A linfa mesentérica Duct canulada Rat Modelo: Aplicação para a Avaliação de Intestinal Linfática transporte da droga

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a taxa e a extensão do transporte de lipídios e fármacos para o sistema linfático intestinal após administração intestinal. Isso é realizado primeiramente isolando e canulando o ducto linfático mesentérico para coleta de linfa. Na segunda etapa, o duodeno é canulado para permitir a infusão no intestino, e em seguida a artéria carótida é canulada para permitir a coleta de amostras sanguíneas.

No passo final, o tratamento experimental é administrado no duodeno e a linfa e o sangue são coletados para a quantificação dos níveis sistêmicos de lipídios ou fármacos. Em última análise, este modelo pode ser utilizado para avaliar a absorção total e o transporte linfático intestinal de lipídios e fármacos após a administração intestinal. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a cânulação direta do ducto linfático mesentérico e a coleta de linfa durante todo o período experimental.

Isso permite uma estimativa da quantidade absoluta de material que flui para dentro e através da linfa mesentérica. In vivo, embora este modelo permita a avaliação in vivo do transporte de fármacos e lipídios. Ele também pode ser usado para medir o transporte linfático intestinal de qualquer fator de interesse, bem como a alteração no transporte linfático desses fatores em resposta a diferentes desafios ou estados patológicos.

A demonstração visual deste método é essencial, pois a canulação do ducto linfático mesentérico é complicada e difícil devido ao fato de que o ducto é pequeno, frágil e ainda mais difícil de localizar em animais em jejum. A demonstração do procedimento será realizada por minha colega e também membro do corpo docente aqui na Universidade Monash, Dra. Natalie Cus, e por um pós-doutorando sênior do grupo, Dr. LJ Hugh. No dia anterior à cirurgia, corte as cânulas nos comprimentos apropriados e use uma lâmina cirúrgica estéril para fazer um bisel na ponta de cada pedaço de tubo. Em seguida, para preparar a cânula intraduodenal, enrole a cânula sobre si mesma e aqueça-a para criar um ponto de fixação no tubo.

No dia da cirurgia, depile os pêlos da região abdominal direita, do pescoço e da clavícula esquerda de uma rata adulta anestesiada e, em seguida, limpe as regiões cirúrgicas assépticamente com três fricções sucessivas de solução de poviodine e etanol a 70% para canular o ducto linfático. Posicione o animal com o lado direito voltado para cima e use uma lâmina de bisturi estéril para abrir a camada superior da parede muscular abdominal com uma incisão reta de quatro centímetros, estendendo-se do processo xifoide até a região lateral direita, aproximadamente dois centímetros abaixo da margem costal. Retraia o intestino delgado sob a parede abdominal esquerda e use dois a três pedaços de gaze estéril saturados com solução salina normal para mantê-lo no lugar.

Em seguida, suspenda o rato sobre uma seringa plástica de 10 mililitros posicionada horizontalmente sob o dorso do animal, ao nível do rim direito. Para auxiliar na visualização do ducto linfático mesentérico, localize o ducto linfático mesentérico superior, que possui aproximadamente 0,5 a 1 milímetro de diâmetro, posicionado perpendicularmente ao rim direito e imediatamente cranial e paralelo à artéria mesentérica pulsátil de cor vermelho-escura. Observe que, em ratos não jejuados, como mostrado aqui, o ducto linfático mesentérico superior é branco, opaco e mais fácil de visualizar do que em ratos jejuados.

Em seguida, passe um par de pinças retas através do leito adiposo perirrenal na margem inferior do rim direito, paralelamente ao ducto linfático mesentérico superior e através das camadas de tecido conjuntivo imediatamente abaixo da veia cava. Então, usando a ponta das pinças, puxe a cânula linfática através do leito adiposo perirrenal, com uma extremidade imediatamente adjacente ao ducto linfático mesentérico e a outra exteriorizada do animal ao nível do rim direito. Em seguida, utilizando um microscópio cirúrgico e pinças de joalheiro, isole o ducto linfático mesentérico através das camadas sobrejacentes de tecido conjuntivo e adiposo por dissecação romba, começando pela extremidade inferior e tomando cuidado para não danificar o ducto linfático quando este for isolado.

Use a ponta da pinça de ponta fina para fazer um pequeno orifício no ducto linfático. Após garantir que o cateter linfático esteja completamente preenchido com solução anticoagulante e sem bolhas de ar, use um pequeno par de pinças para inserir o cateter linfático cerca de dois a quatro milímetros dentro do ducto linfático mesentérico através da punção. Se a canulação for bem-sucedida, um fluxo gradual de linfa intestinal será observado na extremidade coletora livre do cateter.

Quando isso ocorrer, aplique uma pequena gota de cola de cianoacrilato sobre o orifício de entrada no ducto linfático para fixar a cânula, tomando cuidado para não obstruir o vaso com excesso de cola ao cânular o duodeno. Primeiro, localize o tecido como a seção rosa-avermelhada do intestino delgado, que, ao ser suavemente puxada para baixo, revela o estômago. Em seguida, use uma agulha estéril de calibre 23 para fazer um pequeno furo de punção no duodeno na região do piloro, aproximadamente dois centímetros abaixo da junção entre o estômago e o duodeno.

