Name: Imagens intracelular Ca 2+ Sinais em estriado astrócitos de ratos adultos, através de indicadores de cálcio geneticamente codificados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Aprenda a imaginar sinais de cálcio intracelular em astrócitos estriados de camundongos adultos usando indicadores de cálcio geneticamente codificados. Este método permite visualizar dinâmicas de cálcio com imagem confocal.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

A maior parte do trabalho e do pessoal envolvido foram apoiados pelo NIH conceder NS060677 e em parte pelo NIH concede MH099559 e MH104069 (a BSK). Alguns dos trabalhos também foi apoiado pela Fundação CHDI.

Todos os protocolos de animais estavam de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais Institucional na UCLA. 1.1) Prepare Micropipeta e AAV2 / 5 Vírus Carregando <ol><li> Use micropipetas de vidro de borosilicato finas para a injecção do vírus. Puxe a micropipeta usando um programa puxando de duas etapas com um puxador vertical. Bisel da pipeta com um ângulo de 40 °, utilizando um moinho de pipeta. A pipeta que é ideal para uso terão um diâmetro de ponta de 20 - 40 mm e um comprimento da haste de 6-7 mm. Autoclave a pipeta e instrumentos cirúrgicos. A broca é esterilizada por limpeza com etanol a 70%. </li><li> Armazenar o vírus AAV2 / 5-GfaABC 1 D.cyto-GCaMP3.SV40 (1,5 x 10 13 gc / ml), a -80 ° C em alíquotas de 10 ul. Pouco antes da cirurgia, tire as alíquotas do congelador e guarde no gelo até ser usado para o preenchimento de the micropipeta. </li><li> Encher a micropipeta com vírus, utilizando uma bomba de seringa. Firmemente ligar uma extremidade de um pedaço de tubo, através de uma tubagem de compressão de tamanho adequado encaixe, para uma seringa de vidro com um êmbolo reforçado. Encaixe a micropipeta autoclavado para a outra extremidade do pedaço de tubo através de uma agulha de tamanho apropriado compressão encaixe removível. </li><li> Antes de carregar o vector viral, remover bolhas de ar do sistema de bombagem, incluindo tubos, seringas e micropipeta enchendo o sistema com óleo mineral colorida com Sudan IV vermelha (~ 1 mg / 50 ml) numa seringa de 1 ml com uma agulha (27 L ). </li><li> Coloque um pedaço de parafilm limpo sob a micropipeta de vidro, e dispensar 5-10 ul de o vector viral para o parafilme. </li><li> Sugam o vector viral, movendo o êmbolo da seringa para trás a 0,5 ul / min, e marcam o limite entre o vector e o óleo sobre a pipeta de vidro. </li></ol> 1.2) A anestesia, corte de cabelo, Head Fixação e Preparação para Craniotomia <ol><li> Coloque um rato (P49-63, C57BL / 6) para a câmara cheia com N 2 O e O 2 e 5% de isoflurano. Avaliar a profundidade da anestesia, pela perda de movimento intencional e uma taxa respiratória lento (~ 60-90 / min). Cortar cabelo na cabeça quando o mouse é anestesiado. </li><li> Montar o mouse no quadro estereotáxico, com a cabeça protegida por barras de ouvido sem corte e seu nariz colocados em um sistema de anestesia e ventilação. Manter contínua isoflurano a 2 - 3%. Aplicar pomada lágrimas artificiais para ambos os olhos desde que os ratos perdem o reflexo de piscar sob anestesia. </li><li> Administrar 0,05 ml de buprenorfina (0,1 mg / ml) por injecção subcutânea para o alívio da dor. </li><li> Limpo área cirúrgica com 10% de iodo de povidona e 70% de álcool três vezes, alternando entre as duas soluções e começando com povidona iodo. Comece pela frente e limpe para trás para remover todos os cabelos já cortados. </li><li> Faça uma incisão na pele em cima of a cabeça, que se inicia entre os olhos e termina entre as orelhas. </li></ol> 1.3) Craniotomia e Microinjeções <ol><li> Retire o periósteo passando com um cotonete e depois secar a superfície do crânio com bolas de algodão dental. Fazer uma marca em torno do local da injecção, e perfurar em torno da borda da marca usando uma pequena rebarba de aço alimentado por uma broca de alta velocidade. </li><li> Remover o osso e limpar a superfície com solução salina. </li><li> Coloque a pipeta no dorsal e lateral esquerda da striatum com as seguintes coordenadas (mm): 0,8 ântero-posterior, médio-lateral: 2,0, dorsal-ventral da superfície pial: -2,4 13. Note-se que estas coordenadas significa que a ponta da agulha de microinjecção fica logo acima do estriado dorsolateral (Figura 1A, B), o que significa que só penetra ligeiramente dentro deste núcleo. Evite vasos sanguíneos prejudiciais. Se a pipeta passa a ser direito em um vaso sanguíneo, um pequeno ajuste nacoordenadas por ~ 0,1-0,2 mm. </li><li> Iniciar a injecção com uma taxa de injecção ajustado a 0,2 ul / min, e injectar tipicamente de 1 a 1,5 ul de vírus. </li><li> Deixar a pipeta no local após a injecção durante 10 min, e em seguida, retirar a pipeta lentamente. </li><li> Finalize fechando a ferida cirúrgica com sutura contínua de nylon externo sutura. </li></ol> 1.4) Recuperação <ol><li> Coloque o mouse em uma gaiola limpa em uma almofada de aquecimento, durante 24 horas. Não devolva um rato que foi submetido a cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado. Não deixe o mouse sem vigilância até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. </li><li> Adicionar Sulfamethoxiazole Trimetoprim (5 ml por 500 ml de água, contendo 40 mg de trimetoprim e 200 mg sulfamethoxiazole) na água durante uma semana. Administrar Buprenorfina duas vezes por dia durante 3 dias após a cirurgia. </li><li> Manter o mouse em um ciclo claro-escuro de 12 horas, alimentados e regada diariamente, umnd é ponderada uma vez por dia até 3 dias após a cirurgia. Nestes três dias, todo o rato com uma perda de mais de 10% do peso corporal é considerado