Name: A linfa mesentérica Duct canulada Rat Modelo: Aplicação para a Avaliação de Intestinal Linfática transporte da droga (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 17 s
Description: Aprenda a canular o ducto linfático mesentérico em ratos para avaliar o transporte de lipídios e fármacos pelo sistema linfático intestinal. Este método permite quantificar a absorção sistêmica em estudos de farmacologia.

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O financiamento do Australian Research Council (ARC) e do National Health and Medical Research Council (NHMRC) é reconhecido com gratidão.

Os autores não têm nada a divulgar.

O modelo de rato canulação linfático mesentérico permite a quantificação directa da concentração e da taxa de transporte de várias células e moléculas (tais como lipidos e medicamentos) a partir do intestino para a linfa e as modificações dos mesmos que ocorrem em resposta ao desafio de várias substâncias (dieta , antigénios, fármacos, formulações, etc.) e 10,27 doença (cancro, vírus, colite, resistência à insulina, etc) 5-7. Os componentes recolhidas na linfa também pode ser aind...

A linfa flui a partir do intestino delgado através de um processo unidireccional que se origina no lacteals únicos que estão contidos dentro de cada pequena vilosidades intestinais 1. Lacteals são relativamente permeáveis ​​a fluidos, macromoléculas e as células e, assim, a formação de linfa começa com a entrada destes factores em lacteals. A linfa inicial nos lacteals flui posteriormente a partir do intestino através de uma rede de microvasos linfáticos, coletando (aferentes) vasos linfáticos, uma série de linfonodos mesentéricos e, finalmente, os vasos linfáticos pós-nodal (eferente). Dentro dos nodos, linfa passa através de uma série de cavidades medulares onde a troca ocorre com as células imunitárias residentes nó assim como o material que entram no nó do sangue. Todos linfa flui do intestino delgado, eventualmente, converge para o ducto eferente linfa mesentérica superior e, posteriormente, a cisterna do quilo. A cisterna do quilo também recolhe drenagem linfática os tecidos periféricos caudais, intestinal, regiões hepáticas e lombar e junta-se o duto linfático torácico, juntamente com a linfa do mediastino e partes do crânio do corpo. O ducto linfático torácico esvazia linfa diretamente no sistema venoso na junção das veias jugular interna e subclávia esquerda. O protocolo aqui descrito, o que permite a recolha de linfa directamente a partir da conduta de linfa mesentérica superior, facilitando, assim, a análise de vários factores que transitam directamente a partir do intestino para a circulação sistémica (geral) através do sistema linfático intestinal. As principais funções fisiológicas atribuídos ao sistema linfático intestinal são para manter o equilíbrio de fluidos, para facilitar a absorção de lípidos e molécula lipofílica, e para permitir que as respostas imunes adequadas 1. As células tumorais e vírus também se propagar através dos vasos linfáticos intestinais 2-4 e principais mudanças ocorrem dentro dos vasos linfáticos em várias patologias inflamatórias e metabólicas 5-7. Latanulation do ducto linfático mesentérico para recolher linfa dentro do mesentério permite uma análise de fluxo de fluido a granel através dos vasos linfáticos intestinais, bem como a quantificação da taxa de concentração e transporte de várias células e moléculas. Alterações na concentração ou o trânsito desses fatores na resposta a vários desafios (por exemplo: dietas, antígenos, drogas) e em modelos de doenças (por exemplo, colite, HIV, diabetes) podem também ser avaliadas. Embora seja impossível para descrever exaustivamente cada componente de linfa, que podem ser analisados ​​e comparados aqui, linfa mesentéricos simplista consiste aquosa, de lípidos e fases celulares. Os componentes de interesse na fase aquosa incluem péptidos e proteínas tais como antigénios ou tolerogénios 8, mensageiros imunes, tais como citocinas e mediadores de mastócitos, e mediadores 9 metabólicas tais como as incretinas 10. A fração celular da linfa mesentérica pós-nodal é composto quase inteiramente (mais de 99%) de lymphocytes 11. Várias células imunológicas (células dendríticas, mastócitos, etc.) penetram