Name: Avaliar a eficácia do Cancer Drogas Sensibilização In Vitro E In Vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Aprenda a avaliar a sensibilização de drogas anticâncer em células tumorais usando embriões de galinha. Este método permite monitorar o metabolismo celular e a frequência metastática simultaneamente.

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Este trabalho foi possível graças a subvenções a JK dos Centros de Excelência de Ontário e do Fundo de Investigação Ontario. Gostaríamos de agradecer a Siddika Pardhan e Dr. Peter Ferguson para a assistência técnica durante as filmagens.

NOTA: O protocolo seguinte foi desenvolvido para utilização com células aderentes. As modificações são necessárias para aplicar o método com as células não-aderentes cultivadas em suspensão. Os ensaios de CAM descritas no protocolo são concebidos para utilização com células que expressam um marcador fluorescente (por exemplo, GFP, RFP, etc.). Nove dias de idade embriões de galinha são necessários no dia 2 do protocolo experimental para os experimentos CAM. 1. Preparação e transfecção de células de tumor com oligonucleótidos anti-sentido (ASOs) <ol><li> Aspirar o meio do frasco (s) contendo as células T75 de interesse, lavagem com PBS 1 X, e adicionar 2 ml de 0,25% de tripsina / EDTA. Adicionar 10 ml de meio de crescimento completo a cada balão e transferir as células em solução para um tubo de 50 ml. Contar as células e ajustar o volume para que a concentração final é de 1,0x10 células por 5 ml. </li><li> Etiqueta de dois grupos de frascos T25: um grupo conterá oito frascos rotulados, 1-8, e irá ser used para o tempo real experiência de medição metabolismo; e o segundo grupo também conterá 8 frascos e irá ser utilizado para a experiência de CAM de embrião de galinha. Adicionar 2 ml de solução de células em cada balão e para lugar na incubadora (37 ° C, 5% de CO 2 O / N). </li><li> Na manhã seguinte (Dia 0, Tempo 0), etiqueta três 5 ml tubos da seguinte forma: controle (não-alvo ASO ou siRNA), &quot;alvo de interesse&quot; (ou seja, visando ASO ou siRNA), e Lipofectamine 2000 (ou um semelhante o reagente de transfecção). Dilui-se as soluções de estoque de ASO a uma concentração adequada por meio isento de soro no tubo apropriado. <ol><li> Adicionar a quantidade necessária de reagente de transfecção para o tubo apropriado e incubar em meio isento de soro, durante 5 min. Adicionar a solução de reagente de transfecção para os tubos de ASO e incubar durante 20 min. </li></ol></li><li> Adicionar 250 uL de solução de reagente de transfecção controlo ASO para cada um dos frascos de 1-4 em cada grupo, e 250ul da solução de reagente de transfecção &quot;alvo de interesse&quot; ASO para cada um dos frascos de 5-8 em cada grupo. Incubar durante 4 horas (37 ᵒC, 5% de CO 2). <ol><li> Durante a incubação, siga os passos descritos na secção 2.1. Após a incubação, adicionar 3 ml de meio completo a cada frasco no grupo experimental CAM e retornar à incubadora S / N (37 ᵒC, 5% de CO 2). Processe o grupo experimento metabolismo de acordo com a descrição na seção 2.2. Processe o experimento CAM definido de acordo com a descrição na seção 4. </li></ol></li></ol> 2. Biosensor Chip Preparação e semeadura de células <ol><li> Em um ambiente estéril, lavar cuidadosamente seis chips biossensores com 400 ul de PBS. Esterilizar os chips com 400 mL de etanol a 70% para 20 min. Lavar três vezes com 400 ul de PBS. <ol><li> Coloque os chips dentro cultur tecido estérile pratos para evitar a contaminação. Coloque três chips em um prato chamado &#39;control&#39;, e três em um prato chamado &#39;alvo de interesse &quot;. </li></ol></li><li> Rotular dois tubos de 50 ml como &quot;controle&quot; e &quot;alvo de interesse&quot;. Lavar as células com PBS e adicionar um volume apropriado de 0,25% de tripsina / EDTA. Aguarde até que o separa de monocamada e recolher as células de cada frasco. Depositar a solução no tubo apropriado. <ol><li> Contar as células e ajustar o volume para que a concentração final é de 6.0x10 5 células / mL. Centrifuga-se e voltar a suspender as células se a concentração inicial é demasiado baixo. </li></ol></li><li> Adicionar 250 ul da solução de células para cada chip biossensor em que o grupo apropriado (para um total de 1.25x10 5 células por chip). Execute esta tarefa um grupo de cada vez para minimizar o risco de confundir os chips. Coloque os pratos estéreis contendo os chips dentro de uma câmara de umidade para evitar a evaporação, e colocar os cha umidadember na incubadora S / N (37 ᵒC, 5% de CO 2). </li><li> Na manhã seguinte (Dia 1), aspirar cuidadosamente o meio de cada chip e substituí-la com 250 ul de meio de crescimento suplementado com soro 0,2% de bovino fetal (FBS) e 1x penicilina e estreptomicina (P / S). Incubar durante 4 horas (37 ᵒC, 5% de CO 2). </li></ol> 3. Metabolismo Sistema de Medição Preparação e Solution Preparação <ol><li> Durante a incubação, preparar as soluções de drogas necessárias e o sistema de medição de metabolismo para o próximo ensaio. NOTA: O sistema de medição metabolismo contém um total de seis módulos. Cada módulo acomoda um único chip a cada ensaio. <ol><li> Subdividir o ensaio nos seguintes grupos experimentais: um chip da cada um dos &quot;controlo&quot; e &quot;alvo de interesse&quot; grupos para receber veículo para a duração do ensaio; dois chips de cada grupo a receber tratamento droga durante um período de tempo definido durante o umssay, seguido pelo veículo durante o período de lavagem. </li><li> Para estudos de sensibilização de drogas, modificar o comprimento, tempo e concentração de tratamento de drogas para se adequar a droga particular em questão. NOTA: Para cisplatina, as seguintes etapas foram determinados empiricamente com células A549, e pode variar dependendo da linha celular. Executar todas as etapas, com a taxa de fluxo padrão de 4 l / min. 6 hr de crescimento médio + 0,2% de FBS e 1x P / S 24 hr de 6 mM cisplatina em meio + 0,2% FBS 1x P / S 24 h de crescimento médio + 0,2% de FBS e 1x P / S 18 horas de crescimento médio + 0,2% de FBS e 1x P / S 4 h de 0,1% de Triton-X NOTA: Os desvios estes passos exigirá cálculo para determinar o volume necessário de soluções a médio e drogas com base na vazão desejada e duração do experimento. As secções que se seguem baseiam-se os passos descritos acima. </li></ol></li><li> Etiqueta e preencher catorze 50 ml tubos com 50 ml de meio de crescimento + 0,2% de FBS umd 1x P / S. Coloque seis em um suporte para tubos de medição do metabolismo do sistema, de seis em outro, e os dois restantes de um terceiro suporte de tubos que também contém tubos com cisplatina. Selar as duas primeiras cremalheiras com uma membrana permeável ao ar para prevenir a evaporação. </li><li> Prepara-se uma solução de 6 pM de cisplatina (do volume apropriado) em meio + 0,2% de FBS com 1x P / S. Repartir o volume necessário de uma solução de cisplatina em quatro tubos de 50 ml marcados. <ol><li> Colocar os tubos nas restantes quatro slots no terceiro metabolismo suporte de tubos de medição. Certifique-se de que os tubos são colocados nas respectivas aberturas que correspondem aos biomodules desejados. Selar os tubos com uma membrana permeável ao ar. </li></ol></li><li> Preparar e rotular seis tubos de 50 ml e enchê-los com 20 ml cada uma solução 0,1% Triton-X no meio. A solução Triton-X vai lisar as células restantes e fornecer um valor &quot;zero&quot; para cada