 2 uCi de [α- 32 P] ATP (3000 Ci / mmol). Para cada complexo INO80 ou quantidade de complexo a ser ensaiada INO80 criou três reacções paralelas, uma contendo tampão EB100 para medir DNA- ou nucleossoma-ATPase independente, contendo um DNA de plasmídeo circular fechado (5000 pb, ~ 30 nM) para medir DNA- ATPase dependente, e outro contendo Hela oligonucleosomes (~ 185 nm) para medir nucleosome-ATPase dependente. Configure todas as reações no gelo. <ol&gt; <li> Para cada reacção, combinar 10-50 nM dos INO80 ou INO80 subcomplexos imunopurificados com uma quantidade de tampão EB100 suficiente para dar um volume de 2,2 mL em 1,5 mL lubrificados microtubos previamente arrefecidos. Imediatamente re-congelar quaisquer fracções contendo INO80 em gelo seco em pó ou em azoto líquido. </li><li> Configurar um cocktail mestre. A quantidade de cada ingrediente necessário para uma única reacção é apresentado na Tabela 7. Scale-se a receita por ampliação de um factor de 3 (X + 2) 1, em que X = número de preparações INO80 a ser ensaiada. </li><li> Para preparar contendo tampão &#39;sub-cocktails&#39; só, DNA, ou nucleossomos, dispensar 2.5 (X + 2) ul do cocktail mestre em três tubos separados. Adicionar 0,3 (X +2) ul de qualquer EB100, o DNA de plasmídeo circular fechado (1,5 ug / uL), ou Hela oligonucleosomes (1,5 ug / uL) e misturar bem. </li><li> Dispensar 2,8 ul da sub-coquetel adequado para os tubos de reacção contendo enzimas criados em rep 3.1. Pipeta suavemente para cima e para baixo para misturar; evitar a introdução de bolhas. </li><li> Para iniciar reações, transfira os tubos de reacção a um bloco de 30 ° C de calor. </li><li> Depois de 5, 15, 30, e 60 min de incubação, a mancha de 0,5 ul de cada mistura de reacção sobre uma cromatografia em camada fina de celulose polietilenoimina (CCF) da placa (20 x 10 cm) de uma linha recta, pelo menos, 1,5 cm a partir da extremidade inferior . Retornar imediatamente tubos de reação ao bloco C calor de 30 ° para múltiplos pontos temporais podem ser tomadas a partir de um único tubo. Depois de manchas, seque as placas de TLC usando um secador de cabelo. </li><li> Transferir as placas de TLC de uma câmara de vidro contendo o suficiente fosfato de potássio 0,375 M (pH 3,5) para permitir que o fundo de 0,5 cm da placa de TLC a ser submergido na solução. </li><li> Cobrir a câmara, e se desenvolvem até a frente da fase de líquido atinge o topo das placas de TLC. Immediate secar os pratos, cuidadosamente, com um secador de cabelo. </li><li> Expor as placas de TLC secas para uma tela de fósforo de armazenamento à temperatura ambiente.Digitalize o ecrã com um sistema de scanner de imagens isótopo e determinar a quantidade de substrato ATP radioativo e produtos ADP. </li><li> Para calcular a quantidade de ATP hidrolisado, multiplicar o ATP% hidrolisado por a quantidade de ATP presente na mistura da reacção de partida com a seguinte fórmula: pmol de ATP hidrolisado = 10 pmol de ATP na reacção de partida x [ADP / ATP (+ ADP)] </li></ol>

