Name: Um In Vitro Ensaio Enzimático para Medir Inibição da transcrição pelo gálio (III) e H 3 5,10,15-tris (pentafluorofenil) corroles (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Aprenda a avaliar a inibição da transcrição de RNA por compostos anticâncer usando eletroforese em gel e espectroscopia UV-Vis. Este ensaio in vitro identifica candidatos a fármacos como o corrol de gálio(III).

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Agradecemos sinceramente Dr. Cindy N. Chiu para obter ajuda com eletroforese em gel, e Andy Zhou e Michael Grodick por sua generosa doação de DNA e enzimas de restrição. Agradecemos Professor J. Heath e Professor D. Prober para acesso generoso para equipamentos e materiais. Agradecemos ao Dr. Karn Sorasaenee para sugestões úteis. Agradecemos Mary H. Tang para a criação da ilustração usada no panorama de conjunto no vídeo. O financiamento foi fornecido pela Johnson &amp; Johnson e USC Y86786.

NOTA: Quando se trabalha com RNA manter um ambiente de trabalho limpo para evitar a contaminação por DNase e RNase enzimas que degradam o DNA e RNA. Assegurar que as pontas de pipetas e tubos são DNase e RNase livre. Também é útil para limpar as superfícies de laboratório e equipamentos, tais como pipetas, suportes para tubos, etc., com uma solução de descontaminação. Transcrição com ARN 1. Tratamento Corrole <ol><li> Prepare o corrole e os compostos inibidores de 0,01: 1 proporção molar de [complexo]: [ADN]. NOTA: No nosso caso, a proporção foi de 4,3 complexo fmol: 0,43 pmol DNA, onde o modelo de DNA utilizado foi vector APET-28c com gene Liga de E. coli sob o controlo do promotor de T7. Outros ADN com o promotor T7 também são candidatos válidos para a execução do ensaio de transcrição. <ol><li> Dissolve-se Actinomicina D, triptolido, tpfc, e Ga (tpfc) em dimetil sulfóxido (DMSO) em recipientes limpos, separadas. Obter a concentração final de 0,01: 1 proporção molar de [complex]: [DNA] utilizando diluições em série com água livre de nuclease. <ol><li> Dissolve-se 1 mg de actinomicina D em 1,8 ml de DMSO. Aliquota de 10 ul para um recipiente separado e diluído para 1 ml com água isenta de nuclease para criar uma diluição de 1/100. Aliquota de 1 ul da diluição para um recipiente separado e diluído para 1 ml com água isenta de nuclease para criar uma diluição 1 / 1.000. NOTA: A concentração da solução final de actinomicina D é 4,3 fmol. </li><li> Dissolve-se 1 mg de triptólido, em 0,64 ml de DMSO. Alíquota 1 ul a um recipiente separado e diluído para 1 ml com água isenta de nuclease para criar uma diluição 1 / 1.000. Aliquota de 1 ul da diluição para um recipiente separado e diluído para 1 ml com água isenta de nuclease para criar uma segunda diluição 1 / 1.000. NOTA: A concentração da solução final é de 4,3 fmol de triptólido. </li><li> Dissolve-se 1 mg tpfc em 2,9 ml de DMSO. Aliquota de 10 ul para um recipiente separado e diluídas para 1 ml com água isenta de nuclease para criar um 1/100 dilution. Aliquota de 1 ul da diluição para um recipiente separado e diluído para 1 ml com água isenta de nuclease para criar uma diluição 1 / 1.000. NOTA: A concentração da solução final é de 4,3 fmol tpfc. </li><li> Dissolve-se 1 mg de Ga (tpfc) em 2,6 ml de DMSO. Aliquota de 10 ul para um recipiente separado e diluído para 1 ml com água isenta de nuclease para criar uma diluição de 1/100. Aliquota de 1 ul da diluição para um recipiente separado e diluído para 1 ml com água isenta de nuclease para criar uma diluição 1 / 1.000. NOTA: A concentração da solução final de Ga (tpfc) é de 4,3 fmol. NOTA: Estes corroles e inibidores não são solúveis em água e devem ser pré-dissolvido em DMSO. Pequenas quantidades de DMSO (abaixo de 1%) não induzem citotoxicidade nas células (dados não publicados). </li></ol></li></ol></li><li> Antes do início da reacção de transcrição, preparar os reagentes necessários individualmente ou adquiri-los a partir de um fornecedor comercial. <ol><li> Thaw no gelo congelou todosn reagentes (consulte a Tabela 1 para obter