chip. Colocar os tubos em uma quarta medida metabolismo suporte para tubos de unidade e selar with uma membrana permable ar para evitar uma evaporação excessiva. </li><li> Coloque as fichas no biomodules e iniciar o experimento. </li></ol> 4. CAM Experiment tratamento medicamentoso e Injeção NOTA: As etapas e os procedimentos para a preparação embriões de galinha para um experimento CAM são descritos em outros lugares 19 <ol><li> Começar a processar o hr pós-transfecção CAM experimento 48 (Dia 2). Sub-dividir o &quot;controle&quot; e &quot;alvo de interesse&quot; grupos em dois frascos para o veículo, e dois para a cisplatina. Aspirar o meio dos frascos e reconstituir ou com 3 ml de meio fresco, ou 6? M cisplatina. Incubar durante 6 horas (37 ᵒC, 5% de CO 2). </li><li> Aspirar o meio e, em seguida lavar e trypsinize as células; recolher as células tripsinizadas em solução em quatro rotulados apropriadamente tubos de 15 ml. <ol><li> Centrifugar e lavar as células três vezes com PBS. Re-suspender o sedimento de células em 5 ml de PBS umad contar as células. </li><li> Ajustar o volume de forma a que a concentração celular final é 1,0x10 6 células / ml. Transferir a solução de células marcadas em tubos de 5 ml por injecção, e colocar em gelo. Inverta os tubos suavemente antes da injecção para assegurar que as células são bem misturados. </li></ol></li><li> Separe um total de 24 embriões de galinha (9 dias de idade) para injeção (6 por grupo). Realizar a injecção utilizando uma agulha de vidro ligada a um tubo flexível ligado a uma seringa de 1 ml. O indivíduo que executa a injecção deve ser cegos ao grupo de tratamento. <ol><li> Usando um microscópio estéreo, injectar 1,0x10 5 células em um volume de 100 ul para a circulação venosa da CAM. Usar uma técnica lenta, pulsante para injectar o volume total das células. Passe suavemente o local da injecção com um wipe para conter o fluxo de sangue e absorver qualquer derrame. Escreva em cada recipiente embrião adequadamente após cada injecção. </li></ol></li><li> Confirme a presença e distribuição de células fluorescentes na vasculatura da CAM após a injecção, visualizando-os utilizando um microscópio de fluorescência. Tome nota de todos os embriões na qual o número de células tumorais parece baixo, ou a distribuição é pobre. </li><li> Coloque os embriões de galinha em uma câmara de umidade e armazená-los em uma incubadora (37 ° C, 60% de umidade). Aguarde 7-9 dias antes de enumerar focos metastáticos. </li></ol> 5. metastático Foco enumeração <ol><li> Durante o período de incubação de 7-9 dia, monitorar os embriões e descartar qualquer mortos. Certifique-se de que a câmara de umidade permanece úmido em todos os momentos durante o período de incubação. </li><li> Usando um microscópio estéreo fluorescente com ampliação de 20x, verificar toda a superfície superior da CAM de embriões em, um padrão tipo grelha regular. </li><li> Contar o número de focos de metástase em cada campo de visão, em seguida, contar o número para um total final por embrião. Se o fizer, para os seis embriões em cada grupo irá fornecer um número o médiof focos metastáticos por tratamento. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Devido ao custo inerente e os riscos associados com os ensaios clínicos, existe uma necessidade de desenvolver uma melhor e mais rigorosa metodologia de ensaio pré-clínico para avaliar adequadamente a novos regimes de tratamento anti-cancro. Atuais técnicas comumente usadas todas as fraquezas de exposição que podem limitar a sua capacidade de discriminar entre alvos terapêuticos potencialmente promissoras / agentes, e aqueles que podem ser menos eficaz. Eu inventei um protocolo para avaliar novas abordagens anti-câncer ...