<ol><li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+chromatin+remodeling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The biology of chromatin remodeling complexes.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).</li>
<li>Narlikar, G. J., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+functions+of+ATP-dependent+chromatin-remodeling+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and functions of ATP-dependent chromatin-remodeling enzymes.</a> Cell. 154 (3), 490-503 (2013).</li>
<li>Chen, L., Ooi, S. K., Conaway, J. W., Conaway, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+purification+of+human+INO80+chromatin+remodeling+complexes+and+subcomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Generation and purification of human INO80 chromatin remodeling complexes and subcomplexes.</a> , (2013).</li>
<li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> J. Mol. Biol. 276 (1), (1006).</li>
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<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+organization+of+the+human+INO80+chromatin+remodeling+complex%3A+an+evolutionarily+conserved+core+complex+catalyzes+ATP-dependent+nucleosome+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).</li>
<li>Hamiche, A., Sandaltzopoulos, R., Gdula, D. A., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-dependent+histone+octamer+sliding+mediated+by+the+chromatin+remodeling+complex+NURF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ATP-dependent histone octamer sliding mediated by the chromatin remodeling complex NURF.</a> Cell. 97 (7), 833-842 (1999).</li>
<li>Polach, K. J., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+enzymes+as+probes+of+nucleosome+stability+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Restriction enzymes as probes of nucleosome stability and dynamics.</a> Methods Enzymol. 304, 278-298 (1999).</li>
<li>Anderson, J. D., Thastrom, A., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+access+of+proteins+to+buried+nucleosomal+DNA+target+sites+occurs+via+a+mechanism+that+is+distinct+from+nucleosome+translocation%2C+Mol.Cell+Biol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Spontaneous access of proteins to buried nucleosomal DNA target sites occurs via a mechanism that is distinct from nucleosome translocation, Mol.Cell Biol.</a> 22 (20), 7147-7157 (2002).</li>
<li>Saha, A., Wittmeyer, J., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+remodeling+through+directional+DNA+translocation+from+an+internal+nucleosomal+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromatin remodeling through directional DNA translocation from an internal nucleosomal site.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 12 (9), 747-755 (2005).</li>
<li>Gottschalk, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ADP-ribosyl%29ation+directs+recruitment+and+activation+of+an+ATP-dependent+chromatin+remodeler%2C+Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.</a> 106 (33), 13770-13774 (2009).</li>
<li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ISWI+involves+inhibitory+modules+antagonized+by+nucleosomal+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes.</a> Nature. 492 (7428), 280-284 (2012).</li>
<li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Direct Webb, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Measurement+of+Rapid+Inorganic+Phosphate+Release+Using+a+Novel+Fluorescent+Probe+and+Its+Application+to+Actomyosin+Subfragment+1+ATPase%2C+Biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Real-Time Measurement of Rapid Inorganic Phosphate Release Using a Novel Fluorescent Probe and Its Application to Actomyosin Subfragment 1 ATPase, Biochemistry.</a> 33 (27), 8262-8271 (1994).</li>
<li>Luk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+histone+replacement+by+SWR1+requires+dual+activation+with+histone+H2A.Z+and+canonical+nucleosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stepwise histone replacement by SWR1 requires dual activation with histone H2A.Z and canonical nucleosome.</a> Cell. 143 (5), 725-736 (2010).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Para garantir que a remodelação nucleosome e atividades ATPase observamos em ensaios dependem da atividade catalítica de complexos INO80, e não sobre a contaminação de remodelação e / ou enzimas ATPase, nós nucleosome rotineiramente ensaio remodelação e atividade ATPase de versões cataliticamente inativos de complexos INO80, purificado em paralelo com o tipo selvagem INO80 utilizando o mesmo procedimento. Uma reacção de controlo negativo a que falta o ATP também deve ser realizada quando se examina a actividade de remod...

SnF2 complexos de remodelação da cromatina família incluem um SnF2-como centro ATPase subunidade 1,2. Alguns ATPases função SnF2-como enzimas individuais de subunidade, enquanto que outros funcionam como a subunidade catalítica de grandes complexos de multi-subunidades. Elucidar os mecanismos moleculares pelos quais cada uma das subunidades da cromatina complexos de remodelação contribuir para as suas actividades requer a capacidade de realizar ensaios bioquímicos que dissecam o processo de remodelação. ATP-dependente remodelação nucleossoma pelo complexo INO80 humano e outras enzimas remodelação da cromatina pode ser concebido como um processo multi-etapas que começa com a ligação da enzima à remodelação nucleossomas, seguido por activação do seu ADN e / ou nucleossoma-ATPase dependente, translocação da enzima na remodelação ADN nucleossomal, e eventual reposicionamento de nucleossomas 1,2. Compreender os detalhes moleculares do dependente de ATP processo de remodelação da cromatina requires dissecção da reacção remodelação nos seus passos individuais e definição das contribuições das subunidades individuais do complexo de remodelação da cromatina para cada passo da reacção. Tais análises exigem a capacidade de analisar remodelação nucleosome e outras atividades utilizando substratos moleculares definidos in vitro. Em um protocolo JOVE anterior, descrevemos os procedimentos utilizados para gerar complexos de remodelação da cromatina INO80 e subcomplexos com composições de subunidades definidas 3. Aqui, apresentamos três ensaios bioquímicos que permitem a análise quantitativa da ligação, DNA- e nucleosome ativado ATPase, e as atividades de remodelação nucleossomos associados com tais complexos nucleosome.