Em seguida, insira a extremidade em gancho em formato de js da cânula duodenal através da punção e fixe a cânula no lugar com uma gota de cola acrílica Sano. Depois, use suturas para fechar a incisão na parede muscular abdominal. A canulação da artéria carótida pode ser realizada antes ou depois da canulação do ducto linfático mesentérico. Geralmente preferimos canular a artéria carótida antes da canulação do ducto linfático, para reduzir a possibilidade de deslocar a cânula linfática ao movimentar o animal. Para canular a artéria carótida, primeiro marque a cânula da artéria carótida a 2,5 centímetros da ponta biselada, a fim de identificar a porção do tubo que será inserida na artéria.

Em seguida, conecte a extremidade não biselada da cânula a uma agulha de 25 gauge acoplada a uma seringa preenchida com solução anticoagulante e encha a cânula com a solução, certificando-se de que não haja bolhas de ar. A seguir, faça uma incisão longitudinal de um a 1,5 centímetro através da camada cutânea acima do lado esquerdo da traqueia no plano sagital e, então, use pinças de ponta romba para dissecar o tecido conjuntivo subcutâneo e expor os músculos cervicais emparelhados subjacentes. Retraia os músculos cervicais para revelar a artéria carótida esquerda pulsante, localizada aproximadamente um centímetro abaixo da superfície da pele.

Em seguida, limpe o tecido conjuntivo sobrejacente da artéria por dissecação romba e use pinças rombas para isolar uma seção de aproximadamente um centímetro da artéria. A seguir, use pinças de ponta fina para passar dois fios de seda sob a artéria carótida, posicionando-os em cada extremidade da seção isolada da artéria. Em seguida, amarre o fio mais distante do coração e da clavícula do rato e posicione um par de pinças retas de ponta fina sob a carótida para ocluir o fluxo sanguíneo pela artéria.

Agora, utilizando tesoura de ponta fina para íris, faça uma pequena incisão na superfície superior da artéria, aproximadamente um terço do caminho a partir do topo da área isolada. Insira a ponta da cânula na artéria com uma pinça de ponta curva. Uma vez inserida, remova a pinça de ponta fina reta, ocluindo o fluxo sanguíneo, e avance a cânula 2,5 centímetros dentro da artéria utilizando dois pares de pinças.

Um para segurar a cânula dentro da artéria e impedir que o sangue vaze de volta e outro para inserir a cânula. Em seguida, use um pequeno grampo arterial para fixar a cânula dentro da artéria. Injete solução anticoagulante na cânula, seguido pela retirada de uma pequena quantidade de sangue para confirmar a perviedade do tubo.

Em seguida, lave a cânula com solução anticoagulante e feche a extremidade usando a chama de um isqueiro. Por fim, use os pontos para fixar a cânula no lugar e remova o grampeamento da artéria. Em seguida, posicione um terceiro ponto ao redor da artéria e da cânula, encurte o comprimento dos pontos ao redor da artéria e feche a incisão no pescoço com mais pontos após o período de recuperação, infundindo uma formulação de interesse no animal por meio da cânula duodenal.

Como ilustrado no gráfico após a administração do modelo, o fármaco lipofílico halal fanene, a taxa média de fluxo linfático para ratos com cânula bem-sucedida foi entre 0,4 e 1,3 mililitros por hora. Em alguns animais, a taxa de fluxo linfático foi ligeiramente menor durante as primeiras uma a três horas após a cânula, antes de aumentar, um fenômeno comumente observado após cânula linfática bem-sucedida em ratos com cânula mal-sucedida. No entanto, a taxa de fluxo permanece substancialmente mais baixa do que a observada nos experimentos bem-sucedidos durante todo o período de coleta.

Da mesma forma, nesses experimentos representativos, o transporte linfático cumulativo de triglicerídeos e halal RIN foi substancialmente menor nos animais com cânula mal posicionada. Enquanto nos grupos com cânula bem posicionada, o transporte cumulativo médio de halalan foi de 15,1% da dose e o transporte cumulativo de triglicerídeos foi de 61 miligramas ao longo de 10 horas. Neste experimento representativo de transporte de lipídios, a proporção da dose lipídica exógena radioativamente marcada administrada que foi transportada pela linfa foi de 54%. Esses valores não diferiram significativamente dos observados anteriormente.

Para uma formulação semelhante, a taxa de transporte de triglicerídeos e fármacos para a linfa atinge um pico logo após a administração de lipídios e fármacos, e depois retorna aos níveis basais. Como é típico em experimentos de transporte intestinal de lipídios e fármacos pela via linfática. A taxa de transporte do fármaco na linfa durante cada período de tempo reflete esse cenário para o transporte de triglicerídeos, já que o fármaco é transportado para a linfa.

Em associação com as lipoproteínas ricas em triglicerídeos. Uma vez dominada, a cânula pode ser concluída em até 30 minutos, caso não sejam encontradas dificuldades. Após este procedimento, os componentes presentes na linfa coletada podem ser isolados e utilizados em experimentos adicionais, como por exemplo para reinfusão em animais receptores, a fim de avaliar diretamente sua função, metabolismo, depuração ou padrões de distribuição. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão das técnicas para isolar e canular o ducto linfático mesentérico, a artéria carótida e o duodeno.

Usando essas técnicas, você deverá ser capaz de avaliar o transporte de fármacos, lipídios e outros fatores do intestino através e para dentro da linfa mesentérica in vivo.