como comprometida, e serão sacrificados em vez de ser submetido a experimentação. </li><li> Separadamente, mudar a gaiola do mouse duas vezes por semana, e monitor para a saúde em geral, pelo menos uma vez por dia. Normalmente, o mouse é usado dentro de 2-3 semanas após as microinjeções estereotáxica. </li></ol> 2. aguda do cérebro Slice Preparação para confocal Ca 2+ imagem 2.1) Preparação de Corte e Soluções de gravação. <ol><li> Preparar solução compreendendo (mM) de corte: 194 de sacarose, 30 NaCl, 4,5 de KCl, 10 D-glucose, 1 MgCl2, 1.2 NaH 2 PO 4, 26 e NaHCO 3, saturado com 95% O2 e 5% de CO 2. </li><li> Preparar a solução de gravação compreendendo (mM): NaCl 124, KCl 4,5, MgCl 2 1, 10 D-glicose, 2 de CaCl2, 1,2 de NaH 2 PO 4 </sub&gt;, e 26 de NaHCO3; pH 7,3 - 7,4 290-295 mOsm, saturado com 95% O2 e 5% de CO 2. Encha o copo fatia do cérebro segurando com solução de gravação, e mantê-lo a 34 ° C. </li></ol> 2.2) O fatiamento <ol><li> Duas a três semanas após microinjeções estereotáxica, profunda e terminal anestesiar o mouse, e depois decapitá-lo. </li><li> Extraia o cérebro, e usar uma lâmina para remover o hemisfério direito não injectada, e montar a esquerda na bandeja vibratome usando super-cola. Encher o tabuleiro de vibratome com tampão de corte a frio de gelo, e manter saturando-a com 95% de O2 e 5% de CO 2. </li><li> Cortar fatias de cérebro do estriado coronais ou sagitais a 300 mm de espessura. Normalmente, 4-5 coronal, ou 6-7 fatias estriatais sagital podem ser coletadas. </li><li> Transfira as fatias para o copo fatia segurando aquecido a 34 ° C, e mantê-los lá por 30 min antes de armazená-los em temperatura ambiente por recordi posteriorng. </li><li> Incubar as fatias de cérebro de gravação em tampão oxigenado à temperatura ambiente durante pelo menos 30 min antes de [Ca 2+] i imagiologia. </li></ol> 3. Imuno-histoquímica (IHQ) <ol><li> Duas semanas após a injecção de vírus, perfundir o rato transcardialmente com PBS, seguido por 10% de formalina em PBS. </li><li> Retirar, pós-fixar durante a noite, e cryoprotect o cérebro em tamponada 30% de sacarose por pelo menos dois dias. </li><li> Prepare 40 mm seções usando um micrótomo criostato. </li><li> Enxágüe seções 3 vezes com PBS a 10 min de intervalo. </li><li> Incubar secções durante 1 h em PBS com 10% de soro de cabra normal e com 0,5% de Triton X-100. </li><li> Incubar secções durante a noite a 4 ° C em anticorpo primário preparadas em PBS com 0,5% de Triton X-100. Os anticorpos primários utilizados foram como se segue: galinha anti-GFP 1: 1.000, de ratinho anti-S100β 1: 400, de ratinho anti-NeuN 1: 600, de rato anti-glutamina sintetase 1: 300. </li><li> Enxágüe seções 3 vezes com PBS a 10 mem intervalos. </li><li> Incubar as secções com anticorpos secundários preparadas em PBS com 10% de soro de cabra normal durante 2 horas à temperatura ambiente. Os anticorpos secundários foram os seguintes: anticorpos de cabra anti-murganho Alexa546 1: 500, de cabra anti-galinha Alexa488 1: 500. </li><li> Monte as secções em lâminas de vidro, seco e aplique algumas gotas de antifade meio de montagem, em seguida, cubra lentamente as seções com uma lamela de vidro. Armazenar as lâminas a 4 ° C. </li><li> Tome imagens num microscópio confocal com uma lente de imersão em óleo de 40X com uma abertura numérica de 1,3. </li></ol> 4. confocal [Ca 2+] i Imagem NOTA: [Ca 2+] i de imagem foi feita usando um microscópio confocal com uma lente objetiva de 40X de imersão em água com uma abertura numérica de 0,8. <ol><li> Entre 1 e 5 h após o corte, fatia lugar na câmara de gravação e gravação superfuse com tampão oxigenado à temperatura ambiente com uma taxa de fluxo de 1-2 ml pormin. Em seguida, coloque uma harpa de platina com cordas de nylon em cima da fatia para minimizar o movimento durante o experimento. </li><li> Visualizar e localizar o striatum dorsal com brilhante luminescência campo sob uma objectiva de imersão em água 10X. </li><li> Alterne para a lente objetiva de 40X de imersão em água, e ligue a linha 488 nm do laser de argônio. Ao alterar o plano focal, encontrar células localizadas cerca de 20 mm abaixo da superfície da fatia, exibindo fluorescência basal em Soma, ramos e raminhos. De nota, as células comprometidas normalmente apresentar nível de fluorescência acima da média, o que deve ser evitado. </li><li> Use o modo &quot;quadro varredura &#39;para iniciar a digitalização. Normalmente, a intensidade do laser ajustado para 0,5 - 5% da potência máxima é suficiente para a imagem [Ca 2+] i com o cito-GCaMP3. Para monitorar [Ca 2+] i dinâmica em todo o território dos astrócitos, a &quot;varredura frame &#39;com uma velocidade de varredura de 1 segundo por quadro ou mais rápido é recomeNDED, mas isso tem de ser decidido de acordo com o experimento em questão. </li><li> Se necessário, a imagem [Ca2 +] i em processos, utilize ampliação digital de 2-3 vezes para monitorar 1-2 astrócitos em todo o campo de visão. </li><li> Para evitar pixels saturados durante a gravação, utilize o modo de pesquisa &quot;HiLo&quot; a pseudo as células. Sempre comece com uma &quot;gravação piloto&quot; por cerca de 5 minutos, para testar se a cor vermelha aparece como indicação de saturação. Se for assim, diminuir a potência do laser, ou diminuir a PMT / Gain / compensar os valores e realizar uma outra gravação piloto para testar os valores de pixel estão na faixa não-saturada. Tipicamente, os parâmetros combinados utilizados para imagiologia de astrócitos [Ca 2+] i no corpo estriado são as seguintes: potência de laser de saída 0,5-5% (de 10 mW), PMT 550-650 volts, Ganho de 2,0 - 3,5 vezes maior, e deslocamento 0 - 5%. </li></ol>