A resistência adquirida ao alvo e / ou tratamento do cancro citotóxica é um problema clínico importante que pode levar ao fracasso do tratamento, recaída, e um aumento da mortalidade do paciente. Dado o elevado grau de heterogeneidade na maioria dos tumores, é uma certeza matemática que um tumor do número de células suficientemente elevado irá conter um subconjunto de células resistentes a terapias individuais ou combinadas de segmentação vias moleculares em que as referidas células dependem para a sobrevivência 2,3. Tais células tumorais podem ser seleccionadas positivamente por durante o tratamento, levando a recorrência da doença. O desenvolvimento de novas terapias que visam simultaneamente diferentes mecanismos de sobrevivência de células de cancro, quer antes ou depois da selecção mediada por tratamento, é, portanto, clinicamente importante. Um elevado nível de instabilidade do genoma e mutação no genoma de tumor é uma característica fundamental que distingue as células de cancro a partir de células hospedeiras não-tumorais 4. Consequentemente, uma useful estratégia para aumentar a eficácia da quimioterapia danos no DNA e para prevenir o desenvolvimento da resistência é inibir activamente a reparação do ADN em células tumorais 5. Este é um campo ativo de investigação e de uma variedade de alvos de reparo de DNA novos estão sendo exploradas em um cenário pré-clínica. Uma série de pequenas moléculas ou inibidores à base de anti-sentido de estas metas foram desenvolvidos e são submetidos a testes 6-8. O objectivo é o de identificar os candidatos pré-clínicos mais promissoras e avaliar a sua segurança e eficácia em ensaios clínicos. O alto custo dos ensaios clínicos e o risco de falha (para uma variedade de razões, incluindo a avaliação pré-clínica sub-ótima) são formidáveis ​​obstáculos ao progresso no desenvolvimento de novas terapias 9. A utilização de modelos adequados e rigorosos pré-clínico para avaliar adequadamente novos alvos terapêuticos e medicamentos candidatos podem diminuir a elevada taxa de insucesso de 10 ensaios clínicos </sup&gt;. Alguns métodos pré-clínicos comumente usados ​​para avaliar a eficácia de novos regimes anti-cancro são: a) medição da capacidade para reduzir a proliferação de células tumorais in vitro (ensaios de proliferação celular), b) redução induzida pela terapia da capacidade de as células tumorais colónias de cultura de tecidos de forma (ensaios de formação de colónias), c) redução induzida pela terapia da actividade metabólica das células tumorais in vitro (conversão de corante redox), d) induzida por terapia de indução de morte in vitro de células de tumor (por apoptose, necrótica, autophagic, associado com a mitose e outros) 11, e e) a redução in vivo de crescimento ou ablação de xenoenxertos humanos e de rato induzida por terapia 12-14. A principal deficiência dos métodos in vitro listados é que nenhum deles fornecer avaliação contínua em tempo real do efeito das terapias candidatos. Em vez disso, eles fornecem informações somente em pontos de tempo selecionado, amplamente separadosdurante o curso do tratamento. Tais medidas têm diminuído a capacidade para refletir com precisão a magnitude e tempo de respostas das células tumorais. In vivo modelos rato xenograft também são limitadas pelo alto custo, duração de tempo para ser concluído, e risco de dosagem e tratamento calendário abaixo do ideal (agendamento). Além disso, há evidências de que os modelos de xenoenxerto de roedor são preditores limitadas de eficácia clínica em seres humanos, em comparação com uma avaliação in vitro das respostas de células de tumores humanos primários e linhas celulares de tumores humanos estabelecidos a intervenções terapêuticas candidatos 15,16. Eu inventei um protocolo combinação novela para avaliar novas combinações de medicamentos pré-clínica, de forma que aborda os pontos fracos dos procedimentos mais comuns listados acima. Em lugar de proliferação, a formação de colónias, ou ensaios de conversão de corante redox, utilizou-se uma unidade de medição de metabolismo para analisar a adesão celular, a respiração, a acidificação e em tempo realdurante todo o período de tratamento de 17. Simultaneamente, foram investigados os efeitos da combinação de tratamento in vivo usando um modelo de membrana corioalantóica (CAM) de invasão e metástase 18,19 embrião de galinha. Utilizou-se estes métodos para avaliar a capacidade de um oligonucleótido anti-sentido (ASO) BRCA2 direccionamento para potenciar a eficácia da cisplatina utilizada fármaco quimioterapêutico.

