Avaliação da viabilidade de gordura humana injecção em ratinhos nu com Micro-Tomografia Computadorizada
7 de janeiro de 2015
A lipoenxertia é uma técnica essencial para a reconstrução de déficits de tecidos moles. No entanto, continua sendo um procedimento imprevisível caracterizado por sobrevida variável do enxerto. Nosso objetivo foi criar um modelo de camundongo que utiliza um novo método de imagem para comparar a retenção de volume entre diferentes técnicas de preparação e entrega de enxerto de gordura.
O objetivo geral deste procedimento é descrever um modelo de camundongo que utiliza micro CT para comparar a retenção de volume entre as técnicas de adiamento do preparo e entrega do enxerto de gordura. Isso é feito processando primeiro o lipoaspirado humano para obter gordura pronta para enxerto. O segundo passo é colocar enxertos de gordura no couro cabeludo de camundongos nus tímicos CD one.
Em seguida, a sobrevida do enxerto de gordura é analisada semanalmente por tomografia computadorizada de camundongos, reconstruindo imagens e quantificando a retenção de volume. A etapa final é explicar o enxerto de gordura ao final de oito semanas e compará-los por peso e histologia. Em última análise, a microtomografia computadorizada e a histologia são usadas para mostrar diferenças na qualidade e sobrevida do enxerto de gordura.
A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a pesagem de enxertos de gordura, é que ela permite visualizar e quantificar objetivamente o volume do enxerto de gordura em vários momentos após o enxerto inicial, sem ter que sacrificar o animal do estudo. Tivemos a ideia desse método quando começamos a usar a micro CT para analisar defeitos de calva. As implicações dessa técnica é que ela oferece um modelo cirúrgico para todos os estudos que avaliam enxerto de gordura, retenção e viabilidade.
Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque é difícil conter o enxerto de gordura na posição correta acima do couro cabeludo. A demonstração visual dessa técnica é crítica, pois as etapas de enxerto e reconstrução são difíceis de aprender porque existem vários estágios em que um pequeno desvio na técnica pode alterar o resultado. Usando o procedimento de Coleman, obtenha tecido adiposo humano das regiões do abdômen, flanco e coxa de pacientes saudáveis do sexo feminino submetidas a lipoaspiração eletiva.
Para processar o lipoaspirado para enxertia, comece deixando a gordura assentar por 30 minutos. O lipoaspirado normalmente se instala em três camadas com óleo na parte superior, gordura no meio e sangue na parte inferior. Aspire e descarte a camada superior de óleo seguida pela camada inferior de sangue.
Para remover ainda mais qualquer fluido tumescente remanescente ou detritos celulares, centrifugue a gordura por cinco minutos a 350 Gs e quatro graus Celsius. Após a centrifugação, aspirar a camada inferior de sangue e a camada superior de óleo. Para calcular a quantidade de gordura necessária para enxertia conforme descrito no protocolo de texto, para realizar a lipoenxertia, obtenha-se camundongos fêmeas homozigotos CD one nude.
Para o estudo experimental, escolha camundongos entre oito e 12 semanas de idade para induzir a anestesia. Coloque o mouse em uma caixa de desmontagem com 2,5% da mistura de oxigênio de flúor a dois litros por minuto por aproximadamente 10 minutos Quando a taxa de respiração do mouse diminuir. Confirme a sedação adequada com uma pitada no dedo do pé.
Aplique pomada oftálmica lubrificante veterinária em ambos os olhos do camundongo e coloque o nariz do camundongo em um cone nasal, fornecendo uma mistura de oxigênio de flúor 2,5% ISO de um a dois litros por minuto. Em seguida, configure um campo estéril sob o mouse. Em seguida, esterilize o couro cabeludo com iodo de povidona a 2,5%, seguido de solução de etanol a 70%.
Repita a esterilização mais duas vezes. Carregue uma seringa de trava de isca de um mililitro com um mililitro de gordura que foi equilibrada à temperatura ambiente. Conecte uma cânula de enxerto de gordura de calibre 14 e oito centímetros de comprimento na extremidade da seringa.
Prepare o sistema pressionando o êmbolo da seringa até que entre 200 e 400 microlitros de gordura permaneçam na seringa. Enquanto pressiona o êmbolo da seringa, confirme se a cânula está totalmente cheia de gordura, observando a gordura saindo do orifício da cânula distal usando uma pinça fina. Levante a pele dorsal na linha média que cobre o aspecto mais mimado do crânio.
Faça um corte de 1,5 milímetro na pele usando uma tesoura fina. Coloque uma sutura de náilon de seis oh no meio do corte que mais tarde será usada para unir as bordas da ferida. Após a realização do enxerto, não amarre a sutura.