<ol><li>Agulhon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+role+of+astrocyte+calcium+in+neurophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology.</a> Neuron. 59, 932-946 (2008).</li>
<li>Khakh, B. S., North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromodulation+by+extracellular+ATP+and+P2X+receptors+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuromodulation by extracellular ATP and P2X receptors in the CNS.</a> Neuron. 76, 51-69 (2012).</li>
<li>Gourine, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+control+breathing+through+pH-dependent+release+of+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP.</a> Science. 329, 571-575 (2010).</li>
<li>Florian, C., Vecsey, C. G., Halassa, M. M., Haydon, P. G., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-derived+adenosine+and+A1+receptor+activity+contribute+to+sleep+loss-induced+deficits+in+hippocampal+synaptic+plasticity+and+memory+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-derived adenosine and A1 receptor activity contribute to sleep loss-induced deficits in hippocampal synaptic plasticity and memory in mice.</a> J Neurosci. 31, 6956-6962 (2011).</li>
<li>Shigetomi, E., Jackson-Weaver, O., Huckstepp, R. T., O'Dell, T. J., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPA1+channels+are+regulators+of+astrocyte+basal+calcium+levels+and+long-term+potentiation+via+constitutive+D-serine+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">TRPA1 channels are regulators of astrocyte basal calcium levels and long-term potentiation via constitutive D-serine release.</a> J Neurosci. 33, 10143-10153 (2013).</li>
<li>Tong, X., Shigetomi, E., Looger, L. L., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+and+astrocyte+calcium+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators and astrocyte calcium microdomains.</a> Neuroscientist. 19, 274-291 (2013).</li>
<li>Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+targeted+optical+sensor+to+monitor+calcium+signals+in+astrocyte+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes.</a> Nat Neurosci. 13, 759-766 (2010).</li>
<li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J Gen Physiol. 141, 633-647 (2013).</li>
<li>Shigetomi, E., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+near+plasma+membrane+and+global+intracellular+calcium+dynamics+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measuring near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics in astrocytes.</a> J Vis Exp. 26, (2009).</li>
<li>Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+loading+of+calcium+indicator+dyes+to+study+astrocyte+physiology%3A+key+limitations+and+improvements+using+morphological+maps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps.</a> J Neurosci. 31, 9353-9358 (2011).</li>
<li>Li, D. D., Agulhon, C., Schmidt, E., Oheim, M., Ropert, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+investigating+astrocyte-to-neuron+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">New tools for investigating astrocyte-to-neuron communication.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, (2013).</li>
<li>Davila, D., Thibault, K., Fiacco, T. A., Agulhon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+molecular+approaches+to+understanding+astrocyte+function+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Recent molecular approaches to understanding astrocyte function in vivo.</a> Front Cell Neurosci. 7, 272(2013).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. Waltham, MA. (2012).</li>
<li>Perea, G., Yang, A., Boyden, E. S., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+astrocyte+activation+modulates+response+selectivity+of+visual+cortex+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Optogenetic astrocyte activation modulates response selectivity of visual cortex neurons in vivo.</a> Nat Commun. 5, 3262(2014).</li>
<li>Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes%3A+biology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Astrocytes: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119, 7-35 (2010).</li>
<li>Eid, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+glutamine+synthetase+in+the+human+epileptogenic+hippocampus%3A+possible+mechanism+for+raised+extracellular+glutamate+in+mesial+temporal+lobe+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Loss of glutamine synthetase in the human epileptogenic hippocampus: possible mechanism for raised extracellular glutamate in mesial temporal lobe epilepsy.</a> Lancet. 363, 28-37 (2004).</li>
<li>Eid, T., Williamson, A., Lee, T. S., Petroff, O. A., de Lanerolle, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+and+astrocytes--key+players+in+human+mesial+temporal+lobe+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Glutamate and astrocytes--key players in human mesial temporal lobe epilepsy.</a> Epilepsia. 49 Suppl 2, 42-52 (2008).</li>
<li>Tong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+Kir4.1+ion+channel+deficits+contribute+to+neuronal+dysfunction+in+Huntington%27s+disease+model+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice.</a> Nat Neurosci. 17, 694-703 (2014).</li>
<li>Ortinski, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+induction+of+astrocytic+gliosis+generates+deficits+in+neuronal+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition.</a> Nat Neurosci. 13, 584-591 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+heterogeneity%3A+an+underappreciated+topic+in+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology.</a> Curr Opin Neurobiol. 20, 588-594 (2010).</li>
<li>Reimsnider, S., Manfredsson, F. P., Muzyczka, N., Mandel, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+transgene+expression+after+intrastriatal+pseudotyped+rAAV2%2F1%2C+rAAV2%2F2%2C+rAAV2%2F5%2C+and+rAAV2%2F8+transduction+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Time course of transgene expression after intrastriatal pseudotyped rAAV2/1, rAAV2/2, rAAV2/5, and rAAV2/8 transduction in the rat.</a> Mol Ther. 15, 1504-1511 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os métodos aqui descritos nos permitiram expressar cito-GCaMP3 em astrócitos do estriado in vivo para posterior [Ca 2+] i imaging in situ. Este método apresenta vantagens em relação ao uso transgénica ou knock-em ratinhos, incluindo expressão robusta da proteína, rapidez e flexibilidade orientada de aplicação experimental e especificidade anatómica. A expressão de GCaMP3 usando AAV2 / 5, foi encontrada para ser mais específico e robusto. A combinação de GFAP GfaABC 1 D ...