uma lista de reagentes congelados). </li><li> Permitir que a 10x tampão de reacção e a 4 ribonucleótido (ATP, CTP, GTP, UTP) e soluções tempo a misturar até que eles estão completamente dissolvidos na solução. </li><li> Resumidamente Centrifugar todos os reagentes para evitar a perda de material sobre o aro do tubo. Uma vez descongelado, ribonucleótidos armazenar em gelo, mantendo a 10x tampão de reacção à temperatura ambiente. </li><li> Combine reagentes para a reação de transcrição na RT (consulte a Tabela 2 para obter uma lista de reagentes). NOTA: A espermidina na 10x tampão de reacção pode coprecipitado de DNA molde, se a reacção é montada sobre gelo, em vez de à temperatura ambiente. </li><li> Misture bem sacudindo o tubo ou pipetar a mistura para cima e para baixo com cuidado. Depois de se misturar, brevemente centrífuga para recolher mistura de reacção no fundo do tubo. </li><li> Incubar a mistura de reacção a 37 ° C durante um total de 2-4 horas. NOTA: Os tempos de reação necessárias variarácom o tamanho do modelo de ADN e a sequência. Este passo pode requerer optimização para sequências específicas. Modelos mais curtos podem requerem tempos de reacção mais longos para um elevado rendimento de ARN total. </li><li> Remover 4 mL alíquotas de cada reacção após cada hora e armazenar a -20 ° C. Modificar como necessário para timepoints desejados. </li></ol></li></ol> 2. RNA spin Coluna <ol><li> A seguir à reacção de transcrição, purificar o ARN utilizando colunas de cromatografia de microcentrífuga-compatível. NOTA:. A utilização de colunas de RNA de rotação para purificar RNA com maior do que 20 bases originou uma recuperação superior a 80% 44 NOTA: A cromatografia em coluna é um método comum e conveniente para purificar o ARN. Outros métodos de purificação também existir como precipitação Cloreto de lítio, extracção com fenol: clorofórmio, precipitação com isopropanol, bem como outros kits disponíveis comercialmente. <ol><li> Ressuspender uniformemente na matriz de Sephadex em tampão de coluna por vigorosamente invertendo ocoluna de três ou mais vezes. Faça isso por um movimento súbito da coluna acentuadamente. </li><li> Remover o tampão de topo da coluna. Haverá alguma matriz de Sephadex residual na tampa; se a tampa é preenchido com a matriz, substituir a tampa na coluna e repetir o passo anterior até que a maioria da matriz é na coluna. </li><li> E cortar a extremidade inferior da coluna. Nota: Alguns líquido pode escapar da coluna. </li><li> Encher a coluna. <ol><li> Coloque coluna em uma estéril (RNase e DNase livre) tubo de 1,5 ml de microcentrífuga. </li><li> Centrifuga-se o tubo numa centrifugadora de bancada a 1000 x g durante 1 min. </li></ol></li><li> Descartar o tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com tampão de eluído a partir da coluna. </li><li> Colocar imediatamente a coluna em um novo tubo de 1,5 mL de microcentrífuga estéril e pipetar a amostra para o centro do leito da coluna. Use 20-50 mL de amostra para evitar sobrecarregar a coluna. </li><li> Centrifuga-se o tubo numa centrífuga de mesa a 1000 xgdurante 1 min. NOTA: O eluente é a amostra de RNA purificado. </li></ol></li></ol> 3. Agarose Gel de Eletroforese (1% do gel de agarose) 42 NOTA: O brometo de etídio fluorescência após a ligação ao ADN e ARN, por conseguinte, estas biomoléculas pode ser visualizada com luz UV, incubando-as com 0,5 ug ml de brometo de etídio / solução. <ol><li> Prepara-se uma solução estoque de 1.000x brometo de etidio (0,5 mg / ml) por dissolução de 5 mg de brometo de etídio em 10 ml de água. </li><li> Prepare Tris Acetato EDTA (TAE) tampão de corrida para eletroforese em gel. Para fazer um tampão TAE combinar 50x 2,0 M de Tris-acetato com 0,05 M de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e ajustar o pH para 8,5. </li><li> Prepara-se uma 1% (peso / volume) em gel de agarose por dissolução de 10 g de agarose UltraPure em 1 L de tampão 1x TAE e derretendo a agarose com um forno de microondas convencional. Uma vez arrefecida a 