Em seguida, crie uma bolsa subcutânea sobre o crânio inserindo a cânula através da incisão da pele e passando a cânula para frente e para trás em um padrão em forma de leque sobre o crânio para liberar quaisquer anexos de tecido conjuntivo à pele sobrejacente uma vez que a bolsa tenha sido criada, posicione a cânula na linha média do mouse diretamente sobre o crânio até que a ponta fique no aspecto theramos da bolsa, que deve estar logo atrás de uma linha traçada entre os olhos. Injete lentamente a gordura de forma retrógrada, avançando o êmbolo enquanto puxa a cânula para trás. Usando uma pinça, junte as bordas da ferida e levante-as para evitar que a gordura vaze do bolso.
Amarre a sutura que foi colocada anteriormente, certificando-se de que o primeiro nó fique levemente encostado na pele. Dê mais três nós quadrados e corte a sutura com uma cauda de três milímetros. Remova o mouse da anestesia e prossiga com a recuperação conforme detalhado no protocolo de texto.
Antes de realizar a primeira varredura, calibre a micro TC com um simulador de imagem que distingue entre intensidade do ar, da água e do osso. Após a calibração. Coloque quatro ratos no scanner na posição ventral com dois ratos na parte superior e dois na parte inferior.
Coloque em uma cama de digitalização. Construído previamente a partir de seringas de 60 mililitros para segurar o corpo do rato e seringas de 10 mililitros como cones nasais. Confirme com uma imagem de batedor que todo o crânio do camundongo, do nariz à primeira vértebra cervical e do topo do crânio à base do crânio, será fotografado.
Continue com a verificação conforme detalhado no protocolo de texto. Abra as imagens reconstruídas com um software de análise de imagens de micro TC que permite a criação de regiões de interesse ou ROIs selecionando voxels usando limites para intensidade de pixels. Comece carregando as imagens de TC reconstruídas em vistas bidimensionais, coronais, axiais e sagitais.
Usando o corte axial como guia, navegue até o corte sagital que corresponde ao aspecto mais à esquerda do enxerto de gordura. Selecione um limite superior e inferior para a intensidade de pixels que capture todos os voxels correspondentes ao enxerto de gordura, mas que exclua o tecido e o osso circundantes. Defina um ROI na visão sagital que corresponda ao enxerto de gordura.
Usando limites de intensidade de pixel previamente definidos, repita este procedimento a cada cinco cortes sagitais navegando até que o aspecto mais à direita do enxerto seja alcançado. Em seguida, interpolar Voxels selecionados de todas as ROIs 2D em uma única ROI 3D combinada registre o volume de ROI calculado pelo software. Renderize a isossuperfície 3D para visualizar o volume final do enxerto de gordura.
Na análise subsequente, certifique-se de manter os valores de limite máximo e mínimo de intensidade de pixel iguais aos usados para a análise de linha de base após os mouses terem sido escaneados para o ponto de tempo da semana oito. Eutanasiar os camundongos conforme descrito no protocolo de texto. Coloque o mouse no campo operatório usando uma tesoura de tenotomia, abra cuidadosamente a bolsa e a pele sobreposta e as inserções de tecido conjuntivo do enxerto de gordura.
Neste ponto, pode ser útil extirpar um remendo da pele dorsal sobrejacente para ajudar na extração do enxerto. Fique o mais próximo possível do enxerto ao excisão para minimizar o tecido conjuntivo retirado do enxerto após a excisão do enxerto. Meça a massa em uma escala rasgada com precisão de pelo menos 0,01 gramas.
Os enxertos de gordura diminuíram progressivamente de volume ao longo do estudo, resultando em 62,2% de sobrevida média na oitava semana. Ao final do exame da oitava semana, cada enxerto de gordura foi extraído em uma única peça. Um teste WIL coxin rank sum foi usado para comparar a diferença entre as medidas de volume do enxerto de gordura obtidas por micro CT ou calculadas a partir da massa física.
Não foi encontrada diferença significativa entre esses dois métodos. Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada em duas horas por sessão, se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de realizar as cirurgias e reconstruções da mesma maneira todas as vezes após este procedimento.
Outros métodos, como imunocoloração e Q-R-T-P-C-R, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como como a vascularização e a expressão gênica são influenciadas por diferentes métodos de enxerto. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como processar lipoaspirado para enxerto de enxerto em série de enxertos de tomografia computadorizada in vivo, avaliar a sobrevida do enxerto e explicar enxertos para histologia de peso e análise futura após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de cirurgia plástica explorarem a lipoenxertia no modelo de espelhamento.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um modelo murino que utiliza tomografia computadorizada micro para avaliar a retenção de volume em enxertos de gordura. A pesquisa tem como objetivo comparar diferentes técnicas de preparo e aplicação de enxertos de gordura, abordando a imprevisibilidade da sobrevivência do enxerto.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Medicina Regenerativa
- Técnicas de Imagem
Contexto
- O enxerto de gordura é essencial para a reconstrução de defeitos nos tecidos moles.
- O procedimento frequentemente enfrenta desafios relacionados à sobrevida variável do enxerto.
- A imagem por microtomografia computadorizada oferece uma abordagem inovadora para avaliar a retenção do enxerto.
