Name: A alta Ensaio imagem Conteúdo de Identificação da neurotoxina botulínica Inibidores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: Aprenda a desenvolver um ensaio de triagem fenotípica por imagem de alta conteúdo para identificar inibidores da neurotoxina botulínica em neurônios motores de camundongo. Este método permite capturar múltiplos endpoints fenotípicos simultaneamente.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

O financiamento foi fornecido pelo Joint Science and Technology Office – Chemical Biological Defense (JSTO-CBD), Defense Threat Reduction Agency (DTRA) sob o número do projeto patrocinador CCAR# CB3675 e National Institutes of Health (1 R21 AI101387-01 e 5 U01AI082051-05).

Placa de 20.000 células ES de ratinho diferenciadas (MES) / poço em placas de 96 lisina revestidos assim Poli-D e manter no neurónio motor meios de diferenciação terminal por 5-7 dias. Administração 1. Composto e Intoxicação com BoNT / A Realizar todos os seguintes trabalhos em um gabinete BSL2 para manter a conformidade com as diretrizes do CDC / NIH. <ol><li> Preparar soluções de estoque 10 mM de cada composto da biblioteca em 100% de DMSO em placas de 96 poços de polipropileno. Usar o estoque 10 mM para preparar uma placa de diluição intermédia que é 10 vezes maior do que a concentração de triagem desejado. Prepare 100 uM placa intermediária dispensando estoque 10 mM em placa de 96 poços e diluir a 100 uM utilizando meios de cultura. Dispensar 10 ul dos compostos sobre a 90 ul de meio sobre as células 11. Teste os compostos em 10 uM concentração final e garantir a porcentagem final de DMSO não exceda 0,5%. </li><li> Realize todos garanhãos que utilizam células vivas e toxina ativa sob nível de biossegurança 2 condições. Substituir as velhas mídias nas placas de 96 poços com 80 mL de fresco mídia diferenciação terminal usando um manual de 12 canais pipeta. Realizar aspiração e dispensar passos por linhas para evitar a exposição das células sem mídia para o ar ambiente. </li><li> Pretreat células com compostos antes da aplicação da toxina através da adição de 10 ul de compostos de 10x a placa de fonte utilizando uma pipeta de 12 canais, seguido por mistura por aspiração (duas vezes). Para cada placa de 96 poços, tratamento de duas colunas de 6 poços com 10x DMSO diluído nos meios de comunicação para servir como sinal de alta e controles de sinal baixo. A coluna sem tratamento BoNT exibe o nível mais elevado de todo o comprimento SNAP-25 (controlo de sinal alta). Trate a outra coluna com BoNT sozinho (sem quaisquer compostos) como o baixo controle de sinal. Use baixo controle para observar a eficácia de BoNT clivagem de SNAP-25 e sua detecção com o anticorpo BACS (Figura 2). </li><li> Incubar as células com os compostos durante 30 min a 37 ° C e 6% de CO 2 na incubadora de cultura de células. </li><li> Prepare a neurotoxina botulínica A partir de um 1 mg / ml fonte comercial em solução salina tamponada com fosfato (PBS) para uma final 10x estoque de trabalho por diluição com meios de diferenciação terminal. </li><li> Iniciado intoxicação por adição de 10 ul de 10x de BoNT / A estoque em poços designados para tratamento e baixo sinal controlos utilizando uma pipeta de canais múltiplos (Figura 2). Tratar as cavidades designadas como de controlo elevado com meio isolado. </li><li> Descontaminar todos os