<table><tbody><tr><td>Inibidor de Protease Coquetel</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>10x PCR reage buffer&nbsp;</td><td>Roche Ciência Aplicada&nbsp;</td><td></td><td></td>11435094001</tr><tr><td>Roche Taq DNA Polimerase</td><td>Roche Applied Science&nbsp;</td><td></td><td></td>11435094001</tr><tr><td>Colunas de Spin Nuclease NucAway sem Nuclease&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>Cat. # AM10070</td><td></td></tr><tr><td>ATP ultrapuro&nbsp;</td><td>USB/Affymetrix</td><td>77241 25 UM</td><td></td></tr><tr><td>albumina de soro bovino</td><td>Sigma</td><td>A9418&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>40% Acrilamida/Bis 37.5:1</td><td>Amresco</td><td>0254-500ML</td><td></td></tr><tr><td>DNAs de esperma de salmão sonica&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>27-4565-01</td><td></td></tr><tr><td>10% persulfato de amônio (APS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>17874</td><td></td></tr><tr><td>benzonase&nbsp;</td><td>Novagen</td><td>Cat. No. 70664</td><td></td></tr><tr><td>dCTP, [&alpha;-32P]- 6.000 Ci/mmol</td><td>Termociclador PerkinElmer</td><td>BLU013Z250UC</td><td></td></tr><tr><td>PCR PTC 200</td><td>MJ Research</td><td>PTC 200</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de eletroforese vertical Hoefer</td><td></td><td>SE600X-15-1.5</td><td></td></tr><tr><td>tubos de microcentrífuga lubrificados de 1,5 ml&nbsp;</td>Tela de Armazenamento <td>de Fósforo Costar</td><td>3207</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Molecular Dynamics</td><td>63-0034-79</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro 3MM</td><td>Whatman&nbsp;</td><td>28458-005</td><td>VWR</td></tr><tr><td>Typhoon PhosphorImager&nbsp;</td><td>Software GE Healthcare</td><td>8600</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant GE</td><td>Healthcare</td><td>ver2003.02</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Vidro TLC, PEI-Celulose F</td> Membrana de Transferência <td>Millipore</td><td>5725-7</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-FL 7 x 8.4</td><td>Millipore</td><td>IPFL07810</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de pesquisa de uso geral com janela final ou panqueca Sonda GM (Geiger-Mueller)</td><td>Biodex</td><td>Modelo 14C</td><td></td></tr></tbody></table>

os ensaios bioquímicos para analisar as actividades de atp-dependente cromatina remodelação enzimas

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

Membros da família SNF2 de ATPases geralmente funcionam como componentes de complexos de remodelação de cromatina de múltiplas subunidades que regulam a dinâmica do nucleossomo e a acessibilidade do DNA, catalisando a remodelação do nucleossomo dependente de ATP. Dissecar bioquimicamente as contribuições de subunidades individuais de tais complexos para a reação de remodelação da cromatina dependente de ATP em várias etapas requer o uso de ensaios que monitoram a produção de produtos de reação e medem a formação de intermediários de reação. Este protocolo JOVE descreve ensaios que permitem medir as atividades bioquímicas de complexos de remodelação da cromatina ou subcomplexos contendo várias combinações de subunidades. A remodelação da cromatina é medida usando um ensaio deslizante de nucleossomo dependente de ATP, que monitora o movimento de um nucleossomo em uma molécula de DNA usando um método baseado em ensaio de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA). A atividade de ligação ao nucleossomo é medida monitorando a formação de mononucleossomos ligados a complexos de remodelação usando um método semelhante baseado em EMSA, e a atividade de ATPase dependente de DNA ou nucleossomo é testada usando cromatografia em camada fina (TLC) para medir a taxa de conversão de ATP em ADP e fosfato na presença de DNA ou nucleossomos. Usando esses ensaios, pode-se examinar as funções das subunidades de um complexo de remodelação da cromatina comparando as atividades do complexo completo com aquelas que não possuem uma ou mais subunidades. O complexo de remodelação da cromatina INO80 humano é usado como exemplo; no entanto, os métodos descritos aqui podem ser adaptados ao estudo de outros complexos de remodelação da cromatina.

As figuras mostram os resultados representativos de testes bioquímicos usados ​​para caracterizar as actividades, incluindo INO80 nucleossoma deslizante (Figura 1) e de ligação (Figura 2) e DNA- ensaios ou ensaios de ATPase dependente de nucleossoma (Figura 3). A experiência apresentada na Figura 1 compara a capacidade dos complexos INO80 intactas purificado através de FLAG-Ies2 ou FLAG-INO80E e de INO80 subcomplexos purific...