<table><tbody><tr><td>Células A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx</td></tr><tr><td>filme AeraSeal</td><td>Carl Roth GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AMEM</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>210-011-QK</td><td></td></tr><tr><td>Oligodesoxinucleotídeos antisense</td><td>Avecia</td><td></td><td>BRCA2 sequência alvo: 5' - UAAGGAACGUCAAGAGAUAC - 3' (bases 7241-7259 )</td></tr><tr><td>Axio Zoom V16 Microscópio</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>http://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html</td></tr><tr><td>Bionas Biosensores Chips Bionas</td><td>GmbH e Micronas GmbH</td><td>BIS8001D</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Bionas Discovery 2500</td><td>Bionas GmbH</td><td></td><td>http://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/</td></tr> <tr><td>Cisplatina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>479306</td><td></td></tr><tr><td>Ovos de galinha fertilizados</td><td>De origem local</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Gibco - Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000&nbsp;</td><td>Invitrogen - Life Technologies&nbsp;</td><td>12566014</td><td>http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>311-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina (0,25%)/EDTA</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>325-043-CL</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliar a eficácia do cancer drogas sensibilização<em&gt; in vitro</em&gt; e<em&gt; in vivo</em

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Devido ao elevado nível de heterogeneidade e inerentes mutações em cancros humanos, as terapias de agente único, ou combinações de drogas que têm como alvo a mesma via, são propensos a falhar. Ênfase deve ser colocada sobre a inibição de vias, que são responsáveis ​​pela resistência intrínseca e / ou à terapia adaptativa. Um campo ativo de investigação é o desenvolvimento e teste de inibidores de reparo de DNA que promovem a ação de, e prevenir a resistência a, comumente usado quimioterapia e radioterapia. Utilizou-se um novo protocolo para avaliar a eficácia de inibição BRCA2 como um meio para sensibilizar células tumorais ao ADN prejudiciais cisplatina droga. O metabolismo das células do tumor (acidificação e respiração) foi monitorada em tempo real por um período de 72 h, para delinear a eficácia do tratamento em um minuto a minuto. Em combinação, foi realizada uma avaliação da freqüência metastático utilizando uma membrana corioalantóide embrião de galinha (CAM) modelo de extravasamento e invasão. Esteprotocolo aborda alguns dos pontos fracos dos comumente usados ​​in vitro e in vivo para avaliar métodos novos esquemas de terapia do câncer. Ele pode ser usado em adição aos métodos comuns, tais como ensaios de proliferação celular, ensaios de morte celular, e os estudos in vivo de xenoenxertos de murina, para discriminar entre alvos mais de perto e de agentes candidatos, e seleccionar apenas os candidatos mais promissores para posterior desenvolvimento.

Resultados e figuras adaptado com permissão de trabalho publicado em 22. Inibição BRCA2 induz uma diminuição na respiração cisplatina em células tumorais tratadas Células de câncer de pulmão humano A549 tratados com BRCA2-targeting ASO e cisplatina apresentaram uma diminuição precoce e irreversível na respiração, em comparação com as células que receberam o controlo ASO e cisplatina isolada; após 24 horas de tratamento com cisplatina a diferen...

Aqui, o monitoramento em tempo real do metabolismo das células tumorais, combinado com um modelo de metástase de membrana corio-alantóide (CAM) de embrião de galinha in vivo, é usado para avaliar novos alvos/agentes anticancerígenos quanto à sua capacidade de sensibilizar células tumorais a quimioterápicos prejudiciais ao DNA.