utensílios de plástico e outros materiais descartáveis ​​que entra em contacto com BoNT / A durante o estudo por imersão em solução de hipoclorito de 0,825% em água durante pelo menos 20 min. Realize todos os procedimentos de biossegurança em armários e descontaminar áreas de trabalho, antes e depois de experimentos com 5% de detergente desinfetante limpador como solução MICROCHEM. </li><li> Rotular as placas claramente para denotar a utilização de toxina e incubcomeram placas tratadas com 1 nM / L de BoNT / A durante 4 horas a 37 ° C e 6% de CO 2 num incubador de cultura de células. Mostrar sinalização adequada para informar os colegas que a toxina está em uso no laboratório. </li><li> Parar BONT / A clivagem proteolítica pela fixação metanol. Remover meios contendo toxina e compostos de cada poço com uma pipeta multicanal e descartar em solução de lixívia a 10%. Adicionar metanol arrefecido em gelo (100 ul) directamente a cada poço. </li><li> Incubar as placas durante 15 minutos à temperatura ambiente (TA) para permitir a fixação de ocorrer. </li><li> Após a fixação, lidar com segurança com os reagentes descartados (considerado neutralizados) com protocolos de nível de biossegurança 1 e descartar adequadamente. </li><li> Descartar metanol e 100 ul de usar PBS para lavar as células e hidratar-los antes da imunocoloração. Realizar duas lavagens com PBS adicionais. </li><li> Após a lavagem final, deixe PBS nos poços, placas de vedação com película adesiva de microplacas e armazenar a 4 ° C até a análise. Armazene as placas a 4 ° C for vários dias. </li></ol> 2. Immunostaining O procedimento immunostaining é, uma operação de várias etapas de trabalho intensivo que inclui reagentes repetitivos ciclos de distribuição / aspiração e placa de lavagem extensa que pode levar à introdução potencial de variabilidade intraplaca e Interplate significativo. Uma abordagem semi-automática é aplicada a economizar o tempo do pessoal de laboratório, aumentar a taxa de transferência de ensaio, e minimizar imunomarcação variabilidade. <ol><li> Use uma estação de trabalho automatizado equipado com uma cabeça de 96 poços capaz de transferir volumes de até 250 mL e integrado com um braço robótico garra para mover o material de laboratório em locais diferentes, na plataforma modular (ver Materiais e Equipamentos) para este protocolo. <ol><li> O deck modular foi concebido para acolher diferentes tipos de material de laboratório e pode suportar até 11 itens de uma só vez. O manipulador de microplacas automático é equipado com um compartimento duplo microplaca empilhador, a fim de manter emanipular até 50 placas por ciclo. </li><li> A estação de trabalho automatizado está localizado dentro de uma cabine de segurança biológica Classe II projetado para laboratório equipamentos de automação para proporcionar esterilidade e segurança. Para imunocoloração automatizado, o convés está disposta como mostrado na Figura 3, para permitir o acesso do reagente conforme necessário e sem intervenção humana. </li></ol></li><li> Placas pré-carga contendo células fixas na revista placa e transferência para o convés como necessário para operações de movimentação de líquidos. Use a cabeça 96 pipeta equipado com 250 ul dicas para aspirar PBS dos poços até 10 jul. Permeabilizar as membranas celulares para facilitar a ligação do anticorpo a alvos intracelulares, com