50 ° C, adiciona-se 1 ml de brometo de etídio a 1.000x a solu gel de agarose a 1%ção, misture agitando suavemente por inversão ou num recipiente fechado, em seguida, verter a solução de agarose num gel de plataforma de fundição e para permitir que o gel solidificar à temperatura ambiente. NOTA: O brometo de etídio é um agente mutagênico e potencial cancerígeno. Usar luvas e lidar com soluções cuidadosamente. Para o manejo adequado de brometo de etídio, por favor consulte: <a href="http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667">http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667</a> . </li><li> Depois que o gel tem solidificado, coloque o gel set no tanque de eletroforese. Adicionar tampão TAE suficiente para cobrir o gel até que os poços estão submersos. Verificar se o nível do tampão TAE cerca de 1 mm acima do nível do gel. Remover o pente de gel. Observação: remover o pente depois de poços estão submersos impede bolsas de ar fique preso nos poços. </li><li> Preparar as amostras de ARN. Combine 1 ml de cada alíquota de amostra purificada com 1 ml Carregando Gel Buffer (ou com 1 ml de 10x tampão de carregamento e diluted para 10 mL com água livre de nuclease) e misture bem por pipetagem cima e para baixo com uma micropipeta. NOTA: tampão de carga 10x contém 20% de Ficoll 400, 0,1 M de Na 2 EDTA, pH 8,0, 1,0% SDS, 0,25% de azul de bromofenol. 0,25% de xileno cianol pode também ser adicionado ao tampão de carga, enquanto é executado ~ 50% mais rápido que o azul de bromofenol e pode ser útil para a monitorização muito longas. 42 </li><li> Carregar o gel com cada amostra, pipetando cuidadosamente a solução para o fundo de cada poço. Tome cuidado para não deixar as bolhas de ar ou misturar as amostras entre poços. NOTA: Uma escada de ARN também pode ser utilizado para determinar o tamanho do transcrito. </li><li> Ligue os fios de modo a que o ADN vai migrar para o gel em direcção ao polo positivo. Ajustar a tensão até ao nível desejado, tipicamente de 1 a 10 V / cm do gel. Submeter o gel independentemente do tempo é suficiente para a separação significativa entre os fragmentos de ARN, utilizando a migração de corantes para monitorar o progresso da separação. NOTA: A 23 cm x 25 cm gel em 250 V levará aproximadamente 1 hora, enquanto um 8 cm x 8 cm gel em 150 V levará cerca de 20 min. Fragmentos de RNA mais pequenas têm uma melhor resolução quando executado em voltagens mais altas. </li><li> Desligue a fonte de alimentação quando o corante do tampão de carregamento migrou uma distância considerados suficientes para a separação entre os fragmentos de RNA. </li><li> Imagem do ARN sob luz UV como o brometo de etídio ficam fluorescentes. </li><li> Tire uma foto da imagem e comparar intensidades de fluorescência do RNA purificado de cada condição. </li></ol> 4. RNA Quantificação via Espectroscopia UV-Vis <ol><li> Coloque 2 l H 2 O em uma NanoDrop 2000 ou máquina similar, e medir o Branco. </li><li> Em seguida, colocar 2 ul de cada amostra de ARN, após purificação, no espectrofotómetro e medir UV-Vis a partir de uma gama de comprimentos de onda de 200 nm a 800 nm. NOTA: O 260 Uma leitura de 1,0 é equivalente a cerca de 40 ug / ml de ARN,e ARN puro tem um A 260 / A proporção de 2,1 280 45. </li><li> No caso em que é absorvância superior a 1, OD, diluir as amostras em água isenta de nuclease para obter uma DO menor do que 1. </li><li> Use software de gráficos para traçar as várias amostras e comparar OD a 260 nm. </li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Este ensaio demonstra que a adição de Ga (tpfc) inibe a transcrição de ARN comparavelmente aos complexos anticancro de ligação de ADN conhecidos actinomicina D e triptólido. O comportamento citotóxico de Ga (tpfc) (GI = 50 58,1-154,7 M) pode, devido às suas propriedades inibidoras. Uma vez que não foi observada inibição da transcrição em tpfc, a citotoxicidade de tpfc não é devido a inibição da transcrição de ARN, mas é causada por outros meios, ainda não estudadas. Nos quatro rea...