Avaliar a eficácia do Cancer Drogas Sensibilização<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar a eficácia da sensibilização a medicamentos contra o câncer, medindo as mudanças no metabolismo celular in vitro e na frequência metastática in vivo. Isso é conseguido primeiro cortando células cancerígenas in vitro com moléculas antisense para derrubar o alvo de interesse. Em seguida, as células transfectadas são colocadas em chips biossensores e carregadas em um sistema de medição do metabolismo para enumerar as mudanças na acidificação, respiração e adesão durante o tratamento medicamentoso.Separadamente, as células transfectadas são tratadas com um medicamento e injetadas na circulação venosa de um embrião de galinha para avaliar os efeitos na frequência metastática. Os resultados mostram sensibilização a medicamentos contra o câncer, conforme ilustrado por mudanças no metabolismo celular e na frequência metastática. Essa técnica amplia o desenvolvimento da terapia contra o câncer, pois permite a avaliação simultânea de parâmetros que nem sempre são considerados durante os testes pré-clínicos convencionais de alvos ou compostos de medicamentos.Embora esse método possa fornecer informações sobre novos alvos de drogas envolvidos no reparo do DNA, ele também pode ser aplicado à validação de alvos em outros sistemas, como o controle do ciclo celular. Após a transsecção de células tumorais com oligonucleotídeos antisense, de acordo com o protocolo de texto em um ambiente estéril, use 400 microlitros de PBS para lavar cuidadosamente seis chips de biossensor Para esterilizar os chips, remova o PBS e adicione 400 microlitros de etanol a 70% incube por 20 minutos antes de usar PBS para lavar os chips três vezes. Coloque três chips cada em placas de cultura estéreis, rotuladas como controle e alvo de interesse, e rotule dois tubos de 50 mililitros de maneira semelhante.Em seguida, use PBS para lavar as células transfectadas antes de adicionar um volume apropriado de 0,25% de tripsina EDTA, espere até que a monocamada se desprenda e transfira a suspensão celular para o tubo apropriado. Depois de contar as células, ajuste o volume para atingir uma concentração final de 6,0 vezes 10 elevado à quinta célula por mililitro, adicionando meio ou concentrando as células. Preparando um grupo de cada vez, adicione 250 microlitros de solução celular a cada chip biossensor.Coloque os pratos estéreis contendo os chips dentro de uma câmara de umidade para evitar a evaporação e incube durante a noite para realizar medições de metabolismo seguindo o esboço experimental detalhado no rótulo do protocolo de texto tubos de 1450 mililitros e adicione 50 mililitros de crescimento, meio mais 0,2% FBS e um x penicilina e estreptomicina. Ou PS. Coloque seis tubos em um sistema de medição de metabolismo, seis em outro e o tubo restante em um terceiro suporte de tubo que também contenha tubos com cisplatina. Use uma membrana permeável ao ar para selar os dois primeiros racks para evitar a evaporação.Em seguida, prepare um volume apropriado de seis cisplatinas micromolares em meio com 0,2% de FBS e um XPS. Dispense o volume necessário de meio em quatro tubos de 50 mililitros rotulados e coloque-os de volta nas quatro ranhuras do terceiro rack de tubos de medição de metabolismo. Use membrana permeável ao ar para vedar os tubos.Rotule seis tubos de 50 mililitros e adicione 20 mililitros a cada uma das soluções de 0,1% Triton X No meio, a solução Triton X encontrará todas as células restantes e fornecerá um valor zero para cada chip. Coloque os tubos em um quarto rack de tubos e