tampão de permeabilização (0,1% de Triton X-100). Dispensar tampão de permeabilização (100 ul) em cada poço antes de retornar as placas para o segundo compartimento de armazenamento do empilhador para uma microplaca de 15 minutos de incubação à temperatura ambiente (RT). </li><li> Remover tampão de permeabilização e eplavagem da placa com PBS rform (duas vezes) como descrito anteriormente no passo 1.13. </li><li> Após o último passo de lavagem, remover o tampão PBS e dispensar 100 ul de tampão de bloqueio contendo 1% de soro de cavalo e 0,1% de Tween 20 em PBS em todos microplacas antes devolvê-los ao compartimento placa durante 1 hora de incubação à temperatura ambiente. </li><li> Usar dois anticorpos primários para imunocoloração: um anticorpo policlonal de coelho anti-rato de anticorpo BACS, para a detecção de comprimento completo SNAP-25 e um anticorpo monoclonal de rato anti-tubulina III anticorpo para a detecção de neurónios (ver Materiais e Equipamento). Após 60 min de incubação, remover o tampão de bloqueio e dispensar 50 ul de 4ug / ml de anticorpo BACS e 0,5 ug / ml de III-tubulina em tampão de bloqueio em todas as placas. </li><li> Incubar durante 1 h à TA remover os anticorpos primários e lavar 3 vezes com 100 ul de PBS contendo 0,05% de Tween (PBST). </li><li> Usar uma IgG anti-ratinho marcada com Alexa Fluor 647 para visualizar a -III tubulina e anti-IgG de coelho marcado com Alexa Fluor 568 para visualizar o anticorpo BACS. Prepare ambos os anticorpos como uma diluição de 2 ug / ml em tampão de bloqueio e dispensar 50 ul da mistura em cada poço. NOTA: Os anticorpos secundários seleccionados para imunocoloração são marcados com diferentes fluoróforos para permitir a detecção da sua luz fluorescente emitida nos comprimentos de onda distintos, utilizando diferentes canais dentro do detector de o conteúdo de alta Imager. </li><li> Incubar durante 1 h à TA. Aspirar os anticorpos secundários e lavar 3 vezes com 100 uL de PBST. </li><li> Após a lavagem final, adicionar 100 ul de PBS contendo corante Hoechst (32 uM) para corar o ADN para a detecção de núcleos. </li><li> Selar as placas com uma película impermeável luz para proteger os fluoróforos de fotodegradação. As placas podem ser armazenadas a 4 &#160; ° C durante semanas sem perda significativa de sinal. </li></ol> 3. Imagem NOTA: Realizar a aquisição de imagens utilizando alta Conteúdo de imagem SysTEM (ver Materiais e Equipamentos). <ol><li> Especificação de Alta Definição Imager conteúdo: <ol><li> Selecione o tipo de placa, layout, número de campos, objetivo: Greiner u claro, formato de 96 poços, 16, 20X de água, respectivamente. </li><li> Selecione os canais: núcleo de excitação EX: 405 nm como canal 4; citoplasma EX: 644 nm como o canal 2; antígeno específico EX canal anticorpo: 561 nm como canal 3 e Configure potência de excitação de cada laser, experimento Instalação como duas exposições, uma exposição com uma excitação a 644 nm, Exposição 2 com duas excitações em 405 nm e 561 nm. Selecione binning como BIN2. </li><li> Use poços de controlo elevados para a otimização da exposição com intensidade máxima como canal SNAP-25 e baixa de poços de controlo de intensidade mínima. </li><li> Ajustar a exposição, de modo que a intensidade de cada canal é de cerca de metade do nível de saturação (2000-2500 unidades relativas). </li><li> Identificar o plano Z