nos vasos linfáticos mesentéricos pré-nodais, mas permanecem dentro do nó 12. Se as células dentro da linfa aferente são de interesse, é possível recolher essas células por meio de remoção dos gânglios linfáticos mesentéricos de vários dias antes da canulação da conduta de linfa mesentéricos 12. Desta forma, as condutas linfáticos aferentes e eferentes são directamente ligados e as células linfáticas em linfa aferente passar directamente para o tubo linfático mesentérico. O trânsito e fenótipo de várias células do sistema imunológico que passam através dos vasos linfáticos intestinais podem, assim, ser examinado. Talvez a razão mais comum citada para a coleta de linfa mesentérica, até à data, no entanto, é estudar o processamento intestinal, absorção e transporte de lipídios na dieta e moléculas lipofílicas 10. Após a ingestão, os lípidos da dieta são digeridos (por exemplo, a partir de triglicéridos de ácidos gordos e de monoglicérido, phospholipid de ácidos gordos e de lisofosfolípido, e éster de colesterol de ácido gordo e de colesterol, etc.) e dispersos no lúmen intestinal em pequena das micelas e vesículas através da adição de compostos anfifílicos de bílis (fosfolípidos, colesterol e sais biliares) e a acção de enzimas pancreáticas 10,13. De lá eles são absorvidos enterócitos. A proporção dos componentes absorvidos são re-esterificados para formar triglicéridos, fosfolípidos e ésteres de colesterol no interior das células de absorção (enterócitos). Estes lípidos re-esterificados são montados a partir de uma combinação de componentes lipídicos exogenamente ingerida e componentes lipídicos endógenos da bílis segregada, piscinas ou lípidos da mucosa intestinal o fornecimento de sangue 13. A partir daqui os lípidos estéril içados são armazenados dentro de enterócitos ou montados em lipoproteínas intestinais (quilomicrons, lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL)) em conjunto com várias outras apoproteínas e moléculas lipofílicas ( <em&gt;, por exemplo, vitaminas) 10,13. Depois de sair enterócitos, lipoproteínas são especificamente transportados a partir do intestino para a circulação sistémica através do sistema linfático mesentérico como lacteals intestinais são mais permeáveis ​​a sua entrada do que os capilares sanguíneos intestinais. A proporção de componentes lipídicos são também absorvidos transportados a partir do intestino para o sistema circulatório através dos capilares sanguíneos e veia porta como, não só lipoproteína associados, 14 moléculas. Em geral, no entanto, a via de transporte da veia portal é apenas um actor importante na absorção de lípidos de comprimento de cadeia curto e médio prazo. A recolha de linfa mesentéricos permite assim a avaliação do transporte de lipoproteínas e os componentes associados (lípidos, moléculas lipofílicas, apo-proteínas) a partir do intestino. As lipoproteínas podem ser quantificados e caracterizado com a vantagem de que as lipoproteínas linfáticos mesentéricos, em geral, estão em uma nascenestado t, uma vez que não foram extensivamente modificado por enzimas sistêmicas tais como lipoproteína lipase 15. Embora o modelo de rato canulada linfático mesentérico foi talvez historicamente sido mais extensivamente descrito para a análise de transporte de lípido / lipoproteína a partir do intestino, uma área de expansão interesse é o papel de vasos linfáticos no transporte de fármacos lipofílicos, pró-drogas e outros xenobióticos 13,16 que é o foco do modelo descrito aqui. Fármacos lipofílicos (geralmente aqueles com log P&gt; 5 e solubilidade em cadeia longa triglicéridos&gt; 50 mg / g, embora exceções são aparentes) 17,18, pró-drogas 19 e outros xenobióticos 13,16 pode ter acesso aos vasos linfáticos intestinais passivamente ou por integrar activamente em lipoproteínas intestinal vias de transporte 19. O rato linfa mesentérica técnica de punção, portanto, tem muitas aplicações. Bollman et al. Descreveu pela primeira vez um technique para canular a conduta de linfa mesentéricos de ratos em 1948 20. Desde então um certo número de variantes do modelo foram descritos. Por exemplo, a coleta pode ocorrer quando o rato é anestesiados com vários anestésicos 21,22, ou no estado consciente enquanto conteve 15 ou mover livremente 