feche-os. Em seguida, carregue os chips nos módulos bio.Carregue os dois suportes no suporte de dois suportes e inicie o experimento. Depois de preparar embriões de galinha conforme referenciado no protocolo de texto no segundo dia de transfecção celular, subdivida os grupos de controle e interesse alvo em dois frascos para veículo e dois para cisplatina. Aspire o meio e use três mililitros de fresco, médio ou médio com seis cisplatina micromolar para reabastecer.Os frascos incubam por seis horas. Após a incubação, aspire o meio, depois lave e tripsifique as células, transfira a suspensão celular para quatro tubos de 15 mililitros devidamente rotulados antes de girar e usar PBS para lavar três vezes Resus ressuspender as células. E então, após a contagem, use PBS para diluir ou centrifugação para concentrar as células em uma concentração final de 1,0 vezes 10 elevado à sexta célula por mililitro.Transfira a suspensão celular para cinco tubos de mililitros rotulados para injeção e coloque no gelo. Em seguida, reserve 24 embriões de galinha de 9 dias para injeção em um microscópio estéreo e usando uma agulha de vidro conectada a um tubo flexível conectado a uma seringa de um mililitro com um movimento pulsante lento. Injete 1,0 vezes 10 nas quintas células em um volume de 100 microlitros na circulação venosa da membrana coaltóica ou cam com um lenço macio.Aplique suavemente o local da injeção para conter o fluxo de sangue e absorver qualquer derramamento de rotação. Rotule cada recipiente de embrião adequadamente após cada injeção sob um microscópio fluorescente. Confirmar a presença e distribuição de células fluorescentes na vasculatura do came.Anote todos os embriões em que o número de células tumorais parece baixo ou a distribuição é ruim. Finalmente, coloque os embriões de galinha em uma câmara de umidade e incube por sete a nove dias antes de enumerar os focos metastáticos, conforme descrito no protocolo de texto, conforme mostrado aqui, após 24 horas humanas, 5 49 células de câncer de pulmão tratadas com BRCA dois visando um SO e cisplatina exibiram uma diminuição precoce e irreversível na respiração em comparação com as células que receberam controle de um SO e cisplatina sozinhos. A diminuição de 39% em comparação com as células tratadas com controle começou aproximadamente 10 horas antes de uma queda detectável na adesão celular, sugerindo que ocorreu independentemente das mudanças no número de células e que pode ser um evento formativo que precede a morte celular, conforme demonstrado aqui.Nenhuma diferença na acidificação foi observada durante o experimento de 72 horas, sugerindo que o tratamento com BRCA dois a SO e cisplatina teve pouco ou nenhum efeito no metabolismo da glicose. Neste experimento, células humanas de câncer de pulmão A 5 49 foram tratadas com controle a SO ou BRCA dois A SO na presença ou ausência de cisplatina e injetadas na circulação venosa do came. Nove dias depois, as células tratadas com BRCA dois a SO e cisplatina exibiram uma frequência 77% menor de focos metastáticos em comparação com as células tratadas com controle a SO e cisplatina ou BRCA dois A SSO isoladamente, sugerindo que o tratamento com BRCA dois a SO e cisplatina tem o potencial de diminuir ou prevenir a carga metastática em pacientes com tumores sólidos.Após este procedimento, métodos mais tradicionais, como proliferação celular, ensaios e estudos de xenoenxerto in vivo, podem ser realizados para explorar ainda mais a contribuição de um alvo específico para o aumento da sensibilidade ao medicamento.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