Os astrócitos são células gliais ubíquas e abundantes do cérebro. Está bem estabelecido que os astrócitos servir de suporte vital e papéis homeostáticos incluindo buffer de K + concentração no espaço extracelular, a captação de neurotransmissores, bem como o fornecimento de nutrientes. No entanto, estudos recentes mostram que eles também exibem [Ca 2+] i sinais, que ocorrem espontaneamente e são aumentados pela atividade neuronal 1. A existência de astrócitos [Ca 2+] i sinalização tem sido cada vez mais pensado para provocar a sua comunicação com os neurônios, e, como tal, tem sido interpretada como uma forma de &quot;Ca 2+ excitabilidade&quot; dentro de astrócitos. Os dados disponíveis sobre as últimas duas décadas sugerem duas configurações em que os astrócitos e neurônios podem se comunicar, talvez, de forma bidirecional. Em primeiro lugar, os astrócitos, muitas vezes respondem com um aumento na [Ca 2+] i, quando activado pelos neurotransmissores eneuromoduladores liberados de neurônios 2. Em segundo lugar, [Ca 2+] i aumenta em astrócitos causam a liberação de moléculas de sinalização de astrócitos, que por sua vez podem afetar os neurônios e vasos sanguíneos. As evidências sugerem que as moléculas liberadas a partir de astrócitos levar a alterações nas funções de sinapses, circuitos e, em última instância comportamento 3-5 via de sinalização astrócitos-a-neurônio. No entanto, esta continua a ser uma área de pesquisa em rápido desenvolvimento, e tem-se argumentado que uma compreensão melhor e detalhada de astrócitos [Ca 2+] i é necessário para resolver algumas das incertezas atuais 6. Em trabalhos anteriores, foi demonstrado que o carregamento em massa de orgânicos Ca 2+ corantes indicador em astrócitos não consegue detectar com fiabilidade [Ca 2+] i sinais dentro astrócitos inteiras em cultura e in situ 10/07. Estes resultados foram discutidos por nós e outros 6,11,12. A Emerging imagem é que [Ca 2+] i sinais dentro dos processos de astrócitos (por exemplo, ramos e raminhos), que são os principais sítios de interação com neurônios e vasos sanguíneos, raramente têm sido explorados em detalhe. Recentemente, a utilização de indicadores de cálcio geneticamente codificados (Gecis), tais como GCaMP3 citosólica, GCaMP5G e GCaMP6 e membrana de plasma (por exemplo, versões tethered, Lck-GCaMP3) permitiu o estudo da [Ca 2+] i sinais em pequenos compartimentos de astrócitos tais processos como finas, perto da membrana do plasma e dentro territórios inteiros 7,8. No entanto, Gecis têm uma desvantagem sobre orgânicos Ca 2+ corantes indicadores e que é a exigência de métodos genéticos para entregar os genes que codificam para selectivamente astrócitos in vivo por períodos de semanas para a Gecis a ser apropriadamente expressa. Expressão in vivo é tipicamente alcançado utilizando camundongos transgênicos, bater-nos ratos ou com app entrega vírus baseadosbaratas. No presente artigo, relatamos JoVE métodos e procedimentos empregados para entregar Gecis para astrócitos do estriado usando vírus adeno-associados. Nós concentrar em cito-GCaMP3 como um exemplo, mas o mesmo procedimento básico funciona para qualquer outro GECI ou fluorescente repórter base de proteína.