ideal no canal da máscara de célula usando o script de correção delta. Veja Figura 5 para resultados após immunostaining e imagem. Exportar dados para o servidor onde o software de análise de imagem está residindo. </li></ol></li></ol> 4. Análise de Imagem (Figura 6) NOTA: Os passos seguintes descrevem aplicação dos algoritmos de software Columbus. <ol><li> Selecione um algoritmo apropriado para o segmento dos objetos primários (núcleos). Se necessário, ajustar o limiar de fundo e de parâmetros de contraste. O software Columbus oferece quatro métodos de detecção de núcleos. Selecione o método que os núcleos do segmento com precisão por inspeção visual núcleos segmentados (em F igura método 6a M é selecionado). </li><li> Selecione o algoritmo de neurite (CSIRO Neurite Análise 2) para o segmento de neurites Se necessário, ajustar os parâmetros de limite de fundo e contraste para remover o fundo. Veja a Figura 6b para os parâmetros usados ​​para detectar neurites. </li><li> Identificar as regiões neurite (segmentos neurite) based em objectos secundários (neurites), utilizando uma ampliação de pixel -3 do canal β-tubulina III (Alexa Flour 640) como máscara (Figura 6c). </li><li> Calcule a intensidade dos canais de sinal (SNAP-25, (Alexa Farinha 568) para a região de neurites e canal tubulina β-III (Figura 6d e 6e). </li><li> Selecione os parâmetros desejados para a exportação, como comprimento neurite, intensidades médias de SNAP-25, β-tubulina III, número de núcleos, número do segmento neurite, etc. (Figura 6f). </li><li> Placas de transferência de tabuleiros usando o robô e carga para o Imager Conteúdo alta para aquisição de imagem. </li></ol> 5. Análise de Dados: Para avaliar a robustez do ensaio desenhado, calcular os seguintes parâmetros a partir do experimento à base de chapa. <ol><li> Signal (S) a fundo (B): S / B = intensidade do sinal de controle de alta média) / média intensidade de baixo controle de sinal </li> &lt;li&gt; Coeficiente de Variação (CV) de sinal e o fundo (para medir a uniformidade do sinal específico): CV = (Desvio Padrão (DP) / média de amostra) * 100 (%), para determinar a variabilidade no manuseamento de líquidos, reagentes, etc. </li><li> Signal to Noise: S = (intensidade de sinal significa - intensidade de baixo controle de sinal média) / SD de baixo controle <ol><li> Calcular o factor de Z &#39;com intoxicação de uma metade de uma placa de 96 poços e uma intoxicação simulada da outra metade. Z &#39;= 1-3 * (SD de alto controle de sinal + SD de baixo controle de sinal) / (média de controle de alta sinal - média de baixo controle do sinal). Para a análise posterior dos dados de rastreio, normalizar alguns dos parâmetros de matérias primárias sobre uma placa de base para permitir a comparação entre as placas e entre os diferentes dias de experiências. </li></ol></li><li> Percentagem de clivagem, reflectindo a redução do sinal associado com o comprimento total de SNAP-25 detectada por um anticorpo específico (BACS): Clivagem% = 100% * (meaintensidade n de controle sinal alto - intensidade da amostra) intensidade de controle de alta sinal / média. </li><li> Porcentagem de inibição da clivagem:% inibição = 100% * (intensidade da amostra - intensidade de baixo controle de sinal média) / (intensidade de controle de alta sinal significa - intensidade de baixo controle de sinal média). </li></ol>