A resistência aos medicamentos para a terapêutica visados ​​é generalizada e à necessidade de identificar mecanismos de resistência - antes ou após o início clínico - é fundamental para orientar estratégias de gestão de clínicas alternativas. Aqui, apresentamos um protocolo para casal derivação de linhas resistentes a drogas in vitro com sequenciamento para agilizar a descoberta desses mecanismos.

Implementação de<em&gt; In Vitro</em&gt; Droga de Resistência Ensaios: maximizar o potencial para Descobrindo clinicamente relevantes mecanismos de resistência

Descrevemos um ensaio de sensibilidade a medicamentos de alto rendimento para células primárias de mieloma múltiplo. Consiste em uma reconstrução do microambiente da medula óssea (incluindo matriz extracelular e estroma) em placas de múltiplos poços e um método não invasivo para quantificação longitudinal da viabilidade celular.

Um Sistema Organotípicas alta taxa de transferência para Caracterização de Drogas de sensibilidade de células de mieloma múltiplo primárias

O presente relatório resume um protocolo que pode ser utilizado para modelar a influência do nicho do microambiente da medula óssea nas células leucêmicas, com ênfase no enriquecimento da subpopulação mais quimiorresistente.

Modelagem quimioterapia leucemia resistente<em&gt; In Vitro</em

O objetivo deste protocolo é o de avaliar a especificidade de drogas anticâncer in vitro utilizando culturas mistas que contêm células tumorais tanto e não-tumorais.

Avaliando Especificidade de Anticancer Drugs<em&gt; In Vitro</em

Apresentamos um modelo tridimensional (3D) de câncer de pulmão baseado em um andaime de colágeno biológico para estudar a sensibilidade a terapias direcionadas ao câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC). Demonstramos diferentes técnicas de leitura para determinar o índice de proliferação, apoptose e status de transição epitelial-mesenquimal (EMT). Os dados coletados são integrados em um modelo in silico para previsão da sensibilidade aos medicamentos.

A Tissue Combinada 3D Engineered<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In Silico</em&gt; Modelo de tumor de pulmão para prever a eficácia da droga em fundos específicos de mutação

É descrito um método em vitro para estabelecer a resistência dupla para um EGFR-TKI e uma MET-TKI em células cancerosas. Este método é útil para o desenvolvimento de tratamentos para pacientes com EGFR-mutações, que apresentam progressão da doença apesar do tratamento de EGFR-TKI com MET-amplificação. Ele também pode ser modificado por inibidores como alvo outras moléculas.

Estabelecimento de dupla resistência de EGFR-TKI e conheci-TKI em Lung Adenocarcinoma células In Vitro com um procedimento passo-2 Dose-escalada

Este protocolo descreve como avaliar o sinergismo entre um anticorpo anticâncer e medicamentos antineoplásicos em modelos pré-clínicos, usando a equação de índice de combinação de Chou e Talalay.

Potenciação da eficácia de anticorpos anticâncer por fármacos antineoplásicos: deteção de sinergismo de anticorpo-droga usando a equação de índice de combinação

Aqui, descrevemos um método in vitro co-cultura para recursivamente desafio tumor-alvo as células T, que permite a análise fenotípica e funcional da atividade antitumoral de célula T.

Em Vitro Tumor Cell reexposição para avaliação preditiva de Receptor de antígeno quimérico célula T função antitumoral

Este manuscrito descreve como avaliar a imunogenicidade in vivo de vesículas extracelulares derivadas de células tumorais (EVs) usando citometria de fluxo. Os EVs derivados de tumores submetidos à morte de células imunogênicas induzidas pelo tratamento parecem particularmente relevantes na imunossuperveiência tumoral. Este protocolo exemplifica a avaliação dos EVs de tumor imunoestimulatório induzidos por oxaliplatina, mas pode ser adaptado a várias configurações.

In vivo Triagem de imunogenicidade de vesículas extracelulares derivadas do tumor por citometria de fluxo de células T esplênicas

Este protocolo descreve uma avaliação padronizada da sensibilidade medicamentosa a inibidores de sinalização direcionados em modelos organoides derivados do paciente NSCLC.

Sensibilidade de perfil a terapias-alvo em organoides derivados do paciente NSCLC EGFR-Mutant

Este protocolo apresenta um conjunto de experimentos adotados para a avaliação de peptídeos anticâncer fotocomutáveis, que podem ser utilizados na triagem pré-clínica destes compostos. Isso inclui a avaliação da citotoxicidade em culturas de células 2D e 3D, a avaliação da eficiência de fotoisomerização ex vivo (tecido modelo) e a eficácia in vivo .

Avaliação in vitro e in vivo de compostos biologicamente ativos fotocontrolados - potenciais candidatos a fármacos para a fotofarmacologia do câncer

Aprenda a avaliar a sensibilização de drogas anticâncer em células tumorais usando embriões de galinha. Este método permite monitorar o metabolismo celular e a frequência metastática simultaneamente.

Avaliar a eficácia do Cancer Drogas Sensibilização

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