<table><tbody><tr><td>Bomba de seringa</td><td>Harvard Apparatus</td><td>704506</td><td></td></tr><tr><td>Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de micropipeta</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Moedor de micropipeta</td><td>Narishige</td><td>EG-40</td><td></td></tr><tr><td>pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3</td><td>Addgene</td><td>44331</td><td>um plasmídeo enviado para UPenn Vector Core para embalagem de vírus</td></tr><tr><td>Seringa de 1 ml</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>agulha de seringa</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>vírus AAV2/5</td><td>UPenn núcleo de vetor</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Sudão vermelho IV Sigma-Aldrich</td><td></td><td>67386</td><td></td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>CVS Farmácia</td><td>152355</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento estereotáxico</td><td>David Kopf Instruments</td><td>900LS</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Micromotor Rotativo de Alta Velocidade</td><td>FOREDOM</td><td>K.1070</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Super Cola</td><td>Krazy&reg; Cola</td><td>KG925</td><td></td></tr><tr><td>Microslicer</td><td>Ted Pella</td><td>DTK-Zero 1</td><td></td></tr><tr><td>Microscópios confocais</td><td>Olympus</td><td>FV300 e FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra normal</td><td>Vector</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>frango anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>rato anti-s100&beta;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2532</td><td></td></tr><tr><td>camundongo anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>camundongo anti-glutamina sintetase</td><td>Millipore</td><td>MAB302</td><td></td></tr><tr><td>cabra anti-rato-Alexa546</td><td>Invitrogen</td><td>A11003</td><td></td></tr><tr><td>cabra anti-galinha-Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11039</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de Cobertura</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5J</td><td></td></tr><tr><td>Montagem Média</td><td>Vector</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