<ol><li>Lamanna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+most+poisonous+poison%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The most poisonous poison.</a> Science. 130, 763-772 (1959).</li>
<li>Dover, N., Barash, J. R., Hill, K. K., Xie, G., Arnon, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Characterization+of+a+Novel+Botulinum+Neurotoxin+Type+H+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Molecular Characterization of a Novel Botulinum Neurotoxin Type H Gene.</a> J. Infect. Dis. , (2013).</li>
<li>Hakami, R. M., Ruthel, G., Stahl, A. M., Bavari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaining+ground%3A+assays+for+therapeutics+against+botulinum+neurotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Gaining ground: assays for therapeutics against botulinum neurotoxin.</a> Trends in microbiology. 18, 164-172 (2010).</li>
<li>Yersin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+synaptic+vesicle+fusion+proteins+explored+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Interactions between synaptic vesicle fusion proteins explored by atomic force microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 8736-8741 (2003).</li>
<li>Dong, M., Tepp, W. H., Johnson, E. A., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+fluorescent+sensors+to+detect+botulinum+neurotoxin+activity+in+vitro+and+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Using fluorescent sensors to detect botulinum neurotoxin activity in vitro and in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 14701-14706 (2004).</li>
<li>Stahl, A. M., Adler, M., and, C. B. M., Gilfillan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerating+botulism+therapeutic+product+development+in+the+Department+of+Defense%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Development+Research%22%5BJournal%5D)">Accelerating botulism therapeutic product development in the Department of Defense.</a> Drug Development Research. 70, 303-326 (2009).</li>
<li>Nuss, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cell-based+assays+to+measure+botulinum+neurotoxin+serotype+A+activity+using+cleavage-sensitive+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomolecular+screening%22%5BJournal%5D)">Development of cell-based assays to measure botulinum neurotoxin serotype A activity using cleavage-sensitive antibodies.</a> Journal of biomolecular screening. 15, 42-51 (2010).</li>
<li>Opsenica, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemotype+that+inhibits+three+unrelated+pathogenic+targets%3A+the+botulinum+neurotoxin+serotype+A+light+chain%2C+P.+falciparum+malaria%2C+and+the+Ebola+filovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+medicinal+chemistry%22%5BJournal%5D)">A chemotype that inhibits three unrelated pathogenic targets: the botulinum neurotoxin serotype A light chain, P. falciparum malaria, and the Ebola filovirus.</a> Journal of medicinal chemistry. 54, 1157-1169 (2011).</li>
<li>Opsenica, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synthesis+of+2%2C5-bis%284-amidinophenyl%29thiophene+derivatives+providing+submicromolar-range+inhibition+of+the+botulinum+neurotoxin+serotype+A+metalloprotease%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+medicinal+chemistry%22%5BJournal%5D)">The synthesis of 2,5-bis(4-amidinophenyl)thiophene derivatives providing submicromolar-range inhibition of the botulinum neurotoxin serotype A metalloprotease.</a> European journal of medicinal chemistry. 53, 374-379 (2012).</li>
<li>Nuss, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacophore+Refinement+Guides+the+Rational+Design+of+Nanomolar-Range+Inhibitors+of+the+Botulinum+Neurotoxin+Serotype+A+Metalloprotease%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+medicinal+chemistry+letters%22%5BJournal%5D)">Pharmacophore Refinement Guides the Rational Design of Nanomolar-Range Inhibitors of the Botulinum Neurotoxin Serotype A Metalloprotease.</a> ACS medicinal chemistry letters. 1, 301-305 (2010).</li>
<li>Kiris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell-derived+motoneurons+provide+a+highly+sensitive+cell+culture+model+for+botulinum+neurotoxin+studies%2C+with+implications+for+high-throughput+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+research%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery.</a> Stem cell research. 6, 195-205 (2011).</li>
<li>Pellett, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+targeting%2C+internalization%2C+and+biological+activity+of+a+recombinant+atoxic+derivative+of+botulinum+neurotoxin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Neuronal targeting, internalization, and biological activity of a recombinant atoxic derivative of botulinum neurotoxin A.</a> Biochemical and biophysical research communications. 405, 673-677 (2011).</li>
<li>McNutt, P., Celver, J., Hamilton, T., Mesngon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell-derived+neurons+are+a+novel%2C+highly+sensitive+tissue+culture+platform+for+botulinum+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell-derived neurons are a novel, highly sensitive tissue culture platform for botulinum research.</a> Biochemical and biophysical research communications. 405, 85-90 (2011).</li>
<li>Fischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimodal+modulation+of+the+botulinum+neurotoxin+protein-conducting+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bimodal modulation of the botulinum neurotoxin protein-conducting channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 1330-1335 (2009).</li>
</ol>