A quimioterapia muitas vezes envolve amplo espectro agentes citotóxicos com efeitos colaterais indesejáveis ​​e segmentação limitado, mas com uma maior compreensão da biologia do câncer, há uma demanda cada vez maior por agentes anticancerígenos com maior eficácia a segmentação câncer e menos efeitos colaterais. 1 células cancerosas humanas tornam-se frequentemente dependente de um único oncogene activado ou super-expresso para a sobrevivência. 2 Assim, muitas drogas anti-cancro são avaliados pela sua capacidade para inibir a transcrição do RNA. Os tratamentos que bloqueiam a expressão destes genes transformantes são eficazes na eliminação de células cancerosas e conduzir à morte celular. 3 As células transformadas são mais sensíveis às perturbações na transcrição de ARN que são células normais correspondentes. 4 fármacos anti-cancro que inibem a transcrição são esperados para inibem selectivamente a expressão de oncogenes que são necessários para a célula cancerosa para sobreviver. 5 Por conseguinte, a transcrição do RNA inhibition é uma maneira útil para identificar potenciais candidatos a medicamentos anticâncer e aprender mais sobre seu mecanismo de ação. Este protocolo demonstra que Ga (tpfc) inibe a transcrição de ARN na mesma ordem que as drogas quimioterápicas actinomicina D e triptólido; Comparações semelhantes podem ser feitas usando este protocolo com outros candidatos a fármacos anticâncer. Actinomicina D é um inibidor da transcrição RNA comumente usado para tratar câncer trofoblástica gestacional, câncer testicular, tumor de Wilms, rhabdomyosacoma, e Ewing do sarcoma 6. Actinomicina D tem sido utilizado em terapia de cancro para cerca de cinquenta anos desde que foi aprovado pela FDA em primeiro lugar em 1964.Triptolide é um inibidor selectivo de transcrição que tem sido investigado in vitro e em diversos modelos animais portadores de tumores de 30 anos. 7 A natureza macrocyclic amphiphilic de corroles confere vantagens significativas sobre outras classes de drogas, tais como moléculas pequenas ou biológicos. 8-14 O carácter macrocíclico permite a permeabilidade celular, que é maior do que o esperado para tais moléculas grandes, e que são suficientemente grandes para interagir com superfícies macromoleculares, tais como os de proteínas. Corroles 8 são conhecidas por formar complexos não covalentes apertadas com biomoléculas e drogas. 10 Além da citotoxicidade inerente do quadro corrole, nós demonstramos que a corrole sulfonados actua como uma molécula veículo para agentes quimioterapêuticos, especialmente a antraciclinas doxorubicina droga intercalante de ADN. Quando o corrole sulfonado foi co-administrado com a doxorrubicina, um aumento de 3 vezes na IC50 de doxorrubicina foi observado para células DU-145. 9 O quadro corrole é estável e tem de absorvância e fluorescência propriedades intrínsecas que, quando funcionalizado, se submetem a mudanças únicas de absorvância que podem ser utilizados para a caracterização. 10 Funcionalização de andaime não inerentemente affect as propriedades fotofísicas da corrole, 9-15, mas, como pode ser visto com um corrole sulfonado, modificando selectivamente a estrutura do corrole pode alterar substancialmente as suas propriedades biológicas. 16 já foi previamente avaliada seis metallocorroles contra sete linhas de células de cancro humano. Os resultados indicam que a toxicidade em relação às células cancerosas humanas é dependente do ião de metal específico, bem como a substituição do grupo funcional. Por exemplo, de gálio corroles sulfonados experimentado alta absorção celular e penetrou selectivamente para dentro do núcleo de células cerebrais de cancro da próstata metastizado (DU-145); células da mesma corrole, embora não penetre no núcleo de outras linhas de células, apresenta uma maior citotoxicidade da mama (MDA-MB-231), melanoma (SK-MEL-28), e do ovário (OVCAR-3) do cancro do que para cancro da próstata. 