imagens intracelular ca 2+ sinais em estriado astrócitos de ratos adultos, através de indicadores de cálcio geneticamente codificados

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Os astrócitos exibem flutuações espontâneas na concentração intracelular de Ca2+ ([Ca2+]i) e, em várias configurações, respondem à excitação neuronal com sinais aprimorados de [Ca2+]i. Foi proposto que os astrócitos, por sua vez, regulam neurônios e vasos sanguíneos por meio de mecanismos dependentes de cálcio, como a liberação de moléculas de sinalização. No entanto, a imagem de [Ca2+]i em astrócitos inteiros só recentemente se tornou viável com indicadores de cálcio geneticamente codificados (GECIs), como a série GCaMP. O uso de GECIs em astrócitos agora oferece oportunidades para estudar os sinais de astrócitos [Ca2+]i em detalhes dentro de microcircuitos modelo, como o estriado, que é o maior núcleo dos gânglios da base. No presente relatório, são descritos métodos cirúrgicos detalhados para expressar GECIs em astrócitos in vivo e abordagens de imagem confocal para registrar sinais de [Ca2+]i em astrócitos estriados in situ. Destacamos as precauções, controles e testes necessários para determinar se a expressão do GECI é seletiva para astrócitos e para avaliar sinais de reatividade evidente dos astrócitos. Também descrevemos em detalhes as condições de fatia do cérebro e imagem que permitem imagens confiáveis de [Ca2+]i em astrócitos estriados in situ. O uso dessas abordagens revelou todos os territórios de astrócitos estriados únicos e sinais espontâneos de [Ca2+]i dentro de seus somatas, ramos e ramificações. O uso e a expansão dessas abordagens no estriado permitirão o estudo detalhado dos sinais de astrócitos [Ca2+]i no microcircuito estriado.