Aqui descrevemos ensaios bioquímicos que podem ser usados para caracterizar enzimas de remodelação da cromatina dependentes de ATP por suas habilidades de 1) catalisar o deslizamento do nucleossomo dependente de ATP, 2) envolver-se com substratos de nucleossomos e 3) hidrolisar ATP de maneira dependente de nucleossomo ou DNA.

Os ensaios bioquímicos para analisar as actividades de ATP-dependente cromatina remodelação Enzimas

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...

O objetivo do seguinte procedimento é medir as diversas atividades bioquímicas de complexos de remodelação da cromatina dependentes de TP. Isso é conseguido por meio da medição do deslizamento dependente de TP de um nucleossomo posicionado de uma extremidade de uma molécula de DNA para uma posição mais central no DNA, utilizando um ensaio de deslocamento eletroforético de mobilidade ou emsa. Um método baseado em EMSA semelhante pode ser usado para monitorar a formação de mononucleossomos ligados ao complexo de remodelação, a fim de avaliar a atividade de ligação ao nucleossomo dos complexos de remodelação da cromatina.Além disso, a cromatografia em camada delgada pode ser utilizada para medir a atividade de APAs em complexos de remodelação da cromatina dependentes de TP. Em última análise, esses métodos podem ser usados para medir a remodelação da cromatina dependente de TP em complexos humanos de O 80. Neste vídeo, demonstraremos ensaios bioquímicos para o estudo dos complexos de remodelação da cromatina NO 80.O método semelhante também pode ser aplicado para estudar outros complexos de remodelação da cromatina, bem como para realizar o ensaio de remodelação de nucleossomos dependente de ATP. Primeiro, prepare os substratos de nucleossomos após montar uma reação de PCR de 100 microlitros conforme descrito na tabela. Realize as reações de PCR em um termociclador e, em seguida, passe os produtos das reações duas vezes por colunas de centrifugação livres de nucleases para remover quaisquer nucleotídeos não incorporados.Em seguida, misture dois ole de fragmentos de DNA 6 0 1 marcados com P 32 com seis microgramas de nucleossomos hilar em 50 microlitros de tampão e incube a mistura a 30 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, dilua sequencialmente a mistura para 0,8 molar, 0,6 molar e 0,4 molar de cloreto de sódio pela adição de 12,5 microlitros, 20,8 microlitros e 41,6 microlitros, respectivamente, de solução tampão tris HCL suplementada com E-D-T-A-P-M-S-F e DTT, incubando por 30 minutos a 30 graus Celsius após cada adição, após a última incubação com 125 e depois 250 microlitros do tampão cloreto de tris. Suplemente adicionalmente com P 40 glicerol não indebt e PSA em mais duas diluições de 30 minutos a 30 graus Celsius, até 0,2 molar e 0,1 molar de cloreto de sódio, respectivamente.Em seguida, armazene o substrato de mononucleossomo a quatro graus Celsius por até três meses antes de montar os ensaios em géis nativos de poliacrilamida. Depois, para cada reação a ser realizada, combine cerca de 20 nanomolares em oh 80 com a quantidade apropriada de tampão EB 100 suficiente para obter um volume de 4,75 microlitros em um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro silanizado pré-resfriado. Congele imediatamente qualquer fração remanescente contendo NO 80 em pó seco com gelo seco.Em seguida, distribua 5,25 µL do coquetel mestre recém-preparado para cada tubo de reação, misturando bem por pipetagem para cima e para baixo. Incube então as reações em um bloco térmico a 30 °C. Ao final da incubação, adicione 1,5 µL da mistura removedora recém-preparada a cada tubo para encerrar as reações, e em seguida misture cada tubo de reação.Centrifugue bem e incube a 30 graus Celsius por mais 30 minutos. Enquanto isso, pré-ecute o gel nativo de poliacrilamida em uma unidade de eletroforese vertical a 100 volts por 30 minutos a quatro graus Celsius, utilizando TBE 0,5X como tampão de corrida com um bastão magnético na câmara inferior para manter uma circulação constante do tampão. Ao final da incubação, após remover a mistura, adicione 2,5 microlitros de corante de carga a cada reação. Após uma breve centrifugação, utilize ponteiras de carga para aplicar as amostras no gel.Execute o gel a 200 volts durante 4,5 horas a quatro graus Celsius com circulação de tampão. Em seguida, transfira o gel para uma pilha de duas folhas de papel filtro e posicione os filtros com o gel por cima, utilizando filme plástico transparente para detectar o sinal. Exponha o gel a uma tela de armazenamento de fósforo a quatro graus Celsius pelo tempo desejado e, depois, escaneie a tela com um sistema