Name: Stab ferida ferimento do peixe-zebra adulto Telencéfalo: Um método para investigar Vertebrados Cérebro Neurogênese e Regeneração (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-04T23:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Aprenda a induzir lesões mecânicas no telencéfalo de peixe-zebra adulto para estudar neurogênese e regeneração cerebral. Este método utiliza imunohistoquímica e hibridização in situ para analisar proliferação celular e respostas gliais pós-lesão.

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Agradecemos a N. Borel e sua equipe de fish house, M. Rastegar pela ajuda com a microscopia e T. Dickmeis pelos comentários sobre o manuscrito. Agradecemos o apoio da EU IP ZF-Health, FP7-HEALTH-2007-B2, NeuroXsys, da Rede Interreg de Biologia Sintética no Vale do Alto Reno (NSB-Alto Reno) e da rede financiada pelo BMBF EraSysBio.

Zebrafish foram mantidos nas instalações do Instituto de Toxicologia e Genética (ITG) em Karlsruhe Institute of Technology (KIT) peixes. Experimentos em animais foram realizados de acordo com as normas alemãs de proteção animal e foram aprovados pelo Governo de Baden-Württemberg, Regierungspräsidium Karlsruhe, Alemanha (Aktenzeichen 35-9185.81/G-272/12 &#39;Adulte Neurogenese&#39;). 1. Gerando uma facada no telencéfalo <ol><li> Anestesia <ol><li> Para preparar uma solução de estoque de tricaína (éster etílico do ácido 3-amino, também chamado de acetato de 3-aminobenzoato) utilizar 400 mg de pó tricaina e dissolvê-lo em 97,9 ml de água e 2,1 ml de tampão Tris 1 M / HCl (pH 9). Ajustar o pH a 7. Faça alíquotas de 5 ml e armazená-las a -20 ° C até utilização. </li><li> Transferir um número adequado de peixe-zebra 0,5-1 anos de idade a partir de seus tanques em gaiolas de plástico do mouse. Nota: O crânio de um peixe-zebra adulto em cerca de 12meses de idade é ainda relativamente macios e podem ser facilmente perfurado com uma agulha (ver secção 1.2.3 e Figura 1A). </li><li> Para anestesiar o peixe-zebra adultos, combinar 5 ml tricaína (solução estoque) numa gaiola de plástico com cruzamento ~ 100 ml de água do tanque de peixes limpo (concentração final de tricaina 0,02% (w / v) tricaina). </li><li> Incubar os peixes nos anestésicos até que eles não se movem mais (45-60 seg.) </li></ol></li><li> Lesão telencéfalo <ol><li> Local indivíduo anestesiado zebrafish em uma fenda em um bloco de espuma encharcada de tricaina. </li><li> Sob um microscópio de dissecação com a luz do alto segurar delicadamente o peixe com uma mão e orientá-la de uma forma que permite o acesso à cabeça de cima. </li><li> Com a outra mão empurrar uma seringa de 30 G (seringa de insulina com agulha integrado) verticalmente através do crânio na região medial de um hemisfério telencefálico (Figuras 1A-1B). Os hemisférios do telencéfalo de umre visível através do crânio. Certifique-se de que a lesão não é introduzido mais profundo do que 2 mm (Figura 1C). Nota: É altamente recomendado para introduzir a lesão sempre no mesmo hemisfério para facilitar a identificação do local da lesão quando dissecar o cérebro fora do crânio. </li><li> Depois de apresentar a lesão telencefálico, coloque o peixe em água de peixe fresco. Mantenha-se 10 peixes em uma gaiola de 2 L rato cheio de peixes de água para a recuperação e se conectar a gaiola do rato para um sistema de fluxo de água. Nota: A taxa de sobrevivência é geralmente ~ 97% se os peixes estão saudáveis ​​e sem outros experimentos foram realizados com o peixe antes. A adição de antibióticos para o peixe de água não é necessária. Após a recuperação, os peixes se comportam normalmente: eles nadam, alimentação, e companheiro. </li></ol></li></ol> 2. Analisando o efeito da lesão telencefálico <ol><li> Cérebro Dissecção e Fixação <ol><li> Re-anestesiar os peixes recuperados em diferentes pontos de tempo após a lesão (typically, 1, 3, 5, e 14 dias após a lesão (DPL)) com 0,02% (w / v) tricaina como acima e eutanásia, colocando-os em água gelada durante 5 minutos. </li><li> Coloque o peixe em um lenço de papel embebido em tampão fosfato (PBS) e separar a cabeça do corpo, cortando atrás das guelras com uma tesoura afiada. </li><li> Manter as cabeças em 1x PBS, durante 5 minutos, a fim de permitir que o sangramento. Nota: Este drena o sangue do tecido, o que pode perturbar outras medidas no protocolo. </li><li> Fixar as cabeças durante a noite a 4 ° C em paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS ou 4 horas à temperatura ambiente (RT). </li><li> Lavar as cabeças fixas duas vezes com PBS 1x numa placa de petri. </li><li> Dissecar cérebros cuidadosamente em 1x PBS sob um microscópio de dissecação 23. A lesão é normalmente visível sob o microscópio de dissecação. Cérebros sem lesão visível deve ser descartada. </li><li> Transferir os cérebros em dois tubos de reacção ml cheios com 1,5 ml de 100% de metanol (MeOH) e inverter os tubos antes da incubação de 5xlas a -20 ° C durante pelo menos 16 horas. Nota: Os cérebros pode ser mantido durante vários meses em MeOH à temperatura de -20 ° C até serem necessários para a imuno-histoquímica, ou hibridação in situ. </li></ol></li><li> Preparação de tecidos para Imunohistoquímica <ol><li> Re-hidratar os cérebros através de uma série descendente de metanol em 2 ml de tubos de plástico (sequencialmente 75% MeOH (1 x PBS, 0,1% de Tween-20 = PTW);. De 50% de MeOH, 25% de MeOH Incubar os cérebros (15 cérebros / 2 ml com tubos de reacção ) durante 5 minutos em cada solução. </li><li> Lave os cérebros em PTW durante 5 min. Repita 4x com fresco PTW. </li></ol></li><li> Incorporação dos cérebros para Seccionamento <ol><li> Para a incorporação, transferir os cérebros a partir do tubo de reacção de 2 ml em PTW para dentro das cavidades de um tabuleiro de copo de moldagem de polietileno com uma pipeta de transferência (5 mm de diâmetro). </li><li> Prepare a 2% de agarose (grau de ADN) em 1x PBS num frasco de Erlenmeyer. Aqueça no microondas a 600 W até que a agarose é dissolvido completamente. Preparar 50 ml de 10 cérebros. Vamos ªe agarose a arrefecer durante 3 minutos à temperatura ambiente antes do uso. Manter a agarose sobre um bloco de aquecimento pré-aquecida (60 ° C), enquanto que a incorporação de cérebro, a fim de evitar a solidificação. </li><li> Remover o PBS 1x do molde contendo um cérebro utilizando uma pipeta de Pasteur (1 mm de diâmetro). Tenha cuidado para não danificar o cérebro. </li><li> Despeje agarose no molde e preenchê-lo completamente. Em seguida, use uma agulha de dissecção a girar o cérebro da agarose para lavar o PTW, tornando mais fácil para incorporar o cérebro. </li><li> Oriente o cérebro de bolor lado ventral para baixo, lado dorsal para cima e colocá-lo em linha reta. </li><li> Deixe o agarose esfriar. Para resfriamento mais rápido, coloque o molde no gelo. Repetir passos. </li><li> Repetir 2.3.3-2.3.6 para todos os cérebros. </li></ol></li><li> Corte do Bloco de agarose <ol><li> Usando uma agulha de dissecação, retire o bloco de agarose. </li><li> Com uma lâmina afiada, corte a agarose na extremidade posterior do cérebro. Certifique-se que este plano é paralelo ao telencephalon. </li><li> Cortar a agarose na extremidade anterior do cérebro. Em seguida, virar o bloco de modo que esteja no plano posterior. </li><li> Remover o excesso de agarose por corte em paralelo com dorsal do cérebro e lados ventral. Em seguida, virar o cérebro de volta para que ele fique do seu lado ventral. </li><li> Cortar o bloco a um triângulo truncado, em que o telencéfalo está localizado no plano menor (Figura 2). </li></ol></li><li> Preparando o Vibratome para Seccionamento <ol><li> Prepare vibratome acordo com as instruções do fabricante. Use uma