9 Os ensaios baseados em células iniciais indicam que estes compostos são promissores como agentes terapêuticos anti-cancro, que merece Further investigação sobre o mecanismo de acção. Inibição da transcrição é observado com certos complexos organometálicos 17-27 e procurou-se examinar este processo como um mecanismo possível para o comportamento citotóxico da família corrole. Este ensaio de transcrição proporciona um método simples, de baixo custo, e fácil para avaliar a inibição de transcrição, o que irá conduzir a uma informação mais detalhada acerca dos efeitos destas moléculas em células vivas. Aqui, a inibição da transcrição de gálio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) e o seu análogo de base livre 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (Figura 1) são testados. Ao contrário de alguns complexos de metais de transição, gálio (III) é inactiva redox e, por conseguinte, não está directamente envolvido no processo redox de vias metabólicas à base de redox. 28 Independentemente, gálio (III) que apresentam propriedades citotóxicas e tem sido investigada para fins terapêuticos. Gálio é o segundo metal mais promissora para terapias anticâncer após platina e foi submetido a muitos estudos e investigações; sais de nitrato e cloreto de gálio foram avaliadas em ensaios clínicos contra hepatoma, linfomas, cânceres de bexiga, e outras doenças. 29-34 gálio (III) é, portanto, ideal para anticancerígenos estudos corrole. Os dados iniciais mostram Ga (tpfc) e tpfc têm baixa GI 50, a concentração de droga necessária para inibir 50% da proliferação celular máxima, com várias linhas celulares de cancro (ver Figura 2); este afirma a validade de novas experiências com estes dois compostos para determinar suas propriedades inibidoras. Nós comparar estes compostos com as drogas anticâncer comum Actinomicina D e triptólido. Actinomicina D intercala ADN, ARN inibe o alongamento, e induz a apoptose em certa linha de células em concentrações picomolares 6,35-37 Triptólido tem mostrado inibir o crescimento do tumor.; liga-se a XPB humano / ERCC3, uma subunidade ofactor de transcrição f TFIIH, levando à inibição da actividade de ARN-polimerase II. 6-7,38-40 Enquanto é vulgarmente conhecido que corroles apresentam propriedades citotóxicas, existe pouca informação sobre os diferentes mecanismos decorrentes de funcionalização. Inibição Corrole de RNA transcrição iria oferecer um maior conhecimento sobre suas interações com biomacromoléculas. Outros complexos conhecidos por se ligarem ao ADN, tais como dirhodium (II, II), complexos de crómio (III), complexos, de ruténio (II) polypyridyl, ródio (III), complexos, e vários outros, foram submetidas a ensaios de transcrição de ARN, 18- 27 resultando em uma maior compreensão de suas interações com biomacromoléculas. Esta experiência fácil e amplamente disponível é também um bom teste inicial para avaliar as propriedades de citotoxicidade de uma dada molécula e determinar se deveria ser mais testes biológicos. O ensaio também permite a transcrição do RNA para várias modificações, tais como varying, a quantidade de composto ou enzimas utilizada; variando o período de incubação, tempo de reacção e pontos de tempo de amostragem; e variando-se o comprimento e a sequência de DNA molde, entre outras variáveis ​​de interesse, assim, potencialmente oferecendo uma grande quantidade de dados. Este ensaio de transcrição também está prontamente disponível como kits preços acessíveis, com todos os componentes necessários, desde reação, embora os componentes podem ser comprados e preparados individualmente. Nestas experiências, podemos usar um kit disponível comercialmente conhecido por ter um rendimento elevado 41. Para avaliar a inibição da transcrição, usamos dois métodos: eletroforese em gel de agarose e espectroscopia UV-Vis. Electroforese em gel de agarose é um método simples e eficaz para a separação, identificação e purificação de 0,5 a fragmentos de ADN e ARN de 25 kb. 42 espectroscopia UV-Vis pode ser utilizado para determinar a concentração e pureza do ARN. 43