de scanner de imagem isotópica e analise os dados utilizando o software apropriado para realizar os ensaios de APA dependentes de DNA e nucleossomos.Inicie combinando de 10 a 50 nanomolares dos subcomplexos imunopurificados com uma quantidade suficiente de tampão eeb 100 para obter um volume de 2,2 microlitros em um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro pré-resfriado e lubrificado para cada reação, e em seguida, congele imediatamente quaisquer frações contendo NO 80 em gelo seco pulverizado. Em seguida, misture suavemente 2,8 microlitros do coquetel sub recém-preparado contendo nucleossomos de DNA ou nenhum deles aos tubos de reação contendo a enzima por pipetagem para cima e para baixo e transfira os tubos para um bloco térmico a 30 graus Celsius. A seguir, use um lápis para traçar uma linha bem leve a pelo menos 1,5 centímetro da borda inferior de um polietileno 20 por 10.Quero dizer cromatografia em camada delgada ou placa TLC. Em seguida, aplique 0,5 microlitros de cada mistura de reação na linha aos 5, 15, 30 e 60 minutos após a incubação, devolvendo imediatamente cada amostra ao bloco de aquecimento, para que vários pontos de tempo possam ser coletados de um único tubo. Após aplicar a última amostra, use um secador de cabelo para secar a placa e, em seguida, transfira a placa para uma câmara de vidro contendo o suficiente.Fosfato de potássio 0,375 molar para permitir que os 0,5 centímetros inferiores da placa de TLC fiquem submersos na solução. Cubra a câmara e desenvolva a reação até que o frente da fase líquida atinja o topo da placa de TLC, momento em que a placa deve ser imediatamente secada com jato de ar e exposta a uma tela fosfoimagerizadora em temperatura ambiente. Por fim, escaneie a tela com um sistema de imagem de isótopos para determinar a quantidade de substrato a TP radioativo e produto a DP.Este primeiro experimento demonstra que o complexo purificado por meio da bandeira IES duas bandeiras, N-O-A-T-E e bandeira NO 80 delta N, apresenta atividades de deslizamento de nucleossomos semelhantes, indicando que a extremidade N-terminal do NO 80 e/ou suas subunidades associadas são dispensáveis para a remodelação de nucleossomos pelo complexo NO 80. Em contraste, o complexo purificado por meio da bandeira NO 80 delta n delta HSA é inativo neste ensaio, indicando que a atividade de remodelação depende do domínio HSA das APAs do NO 80 e/ou de suas subunidades associadas. Utilizando uma modificação do procedimento do ensaio de deslizamento de NUCLEOSSOMO, pode-se medir a atividade de ligação ao nucleossomo de complexos remodeladores da cromatina.Neste experimento, a incubação dos nucleossomos com quantidades crescentes de complexos NO 80 intactos, purificados por meio da subunidade E do NO 80, levou à desaparição dependente da dose da banda correspondente aos mononucleossomos livres e ao surgimento de uma nova espécie deslocada que migrou próximo ao topo do gel. Em contraste, quando os nucleossomos foram incubados com complexos menores, purificados por meio do NO 80 delta N e que careciam de um subconjunto de subunidades do NO 80, a espécie deslocada migrou mais rapidamente, sugerindo que a mobilidade relativa da banda superdeslocada é determinada pelo tamanho dos complexos no ensaio. Neste experimento final, são apresentados os resultados de um ensaio que compara as atividades de APAs ativadas por DNA e por NUCLEOSSOMOS de dois subcomplexos diferentes do NO 80.As manchas que migram mais lentamente correspondem ao TP alfa marcado com 32P no ponto inicial, e as espécies que migram mais rapidamente são os produtos da reação ADP, com as áreas indicando a direção da migração do solvente. Ao utilizar esses procedimentos, é importante lembrar-se de realizar ensaios que variem no tempo de duração e que contenham diferentes concentrações de enzima. Isso garantirá que as medições sejam feitas quando as curvas de resposta do produto em função do tempo e da dose forem lineares.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como analisar as atividades de ligação ao nucleossomo e deslizamento do nucleossomo em complexos de remodelação da cromatina purificados. Não se esqueça de que trabalhar com materiais radioativos pode ser perigoso. Deve-se tomar precauções, como usar jaleco e proteção ocular, monitorar contaminação radioativa e descartar adequadamente os resíduos radioativos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este protocolo descreve como imunoprecipitação da cromatina (chip) é usado para estudar as alterações dinâmicas ao modelo de cromatina que regulam a transcrição induzida por uma via de transdução de sinal.