nova lâmina de barbear e substituí-lo após 10 cérebros. </li><li> Encher o banho tampão com 1x PBS para um nível que apenas atinge o fundo da lâmina. </li><li> Coloque um pequeno ponto de supercola sobre o topo do disco de amostra de vibratome. </li><li> Com cuidado, coloque o avião que está localizado posterior ao cérebro sobre a supercola. A cola vai endurecer logo que ele se encontra em contacto com o 1x PBSo banho de tampão vibratome. </li><li> Insira o disco de amostra com a amostra na bandeja de tampão usando o manipulador do micrótomo. </li><li> Use o manipulador para rodar o disco de amostra para a posição desejada. Orientar o bloco no banho de tampão de uma maneira que localiza o telencéfalo logo abaixo da superfície, com a parte dorsal da cabeça voltado para a lâmina. Em seguida, aperte o SCRW com uma chave Allen de 3 mm e remova o manipulador. Nota: O parafuso de fixação ou de um dos dispositivos de fixação não deve estar localizado sobre a abertura no disco de amostra; nestas posições de aperto do disco de amostra não é possível. </li></ol></li><li> Seccionamento do Cérebro <ol><li> Prepare uma placa de 24 poços para recolher as seções. Por cérebro a ser seccionado, preencher uma cavidade com 1 mL de tampão de bloqueio (0,1% (v / v), 10% de Tween-20, 0,2% (w / v) de albumina de soro bovino (BSA), 1% (v / v) dimetil-sulfóxido (DMSO) em PBS). </li><li> Comece o corte em 50 mM espessura, 1mm / s de velocidade e freqüência de 70 Hzutilizando um micrótomo de vibração. </li><li> Use uma escova sintética (1 mm) para pegar as fatias finas de agarose como eles saem da lâmina e coletá-los na placa de 24 poços. </li></ol></li><li> Imunohistoquímica em Vibratome Seções <ol><li> Bloquear sítios de ligação não específicos durante 1 h à TA, em tampão (0,1% (v / v), 10% de Tween 20, 0,2% (w / v) de BSA, 1% (v / v) de DMSO em PBS) de bloqueio. </li><li> Remover o sobrenadante e adicionar 250 ul de anticorpo diluído em tampão de bloqueio, durante a noite a 4 ° C. Alternativamente, a incubação do anticorpo primário durante 2 horas à temperatura ambiente. Em seguida, lave 3x por 10 min em PTW. Nota: Para a coloração PCNA usar uma diluição 1:400 (mouse anti-PCNA Para mais detalhes veja a tabela de materiais.). Os anticorpos primários múltiplos podem ser incubadas, ao mesmo tempo. </li><li> Incubar as secções em anticorpo secundário durante 2 h à RT, em seguida, lavar 3x durante 10 minutos em PTW. Nota: 1:1.000 diluição em PTW, para o detalhe veja tabela de materiais. Anticorpos secundários múltiplos podem ser incubadas, ao mesmo tempo. </li><li&gt; Opcional: Os melhores resultados são observados quando as secções são mantidas em PTW durante a noite a 4 ° C, a fim de permitir uma lavagem de anticorpos secundários não-especificamente ligadas. Neste caso, substitua o PTW, mais uma vez antes da montagem. </li></ol></li><li> RNA cérebro adulto in situ Hybridization (alternativamente para imuno-histoquímica) <ol><li> Cérebro Dissecção e Fixação (mesmo procedimento que para imuno-histoquímica): <ol><li> Hibridização de sonda. </li><li> Rehidratar cérebros em dois tubos de reacção ml como descrito por imuno-histoquímica. </li><li> Incubar cérebros em proteinase K (ProtK;. 10 ug / ml de concentração final) em PTW durante 30 min. Após o tempo de incubação remover ProtK / PTW e fixar os cérebros novamente durante 20 min em BT-Fix (PFA a 4%, 4% de sacarose, 0.12 mM de CaCl2, 77 mM de Na 2 HPO 4, 23 mM de NaH 2 PO 4). </li><li> Lavar cérebros 5x durante 5 minutos em PTW (0,1% (v / v) de Tween-20 em PBS). </li><li> Remover PTW e lave o cérebro em 500 mLTampão HYB (50% (v / v) de formamida desionizada, 5x SSC, 500 ug / ml de tRNA de levedura, 50 ug / ml de heparina, 0,1% de Tween-20, 9 mM citricacid). Espere até que o cérebro afundar para o fundo do tubo, em seguida, descartar o sobrenadante e adicionar 500 ul de tampão HYB limpo e incubar a 65-70 ° C durante 3-4 horas. </li><li> Dilui-se a sonda de RNA de 1:200 ou 1:400 (dependendo da sonda) em 400 ul de volume final de tampão HYB. Aquece-se a sonda de RNA diluído a 70 ° C durante 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante a partir de cérebros e adicionar a sonda de RNA, incuba-se a 65-70 ° C (S / N). Todas as soluções-tampão de lavagem deve ser pré-aquecida e mantida a 70 ° C. </li></ol></li><li> Labeling <ol><li> Lave os cérebros a 65-70 ° C (durante todas as quatro fases de lavagem) com 500 ul de tampão de lavagem 1 (50% de formamida, 1 x SSC, 0,05% Tween 20), duas vezes, durante 30 min. Substituir um tampão por tampão de 2 (2 x SSC, 0,1% de Tween 20), e incubar durante 15 min. Remover o tampão de lavagem 2 e cérebros em tampão 3 (0,2 x SSC, 0,1% de Tween 20) for 30 min, repita este passo 2 duas vezes. Substituir tampão 3 por intermédio 4 (0,1 x SSC, 0,05% de Tween 20 em PTW), incubar durante 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante e lava-se durante 5 minutos em 500 ul de PTW à TA. </li><li> Cérebros incorporar em agarose a 2% (em PBS 1x) e cortar secções vibratome (50-100 um), como descrito para a imuno-histoquímica. </li><li> Lavar 1x durante 5 minutos em 500 ul de tampão de bloqueio (1 x PBS, 0,1% de Tween-20, 0,2% (w / v) de BSA, 1% (v / v) DMSO). </li><li> Remover o sobrenadante e adicionar 500 ul de tampão de bloqueio durante 2 horas à temperatura ambiente. </li><li> Remover o sobrenadante e adicionar 300 ul de anti-Dig anticorpo acoplado a AP diluída 1:4.000 em tampão de bloqueio. </li><li> Incubar o / n, a 4 ° C. </li></ol></li><li> NBT / BCIP Coloração <ol><li> Lavar 5x durante 15 min com tampão de PTW à TA. </li><li> Lavar 1x em tampão de coloração. Lavar duas vezes 5 min em tampão de coloração (100 mM Tris / HCl pH 9,5, 50 mM de MgCl 2, 100 mM de NaCl, 0,1% de Tween-20). </li><li> Remover o sobrenadante e mancha com 500 μl solução de coloração (3,5 ul de cloreto de tetrazólio 4-Nitroblue (NBT) e 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP) por 1 ml de tampão de coloração). </li><li> Pare de coloração de lavagem 3 a 5 vezes com PTW. </li></ol></li></ol></li><li> Montagem das Seções <ol><li> Montar as seções em slides usando um meio de montagem não fluorescente solúvel em água (consulte a tabela de materiais). </li><li> Mantenha os slides na geladeira a 4 ° C. Nota: A coloração é estável durante várias semanas ou mesmo meses. </li><li> Analisar os slides no âmbito de um composto ou um microscópio confocal. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+brain%3A+significant+answers+and+significant+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions.</a> Neuron. 70, 687-702 (2011).</li>
<li>Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+and+brain+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish.</a> Dev Neurobiol. 72, 429-461 (2012).</li>
<li>Robel, S., Berninger, B., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stem+cell+potential+of+glia%3A+lessons+from+reactive+gliosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The stem cell potential of glia: lessons from reactive gliosis.</a> Nat Rev Neurosci. 12, 88-104 (2011).</li>
<li>Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dissection+of+reactive+astrogliosis+and+glial+scar+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation.</a> Trends Neurosci. 32, 638-647 (2009).</li>
<li>Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+zebrafish+-+from+embryo+to+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult.</a> Neural Dev. 8, 3(2013).</li>
<li>Zupanc, G. K., Sirbulescu, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+and+neuronal+regeneration+in+the+central+nervous+system+of+teleost+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis and neuronal regeneration in the central nervous system of teleost fish.</a> Eur J Neurosci. 34, 917-929 (2011).</li>