Krishna P Kota é funcionário da Perkin Elmer Inc. Waltham, MA, que produz instrumentos e software usados neste manuscrito. O conteúdo desta publicação não reflete necessariamente as opiniões ou políticas do Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, do Departamento de Defesa dos EUA, do Departamento do Exército dos EUA ou das instituições e empresas afiliadas aos autores.

A alta potência de neurotoxinas botulínicas e relativa facilidade de seu armamento resultou em sua classificação como Categoria A (prioridade mais alta) agentes biothreat pelos Centros dos EUA para Controle e Prevenção de Doenças. Infelizmente, não há terapias aprovadas pela FDA para contrariar BoNT intoxicação após a toxina tenha sido internalizados pelos neurónios motores. Qualquer mecanismo druggable que promove a recuperação neuronal de BoNT intoxicação pode levar para o desenvolvimento de uma terapia potencial para...

A bactéria Clostridium botulinum produz neurotoxina botulínica, um dos mais potentes toxinas biológicas conhecidas para o homem 1. Existem 7 sorotipos BoNT distintas (TB / AG). BoNT / A-Gall induzir paralisia na junção neuromuscular, devido à proteólise complexo SNARE 2,3. SNARE proteólise impede-neurotransmissor vesícula de membrana de fusão e, por conseguinte, bloqueia a exocitose do neurotransmissor 4. O alvo SNARE específica depende do serotipo particular, BoNT envolvidos no processo de intoxicação. BoNT / A e BoNT / E se apegam SNAP-25 enquanto que cliva BoNT / C ambos SNAP-25 e syntaxin 5. O restantes serotipos sinaptobrevina clivam (também chamado de proteína de membrana de vesícula-associado (VAMP). BoNT / A foi escolhida para o desenvolvimento do ensaio, uma vez que é responsável por uma proporção elevada de ocorrência natural botulismo e tem a maior duração de acção 6. Desenvolvimento de pequena molécula terapêutica contra BoNT / A é uma meta importante parao nosso programa de descoberta de drogas e utilizou métodos tradicionais à base de alvo para identificar inibidores de sítio proteolíticas activas 7, 8-10. No entanto, a criação de inibidores de sítio activo com actividade de largo espectro contra vários serotipos e eficácia pós-exposição irá provavelmente ser um desafio. Temos, portanto, implementado uma abordagem inovadora, fenotípicas descoberta droga que usa BoNT SNAP-25 clivagem como um desfecho funcional para identificar pequenas moléculas que podem bloquear BoNT mediada por intoxicação do neurônio motor. SNAP-25 é necessária para a libertação de neurotransmissores, como a degradação de SNAP-25 é preditivo da paralisia e letalidade in vivo. Por exemplo, o rastreio baseado em células poderia levar à descoberta de novos moduladores de factores celulares responsáveis ​​pela inactivação da toxina ou a inibição das vias de toxina no interior das células-alvo. Um fator importante no desenvolvimento de ensaio fenotípico é a seleção de modelos biológicos fisiologicamente relevantes. We e outros descreveram rato estaminais embrionárias (ES) derivadas de células de neurónios motores que recapitulam o carácter imunológico de neurónios motores principais, incluindo a expressão de SNAP-25, 11- 13. É importante notar que estes sistemas celulares são altamente sensíveis a BoNT / A intoxicação e demonstrar a clivagem dependente da dose de SNAP-25 em resposta a concentrações crescentes de toxina 11,12. Os neurónios motores diferenciadas também são produzidos em quantidades que são suficientes para uma análise baseada placa de alto rendimento e permitiram a construção de uma variedade de ensaios celulares. O ensaio fenotípico é um método de imunofluorescência utilizando dois anticorpos diferentes para quantificar a clivagem de comprimento total endogenamente expressa SNAP-25 durante BoNT / A intoxicação da cultura do rato do neurônio motor. Um terminal carboxilo BoNT / A (BACS) anticorpo sensível à clivagem que reconhece apenas o comprimento total SNAP-25 permite a avaliação de BoNT / A proteólise mediada da SNAP-25expressão no motor de rato neurônios 10. Um diagrama esquemático do ensaio IHC está representado na Figura 1.

<table><tbody><tr><td>Neurotoxina botulínica A&nbsp;</td><td>Metabiologics</td><td>NA</td><td>Sem número de catálogo</td></tr><tr><td>Placas de microtitulação</td><td>Greiner&nbsp;</td><td>655946</td><td>Placas de Poli-D-Lisina 96-poços</td></tr><tr><td>BACs anticorpo</td><td>Lampire Biological</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Microchem</td><td>National&nbsp;</td><td>0255</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Thermo Scientific</td><td>A412-20</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cavalo</td><td>Invitrogen</td><td>16050</td><td></td></tr><tr><td>PE JANUS MDT Mini Estação de Trabalho Automatizada</td><td>Perkin Elmer</td><td>AJMDT01</td><td></td></tr><tr><td>Opera</td><td>Perkin Elmer</td><td>OP-QEHS-01</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>BIII anticorpo de tubulina</td><td>R& D Systems</td><td>BAM1195</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379-1L</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342dye&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>3570</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A21236</td><td></td></tr><tr><td>Anti coelho IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A10042</td><td></td></tr><tr><td>Columbus Software de análise de imagem</td><td>Perkin Elmer</td><td>Ver 2.4</td><td></td></tr><tr><td>Spotfire</td><td>Perkin Elmer</td><td>Ver 5.5</td><td></td></tr><tr><td>Alvejante Clorox</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-861-284</td><td></td></tr><tr><td>Pilha de</td><td></td><td></td><td></td> placas</tr></tbody></table>

a alta ensaio imagem conteúdo de identificação da neurotoxina botulínica inibidores

