A alta Ensaio imagem Conteúdo de Identificação da neurotoxina botulínica Inibidores

O objetivo geral do presente experimento a seguir é desenvolver um ensaio de triagem fenotípica que o IES botulinum mediou a clivagem de seu substrato SNAP 25 com o objetivo de identificar pequenas moléculas que inibem a função da toxina durante a sinalização nervosa normal. O potencial de ação faz com que o SNAP 25 se ligue à vesícula sináptica à membrana plasmática do terminal do neurônio motor, resultando na liberação do neurotransmissor. No entanto, quando a neurotoxina botulínica está presente, ela é absorvida por endocitose e liberada no butone sináptico, onde cliva o SNAP 25 e, portanto, interfere na liberação do neurotransmissor, causando paralisia.

Este ensaio identifica moléculas que podem inibir a atividade da toxina botulínica e, assim, prevenir a clivagem do SNAP 25 na presença de toxina botulínica e, assim, restaurar a liberação de neurotransmissores na junção neuromuscular. Um ensaio de imagem de alto conteúdo realizado com neurônios motores de camundongos é usado para demonstrar a preservação do SNAP 25, resultando na identificação de pequenas moléculas que podem inibir a atividade da metaloprotease da neurotoxina botulínica. R. A principal vantagem desta tecnologia ou de métodos existentes, como ensaio bioquímico livre de células, é que vários pontos finais fenotípicos podem ser capturados simultaneamente de um único poço contendo neurônios motores tratados com compostos de triagem e toxinas.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave encontradas durante a triagem da biblioteca, como quantificação da atividade baseada em células e citotoxicidade. As implicações dessa técnica se estendem à terapia para intoxicação botulínica, pois pode identificar inibidores que atuam diretamente bloqueando sua atividade de protease metálica ou indiretamente por meio da prevenção do processamento da captação de toxinas, ou possivelmente outros mecanismos. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a otimização das condições de imunocoloração necessárias para a detecção do SNAP 25 pode ser desafiadora.

A demonstração visual desse método é crítica, pois a etapa de imunocoloração é difícil de aperfeiçoar, pois um motor ao seu redor é bastante delicado. As etapas de pé e lavagem são a chave para o desenvolvimento de imagens de alta qualidade necessárias para a análise a jusante. Todos os estudos que utilizam células vivas e toxina ativa são realizados sob condições de nível dois de biossegurança, descontaminar as áreas de trabalho antes e depois desses experimentos com um limpador desinfetante detergente a 5%, como solução microquímica.

Depois de diferenciar células-tronco embrionárias de camundongo em neurônios motores, conforme descrito no protocolo de texto, use uma pipeta manual de 12 canais para substituir a mídia antiga. Nas placas de 96 poços com 80 microlitros de meios de diferenciação terminal frescos, realizar as etapas de aspiração e dispensação linha por linha para minimizar a exposição das células ao ar ambiente. Em seguida, usando uma pipeta de 12 canais, adicione 10 microlitros de 10 x dos compostos de teste da placa de origem e aspire duas vezes para misturar x.

Trate duas colunas de seis poços com 10 X-D-M-S-O diluídos no meio para servir como controles de sinal alto e baixo. Incube as células com os compostos por 30 minutos a sete graus Celsius e 6% de dióxido de carbono. Em seguida, dilua a neurotoxina botulínica A em PBS com meios de diferenciação terminal para produzir um estoque de trabalho final de 10 X usando uma pipeta multicanal, adicione 10 microlitros de 10 x neurotoxina botulínica a aos poços designados para tratamento e também aos poços de controle de baixo sinal.

Trate os poços designados como de alto controle apenas com meios, descontamine todo o desgaste plástico e outros descartáveis que entram em contato com a neurotoxina botulínica. A por imersão em solução de hipoclorito a 0,825% em água por pelo menos 20 minutos. Rotule as placas claramente para denotar o uso de toxinas e incube as placas por quatro horas a 37 graus Celsius e 6% de dióxido de carbono após a incubação.

Use uma pipeta multicanal para remover o meio contendo a toxina e os compostos de cada poço e descarte-o em uma solução de alvejante a 10%. Em seguida, adicione 100 microlitros de metanol gelado diretamente em cada poço para parar a neurotoxina botulínica. Uma clivagem proteolítica.

Em seguida, incube as placas por 15 minutos em temperatura ambiente para permitir que a fixação ocorra. Após a fixação, manuseie os reagentes neutralizados descartados com protocolos de nível um de biossegurança e descarte de acordo. Depois de descartar o metanol, lave as células três vezes com 100 microlitros de PBS para reidratá-las antes da imunocoloração.

A imunocoloração feita em um gabinete de biossegurança de classe dois é realizada usando uma estação de trabalho automatizada disposta para permitir o acesso ao reagente conforme necessário e sem intervenção humana. Carregue as placas contendo as células fixas no magazine PLATE e transfira-o para o convés conforme necessário para as operações de manuseio de líquidos. Usando o cabeçote de pipeta 96 equipado com ponteiras de 250 microlitros, a estação de trabalho aspira o PBS dos poços até 10 microlitros.

A estação de trabalho dispensa 100 microlitros de tampão de bloqueio contendo 1% de soro de cavalo e 0,1% entre 20 em PBS em todas as microplacas. Em seguida, retorne as placas ao magazine de placas para uma incubação de uma hora em temperatura ambiente. Após a incubação, remova o tampão de bloqueio e dispense 50 microlitros de quatro microgramas por mililitro de anticorpo BS e 0,5 microgramas por mililitro de beta três tubulina no tampão de bloqueio em todas as placas.