<li>Zupanc, G. K., Sirbulescu, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teleost+fish+as+a+model+system+to+study+successful+regeneration+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Teleost fish as a model system to study successful regeneration of the central nervous system.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 367, 193-233 (2013).</li>
<li>Adolf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+and+acquired+features+of+adult+neurogenesis+in+the+zebrafish+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon.</a> Dev Biol. 295, 278-293 (2006).</li>
<li>Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurogenesis+in+the+adult+zebrafish+brain%3A+origin%2C+proliferation+dynamics%2C+migration+and+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate.</a> Dev Biol. 295, 263-277 (2006).</li>
<li>Zupanc, G. K., Hinsch, K., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation%2C+migration%2C+neuronal+differentiation%2C+and+long-term+survival+of+new+cells+in+the+adult+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Proliferation, migration, neuronal differentiation, and long-term survival of new cells in the adult zebrafish brain.</a> J Comp Neurol. 488, 290-319 (2005).</li>
<li>Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+non-mammalian+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates.</a> Bioessays. 29, 745-757 (2007).</li>
<li>Hinsch, K., Zupanc, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+long-term+persistence+of+new+neurons+in+the+adult+zebrafish+brain%3A+a+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis.</a> Neuroscience. 146, 679-696 (2007).</li>
<li>Lindsey, B. W., Darabie, A., Tropepe, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+composition+of+neurogenic+periventricular+zones+in+the+adult+zebrafish+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The cellular composition of neurogenic periventricular zones in the adult zebrafish forebrain.</a> J Comp Neurol. 520, 2275-2316 (2012).</li>
<li>Marz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+progenitor+cell+subtypes+in+the+ventricular+zone+of+the+zebrafish+adult+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon.</a> Glia. 58, 870-888 (2010).</li>
<li>Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+response+following+stab+injury+in+the+adult+zebrafish+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon.</a> Dev Dyn. 240, 2221-2231 (2011).</li>
<li>Grandel, H., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+adult+neural+stem+cell+activity+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates.</a> Dev Genes Evol. 223, 131-147 (2013).</li>
<li>Ayari, B., El Hachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prokineticin+2+expression+is+associated+with+neural+repair+of+injured+adult+zebrafish+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon.</a> J Neurotrauma. 27, 959-972 (2010).</li>
<li>Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stab+wound+injury+of+the+zebrafish+telencephalon%3A+a+model+for+comparative+analysis+of+reactive+gliosis%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis.</a> Glia. 60, 343-357 (2011).</li>
<li>Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+regeneration+in+a+zebrafish+model+of+adult+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury.</a> Dis Model Mech. 5, 200-209 (2012).</li>
<li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+neurogenesis+from+neural+progenitor+cells+requires+injury-induced+expression+of+Gata3%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3.</a> Dev Cell. 23, 1230-1237 (2012).</li>
<li>Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138, 4831-4841 (2011).</li>
<li>Kyritsis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+inflammation+initiates+the+regenerative+response+in+the+adult+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain.</a> Science. 338, 1353-1356 (2012).</li>
<li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+organs+from+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of organs from the adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (37), (2010).</li>
<li>Shin, J., Park, H. C., Topczewska, J. M., Mawdsley, D. J., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+cell+fate+analysis+in+zebrafish+using+olig2+BAC+transgenics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Neural cell fate analysis in zebrafish using olig2 BAC transgenics.</a> Methods Cell Sci. 25, 7-14 (2003).</li>
<li>Armant, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide%2C+whole+mount+in+situ+analysis+of+transcriptional+regulators+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide, whole mount in situ analysis of transcriptional regulators in zebrafish embryos.</a> Dev Biol. 380, 351-362 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Descrevemos aqui um método para induzir uma lesão telencefálico empurrando uma agulha através do crânio do peixe-zebra adulto, e analisar a reação celular e molecular para esta lesão por imuno-histoquímica e hibridização in situ. A principal vantagem desta técnica em relação a outras abordagens existentes é a sua simplicidade, rapidez e eficiência de custos. Portanto, esta técnica, que permite a produção de muitos cérebros feridas num curto período de tempo, pode ser facilmente combinada com um grande escala na tela de hibridação in situ para identificar genes com um papel na regeneração e neurogenesis. A idade do peixe-zebra adultos em que a lesão é realizada é crucial. Se o peixe estiver com mais de 1,5 anos, o crânio é muito difícil e é possível que o crânio está sendo empurrada para baixo ou fraturado em vez de forma limpa perfurado. Em contraste, nos peixes mais jovens (menores de 4 meses), ainda há um monte de neurogênese em curso, o que pode lead a resultados falsos positivos em relação a neurogênese reativa. Outro passo fundamental nesta abordagem é verificar a eficiência da facada e de excluir que os dois hemisférios são feridos. Isto pode ser monitorizado através da coloração das secções com o anticorpo anti-PCNA. Em uma lesão introduzida correctamente, PCNA deve ser significativamente sobre-regulada em apenas um dos hemisférios. É importante ter em mente que a lesão mecânica induzida vai ter vários efeitos secundários, tais como a ablação não específica de células, o aumento da morte celular por causa da degeneração secundária, inflamação e destruição da barreira sangue-cérebro, e lesão da zona ventricular e quanto uma possível consequência de fluxo do fluido cerebrospinal para o parênquima cerebral. No entanto, os peixes feridos parecem sofrer muito pouco da lesão. Dentro de 2 min eles são natação livre novamente e comportamento normal de alimentação é restaurada dentro de cerca de 4 horas. Após 3 semanas, o injury não é morfologicamente mais visível. Em nossas mãos, a partir de várias centenas de cirurgias não perdemos um único peixe, apesar do fato de que nós tivemos uma taxa de lesões 100%, avaliada pela histologia em 5 dias após a lesão. Nos últimos anos, outras técnicas, tais como as abordagens transgénicas têm sido desenvolvidos em peixes-zebra para produzir tecido ou ablação específica de células tipo 2. Embora estas técnicas são muito elegante e minimamente invasivo que se baseiam na produção de construções de ADN complexas e a criação de várias linhas de peixes-zebra transgénicos estáveis ​​que podem ser muito tediosa e morosa. Portanto, abordagens mecânicas simples, tais como o ensaio descrito no presente protocolo permanecer uma ferramenta importante para estudar a neurogénese cérebro adulto e regeneração.