Cromatina imunoprecipitação (chips) para a Modificação do ensaio dinâmico Histone na expressão dos genes ativados em células humanas

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Cromatina Análise de Interação com Emparelhados Fim-Tag Sequencing (Chia-PET) para mapeamento Interações cromatina e Compreensão regulação da transcrição

Descrevemos um protocolo básico para quantificar a atividade da ATPase in vitro. Este protocolo pode ser otimizado com base no nível de atividade e requisitos para uma determinada ATPase purificada.

Medindo<em&gt; In Vitro</em&gt; Actividade ATPase para enzimática Caracterização

Extração de sal sequencial das proteínas da cromatina vinculada é uma ferramenta útil para determinar as propriedades de vinculação de grandes complexos de proteínas. Esse método pode ser empregado para avaliar o papel das subunidades individuais ou domínios na afinidade total de uma proteína complexa em massa de cromatina.

Extrações de sal sequenciais para a análise da cromatina em massa vincular propriedades de cromatina modificando complexos

Este protocolo descreve a utilização combinatória de ChIP-seq, seq-4sU, RNA total-seq e Ribossoma profiling para linhas de células e as células primárias. Permite rastreamento de alterações em fator de transcrição vinculativas, novo de transcrição, processamento de RNA, volume de negócios e tradução ao longo do tempo e exibindo o curso geral dos acontecimentos nas células ativadas e/ou rápida mudança.

Análise em tempo real do fator de transcrição, ligação, transcrição, tradução e volume de negócios para exibir eventos globais durante a ativação celular

Inibidores de acetiltransferases de histona (HATs, também conhecidos como acetiltransferases de lisina), como CBP/p300, são potenciais terapêuticos para o tratamento do câncer. No entanto, são necessários métodos rigorosos para validar esses inibidores. Três métodos in vitro para validação incluem ensaios HAT com acetiltransferases recombinantes, imunoblotting para acetilação de histona na cultura celular, e ChIP-qPCR.

Ensaios para validação de inibidores de acetiltransferase histone

Este protocolo concentra-se na preparação de cromatina a partir de tecidos congelados instantâneos e é adequado para Imunoprecipitação de Cromatina de Reticulação (X-ChIP) seguida de análise quantitativa de PCR (X-ChIP-qPCR) ou abordagens de sequenciamento de próxima geração (X-ChIP-seq).

Extração de cromatina de tecido hepático quimérico congelado para análise de imunoprecipitação de cromatina

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Espectroscopia de CD para estudar interações DNA-proteína

Este protocolo descreve uma bateria de métodos que inclui cromatografia analítica de exclusão de tamanho para estudar a oligomerização e estabilidade da histona chaperona, ensaio pull-down para desvendar interações histona-histona-histona, AUC para analisar a estequiometria dos complexos proteicos e ensaio de chaperoning de histonas para caracterizar funcionalmente uma suposta histona chaperone in vitro.

In vitro Caracterização de Chaperones de Histonas utilizando Ensaios Analíticos, Pull-Down e Chaperoning

A cortina de DNA, uma técnica de imagem de molécula única de alto rendimento, fornece uma plataforma para visualização em tempo real de diversas interações proteína-DNA. O presente protocolo utiliza a técnica de cortina de DNA para investigar o papel biológico e o mecanismo molecular de Abo1, uma Schizosaccharomyces pombe contendo bromodomínio AAA+ ATPase.

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Ensaios químicos rápidos e precisos para triagem de inibidores específicos são uma ferramenta importante no arsenal de desenvolvimento de fármacos. Aqui, apresentamos um ensaio químico escalável de acetil-clique para medir a inibição da atividade de acetilação do HAT1.

Um ensaio químico de acetil-clique para medir a acetilação de histona acetiltransferase 1

Aprenda ensaios bioquímicos para analisar enzimas de remodelação cromatina dependente de ATP usando EMSA e cromatografia em camada fina. Este método permite medir deslizamento de nucleossomos e atividade ATPase.

Os ensaios bioquímicos para analisar as actividades de ATP-dependente cromatina remodelação Enzimas

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