A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors

A proteína 25 associada a sinaptossomos (SNAP-25) é um componente do complexo do receptor de proteína de ligação NSF solúvel (SNARE) que é essencial para a liberação de neurotransmissores sinápticos. A neurotoxina botulínica sorotipo A (BoNT/A) é uma metaloprotease de zinco que bloqueia a exocitose do neurotransmissor clivando o componente SNAP-25 do complexo SNARE. Atualmente, não há medicamentos licenciados para tratar o envenenamento por BoNT/A após a internalização da toxina pelos neurônios motores. O desenvolvimento de medidas terapêuticas eficazes para combater a intoxicação por BoNT / A tem sido limitado, em parte devido à falta de ensaios robustos de alto rendimento para triagem de bibliotecas de pequenas moléculas. Aqui descrevemos um ensaio de imagem de alto conteúdo (HCI) com utilidade para identificação de inibidores de BoNT / A. Os esforços iniciais de otimização se concentraram em melhorar a reprodutibilidade dos resultados entre placas em vários experimentos independentes. Verificou-se que a automação da imunocoloração, aquisição e análise de imagens aumenta a consistência do ensaio e minimiza a variabilidade, permitindo a avaliação multiparâmetro de compostos experimentais em um sistema de neurônio motor murino.

Os dados dos controlos altos e baixos criadas duas populações distintas com a diferença de duas medianas superiores a 3 desvios padrão (Figura 7A). O objectivo do processo de triagem é para encontrar os compostos dentro da população da amostra com valores próximos das populações de controlo positivo, assumindo uma distribuição normal dentro da população da amostra (Figura 7B, (i)). Os pontos de dados que são três desvios padrão além da média são considerados estatisticamente diferente d...

A neurotoxina botulínica é uma das toxinas mais potentes entre os agentes de risco biológico da Categoria A, mas uma terapêutica pós-exposição não está disponível. A abordagem de imagem de alto conteúdo é uma metodologia poderosa para identificar novos inibidores, pois permite a triagem multiparamétrica usando neurônios motores biologicamente relevantes, o principal alvo dessa toxina.

A alta Ensaio imagem Conteúdo de Identificação da neurotoxina botulínica Inibidores

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic ...

O objetivo geral do presente experimento a seguir é desenvolver um ensaio de triagem fenotípica que o IES botulinum mediou a clivagem de seu substrato SNAP 25 com o objetivo de identificar pequenas moléculas que inibem a função da toxina durante a sinalização nervosa normal. O potencial de ação faz com que o SNAP 25 se ligue à vesícula sináptica à membrana plasmática do terminal do neurônio motor, resultando na liberação do neurotransmissor. No entanto, quando a neurotoxina botulínica está presente, ela é absorvida por endocitose e liberada no butone sináptico, onde cliva o SNAP 25 e, portanto, interfere na liberação do neurotransmissor, causando paralisia.Este ensaio identifica moléculas que podem inibir a atividade da toxina botulínica e, assim, prevenir a clivagem do SNAP 25 na presença de toxina botulínica e, assim, restaurar a liberação de neurotransmissores na junção neuromuscular. Um ensaio de imagem de alto conteúdo realizado com neurônios motores de camundongos é usado para demonstrar a preservação do SNAP 25, resultando na identificação de pequenas moléculas que podem inibir a atividade da metaloprotease da neurotoxina botulínica. R. A principal vantagem desta tecnologia

a-high-content-imaging-assay-for-identification-botulinum-neurotoxin

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Um protocolo para detectar tricotecenos (micotoxinas de interesse para a saúde humana), utilizando um método de triagem recém-desenvolvido com base em um método imunoquímico competitiva e uma detecção eletroquímica final é demonstrada.

ELIME Método (Enzyme Linked Immuno Magnetic eletroquímica) para Detecção de micotoxinas

A cadeia leve da neurotoxina botulínica tipo A (BoNT/A LC) é uma metaloprotease que entra nos neurônios motores, cliva seu substrato SNAP-25 e interrompe a neurotransmissão, resultando em paralisia flácida. Utilizando um ensaio baseado em FRET compatível com alto rendimento, grandes bibliotecas de pequenas moléculas podem ser rastreadas quanto ao seu impacto na atividade enzimática de BoNT/A LC.