<table><tbody><tr><td>Actinomicina D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1410</td><td>Loja em 2-8 &deg; C, proteger da luz</td></tr><tr><td>Triptolide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3652</td><td>Armazenar em 2-8 &deg; C, protege de</td></tr><tr><td>H2O&nbsp; livre de nuclease</td> leveKit de Transcrição MEGAscript T7 <td>Life Technologies</td><td>AM9938</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Life Technologies</td><td>AM1334</td><td>Loja em &ndash; 20 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Brometo de Etídio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td>CUIDADO: Para procedimentos de manuseio adequados de brometo de etídio, consulte: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667</td></tr><tr><td>Acetato de Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6025</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure</td><td>Agarose Life Technologies</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>mini Colunas de RNA de Rotação Rápida</td><td>Roche Life Science</td><td>11814427001</td><td>Store em 2-8 &deg; C, não congele</td></tr><tr><td>1 kb DNA Ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232S</td><td>Loja em &ndash; 20 &deg; C&nbsp;</td></tr></tbody></table>

um<em&gt; in vitro</em&gt; ensaio enzimático para medir inibição da transcrição pelo gálio (iii) e h<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorofenil) corroles

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

A quimioterapia envolve frequentemente largo espectro de agentes citotóxicos com muitos efeitos secundários e direccionamento limitado. Corroles são uma classe de macrociclos tetrapirrólicos que exibem propriedades citostáticas e citotóxicas diferenciais em linhas de células específicas, dependendo das identidades dos metálico quelado e grupos funcionais. O comportamento única de corroles funcionalizados para linhagens celulares específicas introduz a possibilidade de quimioterapia alvejado. Muitos medicamentos anti-cancerígenos são avaliados pela sua capacidade para inibir a transcrição do RNA. Aqui apresenta-se um protocolo passo-a-passo para transcrição de ARN na presença de inibidores conhecidos e potenciais. A avaliação dos produtos de ARN da reacção de transcrição por electroforese em gel e espectroscopia de UV-Vis fornece informações sobre as propriedades inibidoras de potenciais candidatos a fármacos anti-cancro e, com modificações para o ensaio, mais sobre o seu mecanismo de acção. Poucoé conhecido sobre o mecanismo molecular de acção de citotoxicidade corrole. Neste experimento, consideramos dois compostos corrole: gálio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) e analógica freebase 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc). Um ensaio de transcrição do RNA foi usado para examinar as propriedades inibidoras dos corroles. Cinco reacções de transcrição foram preparados: ADN tratado com actinomicina D, triptolido, Ga (tpfc), a uma tpfc [complexo]: [ADN molde de base] razão de 0,01, respectivamente, e um controlo não tratado. As reacções de transcrição foram analisadas após 4 h utilizando electroforese em gel de agarose e a espectroscopia UV-Vis. Existe um claro inibição por Ga (tpfc), Actinomicina D, e triptolide. Este ensaio de transcrição de ARN pode ser modificado para proporcionar mais detalhe mecanicista, variando as concentrações do complexo anti-cancro, o ADN, ou uma enzima polimerase, ou por incubação da polimerase do ADN ou com o complexes antes da transcrição de ARN; estas modificações se diferenciar entre um mecanismo envolvendo a inibição do ADN ou a enzima. A adição do complexo após a transcrição do RNA pode ser utilizado para testar se os complexos de degradar ou hidrolisar o RNA. Este ensaio também pode ser usado para estudar candidatos anticancerígenos adicionais.