- Compreender os mecanismos de sobrevida do enxerto pode melhorar os resultados clínicos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um modelo murino confiável para análise de enxertos de gordura.
- Utilizar tomografia computadorizada micro-CT para comparar a retenção de volume do enxerto.
- Avaliar a eficácia de diferentes técnicas de preparação de enxertos de gordura.
Métodos Utilizados
- Processamento do lipoaspirado humano para enxertia.
- Colocação de enxertos de gordura nos couros cabeludos de camundongos nuas timectomizados CD1.
- Escaneamento semanal por TC para analisar a sobrevivência do enxerto de gordura.
- Exame histológico e comparação de peso após oito semanas.
Resultados Principais
- A imagem por micro-TC quantificou com sucesso a retenção de volume dos enxertos de gordura.
- A análise histológica revelou diferenças na qualidade do enxerto.
- A sobrevida do enxerto variou significativamente entre as técnicas de preparação.
- O modelo fornece informações para a otimização dos procedimentos de enxertia de gordura.
Conclusões
- O modelo com camundongo é eficaz para estudar a retenção de enxertos de gordura.
- A micro-TC e a histologia são ferramentas valiosas para avaliar enxertos.
- Os achados podem levar a estratégias aprimoradas para enxertos de gordura em ambientes clínicos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O enxerto de gordura enfrenta desafios na translação clínica devido a taxas imprevisíveis de sobrevivência do enxerto, que variam de 10 a 80%, gerando incerteza nos resultados reconstrutivos. Este modelo permite a quantificação longitudinal e não invasiva da retenção do volume do enxerto por meio de micro-TC, fornecendo dados objetivos e repetíveis ao longo dos diferentes momentos avaliados, sem a necessidade de pontos finais terminais. Ao reduzir a variabilidade biológica e apoiar a redução de riscos mecanicistas, melhora a confiabilidade preditiva na avaliação pré-clínica de terapias regenerativas baseadas em adipócitos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio do acompanhamento da viabilidade do enxerto de gordura como indicador funcional da sobrevivência e enxertia de adipócitos.
- Valor Operacional: Apoia a redução de riscos biológicos por meio de imagens seriadas in vivo que se correlacionam com pontos finais histológicos e gravimétricos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera medidas quantitativas padronizadas de volume que permitem comparação confiável entre técnicas de preparação de enxertos.
- Valor Operacional: Facilita a padronização de ensaios por meio de limiares consistentes de ROI e varreduras seriadas, melhorando a reprodutibilidade entre operadores e locais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Oferece continuidade do sistema relevante para a doença ao vincular a captação inicial do enxerto à sobrevida de longo prazo por meio de validação multimodal (micro-TC, histologia, peso).
- Valor Operacional: Permite decisões de avanço ajustadas ao risco ao identificar métodos de preparação com retenção de volume superior a 60% após oito semanas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a caracterização inicial de adipócitos até a validação pré-clínica, apoiando decisões de prosseguir ou interromper com base na estabilidade volumétrica e na qualidade histológica.
- Biologia da Descoberta: Testa hipóteses sobre enxerto de adipócitos e suporte microambiental mediante a medição da retenção de volume como um marcador indireto da captação funcional do enxerto.
- Triagem: Fornece sistemas biológicos padronizados e prontos para ensaio, com resultados quantificáveis adequados para comparar variáveis de processamento de lipoaspirado.
- Análises: Gera leituras volumétricas e isosuperfícies 3D que permitem comparação estatística da sobrevivência do enxerto entre grupos experimentais.
- Pesquisa Translacional: Relaciona fenótipos de imagem precoces com histologia final e peso, apoiando o alinhamento de biomarcadores para viabilidade do enxerto.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma de imagem reutilizável para estudo longitudinal de enxertos de tecido mole em terapias derivadas de adipócitos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade mecanicista na sobrevida do enxerto de gordura por meio de visualização direta e objetiva.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e escalabilidade ao substituir o sacrifício terminal por sessões repetíveis de imagem não terminais.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisão de prosseguir ou não ao fornecer biomarcadores quantitativos precoces da integração do enxerto, reduzindo o risco de falha em estágios tardios.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização baseada em risco de estratégias de otimização de enxertos de gordura utilizando dados longitudinais de retenção.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em enxertia de gordura microcirúrgica e operação de micro-TC, incluindo limiarização de ROI e reconstrução 3D.
- Depende do acesso a escâneres de micro-TC com resolução espacial suficiente para distinguir enxertos de gordura do osso calvarial e dos tecidos sobrejacentes.
- Necessita padronização entre equipes das técnicas de enxertia, protocolos de anestesia e parâmetros de análise de imagem para minimizar a variabilidade técnica.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes volumes de enxerto, pois injeções maiores apresentam risco de necrose e comprometem a integridade dos dados.
- Limitado pela restrição anatômica do modelo de couro cabeludo, que pode não recapitular completamente leitos de tecidos moles vascularizados em locais clínicos.