Uma plataforma baseada em FRET compatível com alto rendimento para identificação e caracterização de moduladores de cadeia leve de neurotoxina botulínica

A neurotoxina botulínica BoTest Matrix (BoNT) ensaios de detecção de purificar e quantificar rapidamente BoNT a partir de uma variedade de matrizes de amostra. Aqui, apresentamos um protocolo para a detecção e quantificação de BoNT a partir de matrizes sólidos e líquidos e demonstrar o ensaio com BOTOX, tomate e leite.

Isolamento e Quantificação da neurotoxina botulínica a partir de matrizes complexas usando os BoTest Matrix Ensaios

Um protocolo personalizado é descrito para diferenciar células ES de camundongos em populações definidas de neurônios altamente puros exibindo sinapses funcionais e comportamento de rede emergente. A análise eletrofisiológica demonstra a perda da transmissão sináptica após a exposição aos sorotipos de neurotoxina botulínica / A- / G e neurotoxina tetânica.

Avaliação Funcional de neurotoxinas Biológica em Culturas em Rede de Células-Tronco derivadas do Sistema Nervoso Central Neurônios

Este artigo descreve um método de microarray de proteína simples para perfilação humorais respostas imunes a um painel de 7-plex de altamente purificado antígenos de Clostridium difficile em soros humanos. O protocolo pode ser estendido para a determinação de respostas de anticorpos específicos em preparações de imunoglobulina intravenosa policlonal.

Um ensaio de Microarray da proteína para determinação sorológica do antígeno-específicas anticorpo respostas seguintes Clostridium difficile infecção

Este protocolo apresenta uma técnica automatizada de alto rendimento baseada em imagem para identificar compostos que modulam a morte de células de câncer de mama mediadas por células natural killer na presença de um anticorpo terapêutico anti-HER-2.

Ensaio de Triagem de Alto Conteúdo para Identificação de Compostos Modificadores de Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos

Descrevemos o uso de cromatografia em camada delgada, ensaio de bioautografia direta e cromatografia líquida-espectrometria de massa para identificar produtos naturais microbianos que apresentam antagonismo contra patógenos fúngicos usando o patógeno Sclerotinia sclerotiorum e isolados de Bacillus biopesticidas como sistema modelo.

Identificação guiada por bioensaio de produtos naturais para biocontrole por cromatografia em camada delgada - bioautografia direta

Este protocolo descreve um ensaio fatia organotípicas otimizado para o cérebro pós-natal e imagens de alta resolução de lapso de tempo de migração neuroblastos no fluxo migratório rostral.

Um Ensaio Slice organotípicas para High-Resolution Imaging Time Lapse de migração neuronal no cérebro pós-natal

Este artigo descreve as técnicas para realizar imagens de alta resolução por ressonância magnética funcional com 1,2 mm de amostragem mesencéfalo humana e estruturas subcorticais usando um scanner 3T. O uso de tais técnicas para resolver mapas topográficos de estimulação visual no colículo humano superior (SC) é dada como um exemplo.

De alta resolução funcionais Métodos ressonância magnética para Midbrain Humanos

Estudos funcionais do sistema auditivo em mamíferos têm sido tradicionalmente realizada usando técnicas espacialmente focadas, como registros eletrofisiológicos. O protocolo a seguir descreve um método de visualização de padrões de grande escala da atividade hemodinâmica evocada no córtex auditivo gato usando ressonância magnética funcional.

Imagem Funcional do Cortex Auditivo em gatos adultos usando de alta campo fMRI

Aprenda a desenvolver um ensaio de triagem fenotípica por imagem de alta conteúdo para identificar inibidores da neurotoxina botulínica em neurônios motores de camundongo. Este método permite capturar múltiplos endpoints fenotípicos simultaneamente.

A alta Ensaio imagem Conteúdo de Identificação da neurotoxina botulínica Inibidores

Explorar mais vídeos