RNA Transcrição avaliados qualitativamente por Agarose Gel de Eletroforese Electroforese em gel de agarose é utilizada para a imagem do ARN transcrito. O brometo de etídio fluorescência após ligação (λ em = 605 nm, λ ex = 210 nm, 285 nm) 46, permitindo imagens de ARN. Faixas mais escuras no gel correspondem a maiores concentrações de ARN. Se a Actinomicina D, triptolido, ou qualquer complexo corrole inibe a transcrição de ARN, a produção de R...

O gálio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole e seu análogo freebase apresentam baixa citotoxicidade celular micromolar. Este manuscrito descreve uma reacção de transcrição de ARN, ARN de imagem com um gel corado com brometo de etídio, e quantificar RNA com espectroscopia de UV-Vis, a fim de avaliar a inibição da transcrição por corroles e demonstra um método simples de avaliar as propriedades anti-cancro candidatas.

Um<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensaio Enzimático para Medir Inibição da transcrição pelo gálio (III) e H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorofenil) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

O objetivo geral deste procedimento é determinar se compostos potencialmente anticancerígenos inibem a transcrição do ácido ribonucleico, ou RNA. Isso é realizado primeiramente preparando reações de transcrição de RNA, incluindo inibidores potenciais neste experimento, compostos CHO que apresentam propriedades citotóxicas diferenciais são investigados quanto à inibição da transcrição de RNA e comparados com inibidores conhecidos. Após misturar bem as reações, os tubos de reação são incubados a 37 graus Celsius e alíquotas são retiradas nos pontos de tempo desejados.A seguir, a eletroforese em gel é utilizada para avaliar a inibição relativa, porque um brometo de irídio fluoresce ao se ligar ao RNA; assim, as faixas mais escuras no gel correspondem a concentrações mais altas de RNA. Para quantificar o grau de inibição da transcrição, é realizada espectroscopia na região do ultravioleta, visível ou UV-vis. Em última análise, este vídeo demonstra um método simples para avaliar as propriedades de candidatos a agentes anticancerígenos.Ao avaliar a inibição da transcrição por corais, drogas potencialmente anti-câncer devem ser analisadas quanto à sua capacidade de inibir a transcrição de

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Reprimir a transcrição do Gene redirecionando maquinaria celular com modificadores epigenéticas químicas

A imunoprecipitação da cromatina (ChIP) é uma ferramenta poderosa para a compreensão dos mecanismos moleculares da regulação genética. No entanto, o método envolve dificuldades na obtenção de fragmentação cromatina reprodutível por cisalhamento mecânico. Aqui, nós fornecemos um protocolo melhorado para um ensaio da microplaqueta usando a digestão enzimática.

Ensaio de imunoprecipitação cromatina utilizando nucleases Microcócicas em células de mamíferos

Este protocolo utiliza uma reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR), um ensaio de sulforhodamina B (SRB), 3 ' regiões não traduzidas (3 ' UTR) clonagem e um ensaio de luciferase para verificar os genes alvo de um miRNA de interesse e para compreender as funções de miRNAs.

Protocolo in vitro para avaliação de níveis de MicroRNA, funções e genes alvo associados em células tumorais

As metiltransferases de DNA são potenciais alvos de drogas contra o câncer. Aqui, um protocolo é apresentado para avaliar pequenas moléculas para inibição da DNA metiltransferase. Este ensaio utiliza uma endonuclease para acoplar a metilação do DNA à geração de fluorescência e permite que a atividade enzimática seja monitorada em tempo real.

Ensaio de metilação de DNA acoplado à endonuclease à base de fluorescência contínua para triagem de inibidores da DNA metiltransferase

Aprenda a avaliar a inibição da transcrição de RNA por compostos anticâncer usando eletroforese em gel e espectroscopia UV-Vis. Este ensaio in vitro identifica candidatos a fármacos como o corrol de gálio(III).

Um In Vitro Ensaio Enzimático para Medir Inibição da transcrição pelo gálio (III) e H 3 5,10,15-tris (pentafluorofenil) corroles (Vídeo) | JoVE Journal

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