Mamíferos têm uma capacidade muito limitada para gerar novos neurônios durante a vida adulta, e neurogênese adulta no cérebro é mais restrita a duas regiões telencefálicos situados na zona subventricular (SVZ) dos ventrículos laterais, ea zona subgranular (SGZ) do dentado circunvolução do hipocampo 1. Mamíferos também não pode reparar os danos do cérebro causada por doenças neurodegenerativas, acidente vascular cerebral ou lesões, de forma eficiente. Neurónios perdidos não são substituídos e, em vez da proliferação de diferentes tipos de células gliais, incluindo os astrócitos, micróglia, oligodendrócitos e é observado. Como consequência deste processo proliferativo chamado gliose reactiva, o tecido cerebral ferido é vedada pela formação de uma cicatriz glial, que inibe a regeneração axonal neuronal e 2-4. Em contraste com os mamíferos, peixes teleósteos, como o peixe-zebra formar novos neurônios abundantemente em estágios adultos e têm um alto regenerativa e proliferative potencial para reparar lesões do sistema nervoso central 2,5-7. O cérebro adulto zebrafish contém 16 nichos de células estaminais neurais distintos que geram um grande número de novos neurónios, durante toda a vida de 8-11. Neurônios nascidos nessas zonas específicas de proliferação do cérebro adulto zebrafish migrar para suas áreas-alvo, onde eles vão amadurecer e integrar as redes neuronais existentes 8,10,12-15. Entre as zonas de progenitoras identificados em peixes-zebra adultos, a zona ventricular telencefálicos é um dos nichos de células estaminais neuronais, mais estudados. Células neste nicho progenitor pode ser classificada em três tipos distintos quanto à sua morfologia, a taxa de divisão e expressão de diferentes marcadores glial ou neuronal. Tipo I e tipo II são células da glia radial como células que possuem processos longos. Eles expressam marcadores de células-tronco, incluindo GFAP, nestin e S100β. O tipo I de células não proliferam enquanto que células do tipo II proliferate lentamente, como evidenciado pela sua expressão de marcadores de proliferação, tais como antigénio de proliferação celular nuclear (PCNA) e a incorporação de análogos desoxythymidine. As células do tipo III estão rapidamente dividindo células que estão empenhados em tornar progenitores neurais e expressar genes marcadores neurais, tais como PSA-NCAM 5,16. Embora as capacidades regenerativas de peixes teleósteos estão bem documentados, apenas poucas publicações têm descrito e investigado em detalhe os mecanismos celulares e moleculares envolvidos na regeneração neuronal no telencéfalo adulto em resposta à lesão 15,17-22. Para decifrar os mecanismos implicados no adulto zebrafish regeneração do sistema nervoso central e reparação e para entender as semelhanças e as diferenças entre a neurogênese constitutiva e regenerativa, desenvolvemos um modelo de peixe-zebra de lesão telencefálico adulto. Aqui, vamos descrever visualmente como gerar uma lesão em um dos hemisph telencefálicoeres com a ajuda de uma agulha de seringa, mantendo a lateral não lesionado contralateral como controlo interno. Também vamos mostrar como monitorar mudanças sobre lesão na proliferação celular e expressão gênica por imuno-histoquímica e em ensaios de hibridização in situ.

