Avaliar a eficácia do Cancer Drogas Sensibilização In Vitro E In Vivo

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar a eficácia da sensibilização a medicamentos contra o câncer, medindo as mudanças no metabolismo celular in vitro e na frequência metastática in vivo. Isso é conseguido primeiro cortando células cancerígenas in vitro com moléculas antisense para derrubar o alvo de interesse. Em seguida, as células transfectadas são colocadas em chips biossensores e carregadas em um sistema de medição do metabolismo para enumerar as mudanças na acidificação, respiração e adesão durante o tratamento medicamentoso.

Separadamente, as células transfectadas são tratadas com um medicamento e injetadas na circulação venosa de um embrião de galinha para avaliar os efeitos na frequência metastática. Os resultados mostram sensibilização a medicamentos contra o câncer, conforme ilustrado por mudanças no metabolismo celular e na frequência metastática. Essa técnica amplia o desenvolvimento da terapia contra o câncer, pois permite a avaliação simultânea de parâmetros que nem sempre são considerados durante os testes pré-clínicos convencionais de alvos ou compostos de medicamentos.

Embora esse método possa fornecer informações sobre novos alvos de drogas envolvidos no reparo do DNA, ele também pode ser aplicado à validação de alvos em outros sistemas, como o controle do ciclo celular. Após a transsecção de células tumorais com oligonucleotídeos antisense, de acordo com o protocolo de texto em um ambiente estéril, use 400 microlitros de PBS para lavar cuidadosamente seis chips de biossensor Para esterilizar os chips, remova o PBS e adicione 400 microlitros de etanol a 70% incube por 20 minutos antes de usar PBS para lavar os chips três vezes. Coloque três chips cada em placas de cultura estéreis, rotuladas como controle e alvo de interesse, e rotule dois tubos de 50 mililitros de maneira semelhante.

Em seguida, use PBS para lavar as células transfectadas antes de adicionar um volume apropriado de 0,25% de tripsina EDTA, espere até que a monocamada se desprenda e transfira a suspensão celular para o tubo apropriado. Depois de contar as células, ajuste o volume para atingir uma concentração final de 6,0 vezes 10 elevado à quinta célula por mililitro, adicionando meio ou concentrando as células. Preparando um grupo de cada vez, adicione 250 microlitros de solução celular a cada chip biossensor.

Coloque os pratos estéreis contendo os chips dentro de uma câmara de umidade para evitar a evaporação e incube durante a noite para realizar medições de metabolismo seguindo o esboço experimental detalhado no rótulo do protocolo de texto tubos de 1450 mililitros e adicione 50 mililitros de crescimento, meio mais 0,2% FBS e um x penicilina e estreptomicina. Ou PS. Coloque seis tubos em um sistema de medição de metabolismo, seis em outro e o tubo restante em um terceiro suporte de tubo que também contenha tubos com cisplatina. Use uma membrana permeável ao ar para selar os dois primeiros racks para evitar a evaporação.

Em seguida, prepare um volume apropriado de seis cisplatinas micromolares em meio com 0,2% de FBS e um XPS. Dispense o volume necessário de meio em quatro tubos de 50 mililitros rotulados e coloque-os de volta nas quatro ranhuras do terceiro rack de tubos de medição de metabolismo. Use membrana permeável ao ar para vedar os tubos.

Rotule seis tubos de 50 mililitros e adicione 20 mililitros a cada uma das soluções de 0,1% Triton X No meio, a solução Triton X encontrará todas as células restantes e fornecerá um valor zero para cada chip. Coloque os tubos em um quarto rack de tubos e feche-os. Em seguida, carregue os chips nos módulos bio.

Carregue os dois suportes no suporte de dois suportes e inicie o experimento. Depois de preparar embriões de galinha conforme referenciado no protocolo de texto no segundo dia de transfecção celular, subdivida os grupos de controle e interesse alvo em dois frascos para veículo e dois para cisplatina. Aspire o meio e use três mililitros de fresco, médio ou médio com seis cisplatina micromolar para reabastecer.

Os frascos incubam por seis horas. Após a incubação, aspire o meio, depois lave e tripsifique as células, transfira a suspensão celular para quatro tubos de 15 mililitros devidamente rotulados antes de girar e usar PBS para lavar três vezes Resus ressuspender as células. E então, após a contagem, use PBS para diluir ou centrifugação para concentrar as células em uma concentração final de 1,0 vezes 10 elevado à sexta célula por mililitro.

Transfira a suspensão celular para cinco tubos de mililitros rotulados para injeção e coloque no gelo. Em seguida, reserve 24 embriões de galinha de 9 dias para injeção em um microscópio estéreo e usando uma agulha de vidro conectada a um tubo flexível conectado a uma seringa de um mililitro com um movimento pulsante lento. Injete 1,0 vezes 10 nas quintas células em um volume de 100 microlitros na circulação venosa da membrana coaltóica ou cam com um lenço macio.

Aplique suavemente o local da injeção para conter o fluxo de sangue e absorver qualquer derramamento de rotação. Rotule cada recipiente de embrião adequadamente após cada injeção sob um microscópio fluorescente. Confirmar a presença e distribuição de células fluorescentes na vasculatura do came.

Anote todos os embriões em que o número de células tumorais parece baixo ou a distribuição é ruim. Finalmente, coloque os embriões de galinha em uma câmara de umidade e incube por sete a nove dias antes de enumerar os focos metastáticos, conforme descrito no protocolo de texto, conforme mostrado aqui, após 24 horas humanas, 5 49 células de câncer de pulmão tratadas com BRCA dois visando um SO e cisplatina exibiram uma diminuição precoce e irreversível na respiração em comparação com as células que receberam controle de um SO e cisplatina sozinhos. A diminuição de 39% em comparação com as células tratadas com controle começou aproximadamente 10 horas antes de uma queda detectável na adesão celular, sugerindo que ocorreu independentemente das mudanças no número de células e que pode ser um evento formativo que precede a morte celular, conforme demonstrado aqui.

Nenhuma diferença na acidificação foi observada durante o experimento de 72 horas, sugerindo que o tratamento com BRCA dois a SO e cisplatina teve pouco ou nenhum efeito no metabolismo da glicose. Neste experimento, células humanas de câncer de pulmão A 5 49 foram tratadas com controle a SO ou BRCA dois A SO na presença ou ausência de cisplatina e injetadas na circulação venosa do came. Nove dias depois, as células tratadas com BRCA dois a SO e cisplatina exibiram uma frequência 77% menor de focos metastáticos em comparação com as células tratadas com controle a SO e cisplatina ou BRCA dois A SSO isoladamente, sugerindo que o tratamento com BRCA dois a SO e cisplatina tem o potencial de diminuir ou prevenir a carga metastática em pacientes com tumores sólidos.

Após este procedimento, métodos mais tradicionais, como proliferação celular, ensaios e estudos de xenoenxerto in vivo, podem ser realizados para explorar ainda mais a contribuição de um alvo específico para o aumento da sensibilidade ao medicamento.