Para a expressão especifica de astrócitos de cito-GCaMP3 no striatum, utilizou-se vírus adeno-associado (AAV), do serotipo 5, e a PGFA GfaABC 1 D promotor (Figura 1A), que tem sido mostrado previamente para dirigir GCaMP3 robusta e o gene repórter expressão no hipocampo e astrócitos corticais 8,14. Duas semanas após a micro-injecção de vírus para o corpo estriado do rato, o rato (~ 10 semanas de idade) foi perfundido e IHC foi realizada em secções de cérebro finas para avaliar a ex...

As propriedades e funções dos sinais intracelulares de Ca2+ dos astrócitos no estriado permanecem incompletamente exploradas. Descrevemos métodos para expressar indicadores de cálcio geneticamente codificados em astrócitos estriados usando vírus adeno-associados do sorotipo 2/5 (AAV2/5), bem como procedimentos para obter imagens confiáveis de sinais de Ca2+ em astrócitos estriados in situ.

Imagens intracelular Ca 2+ Sinais em estriado astrócitos de ratos adultos, através de indicadores de cálcio geneticamente codificados

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens de sinais de cálcio intracelular em astrócitos stri AAL de camundongos adultos usando indicadores de cálcio geneticamente codificados, como cyto G CAMP three. Isso é feito injetando primeiro o vírus no estriado do camundongo. Em seguida, o camundongo pode se recuperar por duas a três semanas após a cirurgia.Em seguida, o camundongo é sacrificado e fatias agudas do cérebro são preparadas. A etapa final é realizar imagens confocais de cálcio das fatias cerebrais. Em última análise, a imuno-histoquímica é usada para mostrar que o Cyto G Camp três é expresso apenas em astrócitos, mas não em neurônios, e que a injeção de vírus não causou reatividade evidente dos astrócitos.A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como transgênico ou nochi M, é que ela permite a expressão robusta da proteína-alvo e a implementação experimental rápida e flexível. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de sinalização de cálcio como osteócitos, como medir de forma confiável os sinais de cálcio como osteócitos nos ramos e ramificações dos osteócitos stratas. Prepare-se para a injeção do vírus autoclavagem das mi

imaging-intracellular-ca2-signals-striatal-astrocytes-from-adult-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Descrevemos como medir perto da membrana e global a dinâmica do cálcio intracelular em astrócitos cultivados utilizando reflexão interna total e microscopia de epifluorescência.

Medição Perto membrana plasmática e global Dynamics cálcio intracelular em astrócitos

Um método para carregar subventricular zona (SVZ) de células com corantes de cálcio indicador de actividade de cálcio gravação é descrito. A SVZ pós-natal contém células hermeticamente embalados, incluindo as células progenitoras neurais e neuroblastos. Ao invés de usar o carregamento banho foi injetado o corante por pressão dentro do tecido, permitindo uma melhor difusão de corante.

Preparação de fatias agudas zona subventricular for Imaging Cálcio

Fonte: Bannai, H., et. al., Dissecção de sinais locais de Ca2+ em células cultivadas por indicadores de Ca2+ direcionados à membrana. J. Vis. Exp. (2019)O vídeo demonstra imagens de fluorescência para observar a dinâmica espontânea do cálcio específica do compartimento em astrócitos, monitorando sequencialmente proteínas sensíveis ao cálcio localizadas na membrana plasmática e no retículo endoplasmático.