<table><tbody><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>335.2</td><td></td></tr><tr><td>10x DPBS (-/-)</td><td>Life technologies</td><td>14200-083</td><td></td></tr><tr><td>seringa 30 G (Omnican 40)</td><td>B.Braun Melsungen</td><td>916162</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja de copo de moldagem de polietileno&nbsp;</td><td>Polysciences, Inc</td><td>17177C-3</td><td></td></tr><tr><td>PeqGOLD Universal Agarose&nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>35-1020</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Biochrom</td><td>W 2835919108</td><td></td></tr><tr><td>Aqua Poly / Mount</td><td>Polysciences, Inc</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Carl Roth</td><td>9127.1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Carl Roth</td><td>A994.2</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de dissecção</td><td>Carl Roth</td><td>KX93.1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Carl Roth</td><td>335.2</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 414</td><td>Sch&ouml; ffler und W&ouml; rner</td><td><a href="http://62.157.117.162/BP2NAV500/ItemDetail_NAV.aspx? ItemID=06%201362%200020">06 1362 0020</a></td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de vidro</td><td>Labonord</td><td>5305103</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas 24 x 60 mm</td> Placas <td>de Petri</td><td>Labonord</td> 5305060<td></td></tr><tr><td>, 94 mm</td><td>Greiner bio-one</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Falcon, 15 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>placa de 24 poços</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>Anti-S100 (1:500)</td><td>Dako</td><td>Z031101-2</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PCNA (1:400)</td><td>Dako</td><td>M087901</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP (1:1,000)</td><td>Aves Labs</td><td>GFP-1020</td><td></td></tr><tr><td>anti-Dig AP-coupled antibody&nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP)&nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1383221</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de tetrazólio 4-nitroazul (NBT)&nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1383213</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1092766</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja de copo de polietileno para moldagem&nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>17177C-3</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome VT1000S</td> Microscópio Confocal <td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sp5 DM6000</td><td>Microscópio</td> de dissecação Leica <td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon SMZ 645</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos de fundo plano de 24 poços&nbsp;</td><td>Catálogo Falcon&nbsp;</td><td></td><td></td>353226</tr><tr><td>Estudante Dumont #5 Fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Danio rerio Tg(olig2:EGFP)</td><td>Shin et al.24</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Danio rerio Cepas WT (e.g., AB2O2)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