Incubar as placas por uma hora em temperatura ambiente e, em seguida, remover os anticorpos primários e lavar três vezes com 100 microlitros de PBST. Prepare dois microgramas por mililitro, diluições de anticorpos secundários marcados com diferentes fluoro fours, conforme descrito no protocolo de texto. Dispense 50 microlitros da mistura em cada poço e incube por uma hora em temperatura ambiente Após a incubação, aspire os anticorpos secundários e lave três vezes com 100 microlitros de PBST.

Em seguida, a 100 microlitros de PBS contendo 32 ganchos micromolares corantes para corar o DNA para detecção de núcleos. Por fim, sele as placas com uma película impermeável leve para proteger os quatro fluorados do fotobranqueamento. As placas podem ser armazenadas a quatro graus Celsius por semanas sem perda significativa de sinal.

No sistema de aquisição de imagem, especifique o tipo de placa como moedor u. Limpe o layout como 96. Formate bem o número de campos como 16 e o objetivo como 20 x água.

Em seguida, selecione os canais para excitação do núcleo de 405 nanômetros. Selecione o canal quatro para excitação citoplasmática de 640 nanômetros. Selecione o canal dois para excitação do canal de anticorpo específico do antígeno de 561 nanômetros, selecione o canal três.

Em seguida, configure a potência de excitação de cada laser. O experimento terá duas exposições definidas exposição, uma a uma excitação a 640 nanômetros e uma exposição definida duas a duas excitações a 405 nanômetros e 561 nanômetros. Selecione Benning como compartimento dois.

Use os poços de alto controle para otimização da exposição com intensidade máxima como canal SNAP 25 e use os poços de controle baixo para intensidade mínima. Ajuste a exposição para que a intensidade de cada canal seja cerca de metade do nível de saturação ou cerca de 2000 a 2.500 unidades relativas. Em seguida, identifique o plano Z ideal no canal da máscara celular usando o script de correção delta.

No software de análise de imagem, selecione o algoritmo neurite para segmentar os neurites. Identifique as regiões dos neuritos com base nos objetos secundários, os neuritos, usando uma expansão de menos três pixels do canal beta de três tubulinas como máscara. Calcule a intensidade dos canais de sinal para a região dos neuritos e o canal de tubulina beta três.

Selecione os parâmetros desejados para exportação, como comprimento do neurite, intensidades médias do SNAP 25 beta três, número de núcleos de tubulina e número de segmentos de neurite. Com a configuração concluída. Transfira as chapas dos empilhadores de chapas usando o robô, carregue-as no gerador de imagens de alto conteúdo e inicie a aquisição da imagem.

Aqui é mostrada a análise do gráfico de caixa da clivagem percentual calculada a partir de poços de controle. O rosa representa o controle de alto sinal que são os poços com apenas meio e sem toxina. Muito pouca clivagem é observada nesses poços.

O azul representa o controle de baixo sinal que são os poços com apenas toxina e sem composto de amostra. Esses poços registraram clivagem significativa. Essas distribuições de histograma dos valores de controle demonstram a distância entre as duas populações de controle.

O objetivo do processo de triagem é encontrar compostos dentro da população da amostra com valores mais próximos da população de controle positivo. A distribuição de 192 amostras tratadas com compostos, que também continham neurotoxina botulínica A, é mostrada aqui em verde. A maioria desses poços mostrou clivagem significativa.

No entanto, houve alguns outliers estatisticamente significativos que não mostraram clivagem significativa quando comparados aos controles. Os valores de controle são novamente mostrados pelas barras rosa e azul nesta distribuição do histograma. As barras verdes mostraram a sobreposição dos valores da amostra com os valores de controle.

Os valores amostrais considerados acertos foram selecionados a partir dos valores discrepantes que apresentam valores percentuais de clivagem inferiores a três desvios-padrão da mediana da população amostral. Esses quatro acertos têm valores semelhantes ao controle de alto sinal e representam o mesmo composto, que é uma neurotoxina botulínica conhecida, um inibidor da sinanon que bloqueia a clivagem do SNAP 25. Este inibidor demonstrou proteção robusta do SNAP 25 contra a neurotoxina botulínica A, bem como poços com a toxina e este inibidor se comportou de forma semelhante a poços sem toxina e de forma diferente a poços com toxina, mas sem o inibidor Uma vez dominado.

Essa técnica pode ser feita em quatro a seis horas se for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de incluir vários controles para calcular o desempenho estatístico do ensaio e permitir uma decisão de reprovação para cada placa de triagem individual Seguindo este procedimento. Outros métodos, como ensaios proteolíticos bioquímicos, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como uma avaliação dos acertos de triagem como inibidores diretos ou indiretos do Bot.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de como automatizar um ensaio de triagem fenotípica que usa a quantificação do SNAP 25 por meio de imunocoloração como seu endpoint primário. Não se esqueça de que trabalhar com neurotoxinas botulínicas pode ser extremamente perigoso e precauções como o uso de equipamentos de proteção individual e a implementação dos procedimentos adequados de descontaminação e descarte de botina. A neurotoxina deve sempre ser tomada durante a realização deste procedimento.