Stab ferida ferimento do peixe-zebra adulto Telencéfalo: Um método para investigar Vertebrados Cérebro Neurogênese e Regeneração

O objetivo geral do experimento a seguir é investigar a resposta celular e os mecanismos moleculares envolvidos na neurogênese adulta e na regeneração e reparo do sistema nervoso central. No peixe-zebra, isso é conseguido primeiro gerando manualmente uma lesão perfurando o hemisfério cefálico direito de um peixe-zebra adulto. Em seguida, cinco dias após a lesão, o peixe é sacrificado e seu cérebro é dissecado e embutido em aros para seccionamento em um ome.

Em seguida, os cortes cerebrais são corados por imuno-histoquímica ou em C dois hibridização com marcadores apropriados. Para observar a proliferação celular, são obtidos resultados de glio, agenesia e neurogênese que mostram a regulação positiva do marcador de proliferação, PCNA, o marcador radioglial S 100 beta e oli duas células precursoras de oligodendrócitos marcadas com EGFP marcadas na zona ventricular após o ferimento por facada. A principal vantagem desta técnica sobre o método existente toca a abordagem transgênica para produzir ablação específica de tecido ou tipo de célula é sua simplicidade, velocidade e eficiência de causa, o que permite a produção de muitos cérebros lesionados em um curto espaço de tempo.

Depois de anestesiar o peixe-zebra adulto, de acordo com o protocolo de texto, coloque os peixes individuais em uma fenda em um bloco de papel de seda embebido em trica sob um microscópio de dissecação com luz de cima. Segure suavemente o peixe com uma mão e oriente-o de forma a permitir o acesso à cabeça por cima com uma seringa equipada com uma agulha de calibre 30. Na outra mão, empurre a agulha verticalmente através do crânio, não mais do que dois milímetros na região medial de um hemisfério cefálico.

Depois de introduzir a lesão cefálica, coloque o peixe em água doce de peixe. Quando terminar, transfira os peixes de volta para o sistema de fluxo de água. Depois de permitir que os peixes se recuperem pelo período de tempo desejado e sacrificá-los de acordo com o protocolo de texto, sacrifique-os no gelo e use uma tesoura afiada para cortar atrás das guelras para separar a cabeça do corpo.

Incubar as cabeças num XPBS durante cinco minutos para permitir a sangria. Em seguida, transfira as cabeças para 4% de formaldeído em PBS e incube durante a noite a quatro graus Celsius ou por quatro horas em temperatura ambiente após a fixação. Use um XPBS em uma placa de Petri para lavar as cabeças duas vezes.

Em seguida, sob um microscópio de dissecação, disseque cuidadosamente os cérebros em PBS. Descarte todos os cérebros sem lesão visível. Transfira os cérebros para dois tubos de reação de mililitros cheios de 1,5 mililitros de metanol a 100% e inverta os tubos cinco vezes antes de incubá-los a menos 20 graus Celsius por pelo menos 16 horas.

Para reidratar o tecido para imuno-histoquímica, incube os cérebros por cinco minutos cada em uma série descendente de metanol antes de usar PBS tween 20 ou PTW para lavar os cérebros cinco vezes. Por cinco minutos cada. Em seguida, para incorporar os cérebros, use uma pipeta de transferência para colocá-los nas cavidades de uma bandeja de copo de moldagem de polietileno para dissolver 2%agros em um XPBS aquecendo-o em um microondas a 600 watts.

Deixe os agros esfriarem por três minutos antes de usar. Em seguida, remova cuidadosamente o PTW de um cérebro antes de usar aros para preencher totalmente o molde. Use a agulha de dissecção para girar o cérebro no aros para lavar o PTW e orientar o cérebro com o lado ventral para baixo, o lado dorsal para cima e posicione em linha reta antes de deixar o agros esfriar.

Usando uma agulha de dissecação, remova o bloco agros do molde. Em seguida, com a lâmina de barbear afiada, corte o agros paralelo ao cefalon da garra na extremidade posterior do cérebro. Agora corte o agros na extremidade anterior do cérebro antes de virar o bloco para que ele fique no plano posterior.

Remova o excesso de agros fazendo cortes paralelos aos lados dorsal e ventral do cérebro. Em seguida, vire o cérebro para trás para que ele fique do lado ventral. Finalmente, corte o bloco em um triângulo truncado no qual o céfalo está localizado no plano menor.

Depois de preparar o vioma de acordo com as instruções do fabricante, use um XPBS para encher o banho tampão de forma que ele atinja apenas a parte inferior da lâmina. Em seguida, coloque um pequeno ponto de supercola na parte superior do disco de amostra do vibrador. Em seguida, coloque cuidadosamente o plano do bloco localizado posteriormente ao cérebro na supercola.

Use o manipulador de micrótomo para inserir o disco de amostra na bandeja de buffer e gire o disco de amostra para a posição desejada. Em seguida, use uma chave Allen de três milímetros para apertar o parafuso e remover o manipulador. Posicione o bloco no banho tampão de modo que o céfalo fique logo abaixo da superfície com o lado dorsal do cérebro voltado para a lâmina para seccionar os cérebros.

Prepare uma placa de 24 poços para coletar as seções adicionando um mililitro de tampão de bloqueio por cérebro nos poços da placa com o micrótomo vibratório. Comece a seccionar com 50 micrômetros de espessura, velocidade de um milímetro por segundo e frequência de 70 hertz. Usando um pincel sintético, pegue as fatias finas de aros à medida que saem da lâmina e colete-as na placa de 24 poços.

Realizar imuno-histoquímica, bloquear locais inespecíficos por uma hora em temperatura ambiente. Após a incubação, remova o tampão e adicione 250 microlitros de anticorpo diluído em tampão de bloqueio incube durante a noite a quatro graus Celsius ou por duas horas em temperatura ambiente antes de usar PTW para lavar as amostras três vezes por um minuto cada. Após incubação e anticorpos secundários por duas horas em temperatura ambiente.

Lave as seções três vezes. Use um meio de montagem não fluorescente solúvel em água para montar as seções. Em seguida, analise as amostras em um microscópio composto ou confocal.

Quando realizada corretamente, uma ferida leva a um canal de lesão que se estende de dorsal a ventral através do palam do céfalo de conto que cicatrizará após 35 dias. Foi previamente demonstrado por imuno-histoquímica. Essa ferida desencadeia uma regulação positiva de PCNA e S 100 beta e um padrão de sobreposição em três a sete dias após a lesão, indicando proliferação de células gliais radiais.

Esta figura demonstra um acúmulo transitório de células precursoras de oligodendrócitos ou OPCs nas proximidades de uma facada induzida em peixes transgênicos olig dois EEG FP que não é mais observada no dia 35 após a lesão. Se a lesão não for introduzida corretamente, o canal da lesão não será visível. Uma regulação positiva de PCNA e S 100 beta ou acúmulo de OPCs é indetectável.

Conforme apresentado aqui, uma tela de expressão sistêmica que compara os reguladores de transcrição no cérebro de peixes com lesões versus cérebros do tipo selvagem identificou uma série de fatores que são expressos no telecéfalo e que são regulados positivamente em resposta a lesões. O método de ferida em degrau combinado, por exemplo, com sequenciamento profundo de RNA e/ou hibridização in situ, pode ajudar a identificar novos genes envolvidos na neurogênese, regeneração e reparo de adultos de peixe-zebra.