stab ferida ferimento do peixe-zebra adulto telencéfalo: um método para investigar vertebrados cérebro neurogênese e regeneração

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Peixe-zebra adulto tem uma incrível capacidade de regenerar seu sistema nervoso central após a lesão. Para investigar a resposta celular e os mecanismos moleculares envolvidos no peixe-zebra adulto sistema nervoso central (SNC) de regeneração e reparo, foi desenvolvido um modelo de peixe-zebra de lesão telencefálico adulto. Nesta abordagem, podemos gerar manualmente uma lesão, empurrando uma seringa de agulha de insulina para o telencéfalo adulto zebrafish. Em diferentes dias de lesões post, peixe são sacrificados, seus cérebros são dissecados e corados por imuno-histoquímica e / ou hibridização in situ (ISH) com marcadores apropriados para observar a proliferação celular, gliogenesis e neurogênese. O hemisfério contralateral não lesionado serve como um controle interno. Este método combinado, por exemplo, com RNA profundo seqüenciamento pode ajudar a tela de novos genes com um papel em zebrafish neurogênese adulta telencéfalo, regeneração e reparo.

Usando o fluxo de trabalho descrito neste artigo, a lesão foi introduzido no hemisfério direito do telencéfalo adulto zebrafish (Figuras 1A-1B). Um ferimento correcta leva a um canal que se estende a partir da lesão dorsal para ventral através de todo o palio do telencéfalo (Figura 3C). A lesão deve ser limitada a um dos hemisférios e não devem atravessar o ventrículo medial. O canal lesão é visível com microscopia de campo claro (Figura 3C) e será curado após aproximadamente 35 dias 15. Foi anteriormente demonstrado que após o ferimento uma sobre-regulação de proliferação celular do antigénio nuclear (PCNA, Figura 3A) e S100β (Figura 3B) em 3 a 7 DPL é detectável por imuno-histoquímica 15. A coloração de PCNA e S100β é sobreposta, indicando a proliferação de células gliais radiais. Furthermore, a fim de visualizar as células precursoras de oligodendrócitos (OPCs), um ensaio de facada ferida foi realizada na Tg (olig2: EGFP) de peixe 24. Após a coloração com um anticorpo anti-GFP, a acumulação de OPCs em estreita proximidade com o canal de lesão é detectável (Figura 3D). Esse acúmulo é transitória, e os clusters OPC não são mais observadas em 35 dpl 15. Se a lesão não foi introduzida correctamente, o canal lesão não será visível, e aumento da regulação do PCNA e S100β ou acumulação de OPCs não será detectável. PCNA é o marcador mais sensível para lesões cerebrais. A fim de verificar a eficiência da facada e de excluir que os dois hemisférios são feridos, é altamente recomendável para sempre manchar as seções com um anticorpo anti-PCNA. Em uma lesão introduzida correctamente, PCNA deve ser significativamente sobre-regulada (até 4 vezes 15) em apenas um dos hemisférios. Embora na maioria dos casos, ésuficiente para usar apenas o lado não lesionado contralateral como controle interno para monitorar mudanças na expressão gênica, é altamente recomendável para comparar a expressão gênica no hemisfério controle com a expressão em hemisférios telencefálicos de cérebros de tipo selvagem. Deste modo, quaisquer efeitos sistémicos da lesão na expressão do gene que iria afectar os dois hemisférios podem ser detectados. O ensaio de golpe de feridas em combinação com uma tela de expressão sistemática de reguladores da transcrição (TRs) (25 e Schmidt et al., Não publicado) pode também ser utilizado para identificar genes de TR, com um possível papel na neurogénese e regeneração (Figuras 4A-4C). Esta abordagem foi identificado um número de factores que são expressos no telencéfalo e cuja expressão é especificamente sobre-regulada, em resposta a uma lesão (Figura 4A-C). <imgalt = &quot;Figura 1&quot; fo: Content-width = &quot;5 polegadas&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51753/51753fig1highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 1. Representação esquemática do adulto zebrafish ferimento facada telencefálico. A) Uma agulha de seringa de insulina é empurrado através do crânio de um peixe-zebra adultos de gerar uma lesão telencefálica. A linha branca tracejada representa a fronteira entre os dois hemisférios telencefálicos ea cruz verde indica a posição do Vista dorsal facada. B) de um cérebro de peixe-zebra adulto. As principais áreas do cérebro são indicados. A cruz verde indica a posição da lesão induzida. C) A ponta da agulha, o que serve para induzir a lesão telencefálica, mede de 2 mm. Bulbo olfatório (OB), telencéfalo (tel) e tecto óptico (OT). <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Srepresentação chematic de um cérebro de peixe-zebra adulto em um bloco de agarose aparadas pouco antes vibratome corte. anterior é para cima. Bulbo olfatório (OB), telencéfalo (tel), tecto óptico (ot), cerebelo (CB) e medula (m). Barra de escala: 500 mm. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Respostas regenerativas para apunhalar lesão ferida. AD) Adulto cérebro de peixe-zebra em 5 dias após a lesão (DPL). AB) O PCNA proliferativa marcador (A) e o marcador glial radial S100β (B) são sobre-regulada na zona ventricular (setas) após ferimento por arma branca. (C) O canal de lesão é visível sob iluminação de campo claro (setas). A zona ventricular é indicada pela linha verde. (D) as células precursoras de oligodendrócitos (olig2: EGPF +) se acumulam no local da lesão (setas). Barra de escala: 200 um. Em todos os painéis, o hemisfério direito é o hemisfério lesionado. Dorsal é para cima. A linha tracejada na A a D indica a fronteira entre o Pálio ea subpallium. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4. Um exemplo de genes up-regulados em resposta a esfaquear lesão. Observe o forte aumento da regulação (setas) de eomesa (A, B) e sox4a (C) expressão de mRNA no hemisfério telencefálico direita (hemisfério esfaqueado) como monitorado por hibridação in situ em 5 DPL. O hemisfério esquerdo é ileso e serve como controle. (B) mostra uma maior ampliação da região telencefálico dorsal de A. Dorsal é para cima. Barra de escala: 200 mm para A e C e de 55 mm para B. Olinha tracejada na A e C indica a separação entre o Pálio ea subpallium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51753/51753fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table><tbody><tr><td colspan="2"> SIGLAS </td></tr><tr><td> AP </td><td> Fosfatase Alcalina </td></tr><tr><td> BCIP </td><td> 5-bromo-4-cloro-3&#39;-indolyphosphate </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Albumina de soro bovino </td></tr><tr><td> CNS </td><td> Sistema nervoso central </td></tr><tr><td> Escavação </td><td> Digoxigenina </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Dimetil sulfóxido </td></tr><tr><td> dpl </td><td> Dias após a lesão </td></tr><tr><td> eomesa </td><td> Eomesodermin homólogo um </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Proteína ácida fibrilar glial </td></tr><tr><td> hr </td><td> Hora </td></tr><tr><td> HYBamortecedor </td><td> Tampão de hibridação </td></tr><tr><td> ISH </td><td> a hibridação in situ </td></tr><tr><td> MeOH </td><td> Metanol </td></tr><tr><td> NBT </td><td> Nitro-azul de tetrazólio </td></tr><tr><td> OPCs </td><td> As células precursoras de oligodendrócitos </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Salina tamponada com fosfato </td></tr><tr><td> PCNA </td><td> Antígeno nuclear de proliferação celular </td></tr><tr><td> PFA </td><td> Paraformaldeído </td></tr><tr><td> ProtK </td><td> Proteinase K </td></tr><tr><td> PSA-NCAM </td><td> Molécula de adesão celular neuronal polissialilados </td></tr><tr><td> PTW </td><td> PBS, 0,1% de Tween-20 </td></tr><tr><td> RNA </td><td> Ácido ribonucléico </td></tr><tr><td> RT </td><td> A temperatura ambiente </td></tr><tr><td> SGZ </td><td> Zona subgranular </td></tr><tr><td> sox4a </td><td> SRY-box contendo 4a gene</td></tr><tr><td> SSC </td><td> Citrato de sódio salino </td></tr><tr><td> ZSV </td><td> Zona subventricular </td></tr><tr><td> TRs </td><td> Reguladores de transcrição </td></tr></tbody></table>

Para lançar luz sobre os mecanismos celulares e moleculares da neurogênese e regeneração do peixe-zebra adulto, desenvolvemos um protocolo para cirurgia invasiva causando lesões mecânicas no telencéfalo adulto do peixe-zebra e subsequente monitoramento de alterações no hemisfério esfaqueado por imuno-histoquímica ou hibridização in situ.