Imagem espontânea de cálcio para dinâmica específica do compartimento em astrócitos

Descrevemos aqui uma adaptação de protocolos utilizados para induzir plasticidade homeostático em neurónios para o estudo da plasticidade dos receptores acoplados à proteína G astrocíticos. Recentemente usado para examinar as mudanças no grupo I astrocitário mGluRs em ratos juvenis, o método pode ser aplicado para medir o dimensionamento de vários GPCRs astrocitárias, em tecidos de camundongos adultos in situ e in vivo, e para obter uma melhor apreciação da sensibilidade dos receptores...

Induzir Plasticidade de astrocítica Receptores de Manipulação de Neuronal queima de moeda

Aqui nós apresentamos um protocolo ao cálcio imagem sinalização em populações de tipos de células individuais na junção neuromuscular murino.

Ex Vivo Imagem de célula específica cálcio sinalização em sinapse tripartida do diafragma de rato

Ca2 + indicadores geneticamente codificados (GECIs) mudaram radicalmente como in situ Ca2 + imagem é executada. Para maximizar a recuperação de dados de tais gravações, a análise adequada dos sinais de Ca2 + é necessária. Os protocolos neste papel facilitam a quantificação de Ca2 + sinais gravados em situ usando spatiotemporal mapeamento e análise baseada em partículas.

Aplicações de mapeamento de espaço-temporal e técnicas de análise de partículas para quantificar intracelular Ca2 + sinalização em Situ

Este proctocol tem como objetivo fornecer um método para imagens in vitro e in vivo mitocondrial Ca2+ em astrócitos e neurônios.

Imagem Mitocondrial Ca2+ Absorção em Astrócitos e Neurônios usando Indicadores Ca2+ Codificados Geneticamente (GECIs)

O presente protocolo descreve a confecção de uma grande janela craniana (6 x 3 mm2) usando envoltório de alimentos, silicone transparente e vidro de cobertura. Esta janela craniana permite experiências de imagem de cálcio in vivo de campo largo e de dois fótons no mesmo rato.

In vivo Imagem de cálcio de campo amplo e de dois fótons de um rato usando uma grande janela craniana

Este protocolo descreve a exposição cirúrgica do gânglio da raiz dorsal (DRG) seguida de GCaMP3 (indicador Ca2+ codificado geneticamente; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Imagem de Ca2+ dos conjuntos neuronais usando camundongos Pirt-GCaMP3 enquanto se aplica uma variedade de estímulos na pata traseira ipsilateral.

In vivo Imagem com cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios intactos da raiz dorsal

Este protocolo descreve imagens de cálcio GCaMP in vivo de neurônios intactos do gânglio do trigêmeo (TG). Esta descrição inclui cirurgia de exposição TG, imagem de microscopia confocal in vivo de neurônios TG, aplicação de estímulos somáticos durante imagens microscópicas de neurônios TG e análise de dados de imagem de cálcio GCaMP in vivo .

In vivo Imagem de cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios trigêmeos intactos

Esse protocolo fornece uma descrição abrangente de um método para o registro simultâneo de sinais de cálcio de neurônios e astrócitos em múltiplas regiões cerebrais relacionadas à memória e demonstra sua aplicação durante um paradigma de aprendizagem e comportamento da memória.

Um método de fotometria de fibra bicolorida para registrar a atividade dos neurônios dos astrócitos em múltiplas regiões cerebrais durante comportamentos de aprendizagem e memória

Aprenda a imaginar sinais de cálcio intracelular em astrócitos estriados de camundongos adultos usando indicadores de cálcio geneticamente codificados. Este método permite visualizar dinâmicas de cálcio com imagem confocal.

Imagens intracelular Ca 2+ Sinais em estriado astrócitos de ratos adultos, através de indicadores de cálcio geneticamente codificados (Vídeo) | JoVE Journal

Imagens intracelular Ca²⁺ Sinais em estriado astrócitos de ratos adultos, através de indicadores de cálcio geneticamente codificados

Explorar mais vídeos