Stab ferida ferimento do peixe-zebra adulto Telencéfalo: Um método para investigar Vertebrados Cérebro Neurogênese e Regeneração

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

O objetivo geral do seguinte experimento é investigar a resposta celular e os mecanismos moleculares envolvidos na neurogênese adulta e na regeneração e reparação do sistema nervoso central. Em peixe-zebra, isso é alcançado primeiramente gerando manualmente uma lesão por punção no hemisfério céfalo do peixe-zebra adulto. Em seguida, cinco dias após a lesão, o peixe é sacrificado, seu cérebro é dissecado e embutido em aros para seccionamento em um ome.Em seguida, as secções cerebrais são coradas por imuno-histoquímica ou hibridação in situ com marcadores apropriados. Para observar a proliferação celular, gliogênese e neurogênese, obtêm-se resultados que mostram a superexpressão do marcador de proliferação PCNA, o marcador de células gliais radiais S100 beta e células precursoras de oligodendrócitos marcadas com EGFP no local, identificadas na zona ventricular após lesão por punção. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, que utilizam ablação específica de tecido ou tipo celular por abordagem transgênica, é a sua simplicidade, rapidez e eficiência, o que permite a produção de diversos cérebros lesados em pouco tempo.Após anestesiar peixes-zebra adultos, conforme o protocolo descrito no texto, posicione cada peixe individualmente em uma fenda em um bloco de papel de filtro umedecido com solução de trica, sob um microscópio estereoscópico com iluminação superior. Segure suavemente o peixe com uma das mãos e posicione-o de modo a permitir acesso à cabeça, por cima, com uma seringa equipada com agulha de calibre 30. Com a outra mão, introduza a agulha verticalmente através do crânio, até uma profundidade máxima de dois milímetros na região medial de um dos hemisférios cefálicos.Após induzir a lesão cefálica, coloque o peixe em água fresca para peixes. Quando concluído, transfira o peixe de volta ao sistema de fluxo de água. Após permitir que o peixe se recupere pelo período desejado e o eutanizá-lo de acordo com o protocolo descrito no texto, sacrifique-o sobre gelo e use uma tesoura afiada para cortar atrás das brânquias, separando a cabeça do corpo.Incube as cabeças em um XPBS durante cinco minutos para permitir a sangria. Em seguida, transfira as cabeças para paraformaldeído a 4% em PBS e incube durante a noite a quatro graus Celsius ou por quatro horas à temperatura ambiente após a fixação. Utilize um XPBS em uma placa de Petri para lavar as cabeças duas vezes.Em seguida, sob um microscópio estereoscópico, dissecar cuidadosamente os cérebros em PBS. Descartar quaisquer cérebros sem lesão visível. Transferir os cérebros para tubos de reação de dois mililitros contendo 1,5 mililitro de metanol a 100% e inverter os tubos cinco vezes antes de incubar a menos 20 graus Celsius por pelo menos 16 horas.Para reidratar o tecido para imunohistoquímica, incubar os cérebros por cinco minutos em cada série descendente de metanol antes de usar PBS tween 20 ou PTW para lavar os cérebros cinco vezes, por cinco minutos cada. Em seguida, para embutir os cérebros, usar uma pipeta de transferência para colocá-los nas cavidades de uma bandeja de moldagem de polietileno, dissolvendo 2% de agarose em 1x PBS aquecendo no micro-ondas a 600 watts.Deixe o agros esfriar por três minutos antes de usar. Em seguida, remova cuidadosamente o PTW de um cérebro antes de usar o aros para preencher completamente o molde. Utilize a agulha de dissecação para girar o cérebro no aros, removendo o PTW e posicionando o cérebro com o lado ventral para baixo, o lado dorsal para cima e alinhado corretamente, antes de deixar o agros esfriar.Usando uma agulha de dissecação, remova o bloco de agarose do molde. Em seguida, com a lâmina de barbear afiada, corte a agarose paralelamente ao tálamo cefálico na extremidade posterior do cérebro. Agora, corte a agarose na extremidade anterior do cérebro antes de virar o bloco de modo que ele fique apoiado no plano posterior.Remova o excesso de agarose fazendo cortes paralelos aos lados dorsal e ventral do cérebro. Em seguida, vire o cérebro novamente para que fique apoiado em seu lado ventral. Por fim, corte o bloco em um triângulo truncado no qual o cefalão está localizado no plano menor.Após preparar o viomo de acordo com as instruções do fabricante, use um XPBS para encher o banho de tampão até que este alcance exatamente a parte inferior da lâmina. Em seguida, coloque um pequeno ponto de cola supercola na parte superior do disco de espécime do vibrátomo. Depois, posicione cuidadosamente o plano do bloco que está localizado posteriormente ao cérebro sobre a cola supercola.Use o manipulador de micrótomo para inserir o disco de espécime na bandeja de tampão e gire o disco de espécime para a posição desejada. Em seguida, use uma chave Allen de três milímetros para apertar o parafuso e remova o manipulador. Posicione o bloco na banho de tampão de modo que o cefalópodo fique logo abaixo da superfície, com o lado dorsal do cérebro voltado para a lâmina, para seccionar os cérebros.Prepare uma placa de 24 poços para coletar as seções, adicionando um mililitro de tampão bloqueador por cérebro nos poços da placa com o microtomo vibratório. Inicie o corte com espessura de 50 micrômetros, velocidade de um milímetro por segundo e frequência de 70 hertz. Usando uma escova sintética, recolha as fatias finas de aros conforme saem da lâmina e colete-as na placa de 24 poços.Para realizar a imunohistoquímica, bloquee os sítios não específicos durante uma hora à temperatura ambiente. Após a incubação, remova o tampão e adicione 250 microlitros de anticorpo diluído em tampão de bloqueio, incubando durante a noite a quatro graus Celsius ou por duas horas à temperatura ambiente antes de usar PTW para lavar as amostras três vezes, por um minuto cada. Após a incubação e com anticorpos secundários por duas horas à temperatura ambiente.Lave as seções três vezes. Utilize um meio de montagem não fluorescente e solúvel em água para montar as seções. Em seguida, analise as amostras em um microscópio composto ou confocal.Quando realizada corretamente, uma lesão provoca um canal de ferida que se estende de dorsal a ventral através da palma do cefalópodo da cauda, o qual cicatrizará após 35 dias. Estudos prévios utilizando imunohistoquímica demonstraram que a lesão induz uma superexpressão de PCNA, S100 beta e um padrão sobreposto entre três e sete dias após a lesão, indicando proliferação de células gliais radiais.Esta figura demonstra uma acumulação transitória de células precursoras de oligodendrócitos ou OPCs em proximidade próxima a uma lesão por punção induzida em peixes transgênicos olig dois EEG FP, que já não é observada no dia 35 após a lesão. Se a lesão não for introduzida corretamente, o canal da lesão não será visível. Uma upregulação de PCNA e S100 beta ou acumulação de OPCs é indetectável.Como apresentado aqui, uma triagem de expressão sistêmica que compara reguladores da transcrição no cérebro de peixes com lesões versus cérebros do tipo selvagem identificou diversos fatores expressos no telencéfalo e que são regulados positivamente em resposta à lesão. O método de ferida por secção, combinado, por exemplo, com sequenciamento profundo de RNA e/ou hibridização in situ, pode ajudar a identificar novos genes envolvidos na neurogênese, regeneração e reparação em adultos de peixe-zebra.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo descreve a técnica de microdissecção do cérebro de um peixe-zebra adulto. Este método ajuda na obtenção de neurosferas derivadas de todo o cérebro que podem ser estudadas mais a fundo.

Dissecção do cérebro do peixe-zebra: uma técnica de neurobiologia de peixes

Neste artigo, é demonstrar um método para a manipulação da expressão de genes nas células dos ventrículos do telencéfalo peixe-zebra adultos utilizando oligonucleótidos anti-sentido morfolino. Apresenta-se este método como um protocolo eficiente e rápida, que pode ser utilizado para estudos funcionais no cérebro adulto vertebrado.

Micromanipulação de expressão gênica no cérebro adulto Zebrafish Usando microinjeção Cerebroventricular de Morpholino Oligonucleotides

Embora o sistema nervoso periférico (SNP) é capaz de reparação significativa após a lesão, pouco se sabe sobre os mecanismos celulares e moleculares que governam este fenómeno. Usando vivo, zebrafish transgênicos e um teste de secção do nervo reprodutível, podemos estudar os comportamentos de células gliais dinâmicas durante a degeneração do nervo e regeneração.

Motor Nerve transecção e Time-lapso de Comportamentos de células gliais em Zebrafish ao vivo

Após transecção espinhal, adulto zebrafish tem recuperação funcional por seis semanas após a lesão. Para tirar proveito da transparência larval e recuperação mais rápida, apresentamos um método para seccionar a medula espinhal larval. Após transecção, observamos recuperação sensorial começando em 2 dias após a lesão, e movimento C-curva por 3 dias após a lesão.

Transecção medular nos larval Zebrafish

Este protocolo descreve a síntese, caracterização e injeção de peptídeos monomérico amiloide-β42 para gerar toxicidade amiloide no zebrafish adulto para estabelecer um modelo de doença de Alzheimer, seguido de análise histológica e detecção de agregações.

Toxicidade do Amyloid-β42 de modelagem e neurodegeneração no cérebro adulto de Zebrafish

É apresentado aqui um método do Electroporation para a entrega do ADN do plasmídeo e a rotulagem da pilha ependymoglial no telencephalon adulto do zebrafish. Este protocolo é um método rápido e eficiente para visualizar e traçar células ependymogliais individuais e abre novas possibilidades para aplicar a eletroporação a uma ampla gama de manipulações genéticas.

Método de Electroporation para in vivo entrega de DNA plasmídeo no adulto zebrafish Telencephalon

Aqui apresentamos um método para a imagem do cérebro embrionário de zebrafish in vivo upto larval e juvenil estágios. Este procedimento microinvasivo, adaptado a partir de abordagens eletrofisiológicas, fornece acesso a detalhes celulares e subcelulares de neurônio maduro e pode ser combinado com estudos optogenéticos e neurofarmaológicos para caracterização da função cerebral e intervenção medicamentosa.

In vivo Imagem de Tecido Cerebral Totalmente Ativo em Larvas de Zebrafish Acordados e Juvenis por Remoção de Crânio e Pele

Modificamos o modelo de queda de peso de Marmarou para o zebrafish adulto para examinar uma amplitude de patologias após lesão cerebral traumática por força bruta (TCE) e os mecanismos subjacentes à regeneração neuronal subsequente. Este modelo de TBI de força bruta é escalável, induz um TCE leve, moderado ou grave, e recapitula a heterogeneidade da lesão observada no TBI humano.

Um modelo escalável para estudar os efeitos da lesão por força bruta em zebrafish adulto

Um modelo de lesão cerebral mecânica em peixes-zebra adultos é descrito para investigar os mecanismos moleculares que regulam sua alta capacidade regenerativa. O método explica para criar uma lesão por facada no tecto óptico de várias espécies de pequenos peixes para avaliar as respostas regenerativas usando imunomarcação fluorescente.

Modelo de Lesão por Arma Branca do Adulto Óptico Utilizando Zebrafish e Medaka para Análise Comparativa da Capacidade Regenerativa

Capaz de recuperação funcional após lesão medular, o zebrafish adulto é um sistema modelo de elucidar mecanismos inatas de regeneração neural. Aqui, descrevemos a resistência à natação e os ensaios de comportamento de natação como leituras funcionais da regeneração da medula espinhal.

Avaliação da resistência ao natação e comportamento de natação em zebrafish adulto

O presente protocolo descreve um método para induzir lesões específicas de tecido e altamente reprodutíveis em larvas de zebrafish usando um sistema de lesão a laser combinado com uma plataforma microfluida automatizada para o manuseio de larvas.

Lesões semi-automatizadas semi-automatizadas controladas por laser para estudar a regeneração da medula espinhal em larvas de zebrafish

Aprenda a induzir lesões mecânicas no telencéfalo de peixe-zebra adulto para estudar neurogênese e regeneração cerebral. Este método utiliza imunohistoquímica e hibridização in situ para analisar proliferação celular e respostas gliais pós-lesão.

Stab ferida ferimento do peixe-zebra adulto Telencéfalo: Um método para investigar Vertebrados Cérebro Neurogênese e Regeneração (Vídeo) | JoVE Journal

Stab ferida ferimento do peixe-zebra adulto Telencéfalo: Um método para investigar Vertebrados Cérebro Neurogênese e Regeneração

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