23,24. Os ratos podem ser administrados diferentes soluções de reidratação e outras substâncias, tais como lípidos e de formulações de drogas em taxas diferentes no estômago, intestino ou parentérica (tipicamente 0-5 ml / h) 25. Em alguns estudos, o ducto torácico linfático em vez de ducto linfático mesentérico é canulada para estimar o transporte a partir do intestino através dos vasos linfáticos, embora isto possa subestimar o trânsito do intestino delgado, dependendo o factor de interesse, como a conduta de linfócito torácico recebe também a partir de linfa outra regiões 22,26. Modelos de canulação linfáticos também foram descritos em várias outras espécies, incluindo ratos 15,27, mini-pigs 12, 28,29 ovelhas, porcos e cães 30 31. No entanto, o modelo de rato é o mais amplamente e de forma consistente citados. Protocolos detalhados para canulação do ducto linfático mesentérica seguido da coleta de linfa no consciente 25 ou anestesiados 22 ratos e camundongos 15,27 foram publicados anteriormente e o leitor interessado é direcionado para estes protocolos. Este protocolo é o primeiro a demonstrar a técnica em um formato visualizado. O modelo de rato linfa cânula tem vantagens sobre animais de grande porte em termos de despesa, a facilidade da cirurgia e considerações éticas. Quando comparado com o modelo do rato, mesentérica linfa cirurgia cannulation também é mais fácil no rato, embora o modelo de rato permite estudos mais detalhados em animais transgênicos 27. No entanto, existem algumas limitações do modelo de rato, particularmente aqueles associados com diferenças na fisiologia, esse limite extrapolatião positivo para outras situações pré-clínicos e clínicos. Por exemplo, o fluxo de bílis no rato é constante e independente da ingestão de alimentos enquanto que na maior comida lipídios espécies ou estimular o fluxo de bílis 32. Isso cria desafios para a obtenção de ambientes de pré e pós-prandial representativos no rato que refletem o que é visto em espécies e seres humanos maiores. Para os estudos de distribuição de drogas, espécies maiores também podem ser preferidos na avaliação dos transportes linfática após a administração da dose humana realista forma 25. Em um estudo recente, as taxas de transporte de lipídios na linfa mesentérica foram encontrados para ser comparáveis ​​entre espécies (rato, cão) após a administração de uma massa equivalente e tipo de lipídio que fornece alguma confiança na extrapolação de dados de transporte de lipídios entre espécies 27. No entanto, o transporte de um modelo lipofílico de drogas, halofantrina, classificados em ordem de tamanho do animal (ou seja, cão&gt; rat&gt; mouse). Um fator de escala pode, assim, ser obrigado a extrapolate dados de transporte de drogas linfáticos de rato a outras espécies. Uma limitação dos modelos de canulação de linfa, em geral, é que a recolha de linfa passiva directamente a partir de uma conduta linfático pode modificar o fluxo linfático e de transporte uma vez que os vasos linfáticos trabalhar contra um gradiente de pressão que é alterada uma vez que o recipiente 33 é canulada. O modelo cannulation linfático também pode ser difícil de estabelecer, em laboratórios que não estão familiarizados com a técnica. Modelos alternativos têm sido assim descrito. Por exemplo, o transporte de factores através do sistema linfático intestinal, tais como lipoproteínas e moléculas lipofílicas, foi estudado indirectamente através de recolha do sangue. Um desses modelos envolve a comparação de concentrações de lípidos no sangue e / ou drogas, após a administração oral, na presença e na ausência de inibidores (por exemplo, colchicina, Pluronic L81, ciclo-heximida) produção de lipoproteína intestinal que bloqueie o transporte linfático 34. Uma vantagemde modelos que quantificam transporte linfático indiretamente por meio da coleta de amostras de sangue é que ele permite alguma avaliação do transporte linfático em humanos como cirurgia invasiva não é necessária 35. No entanto, os inibidores de transporte linfático não são específicas e factores que são transportados através dos vasos linfáticos são diluídos e modificado na circulação sistémica que complica estas avaliações. In vitro alternativas também têm sido descritos. Por exemplo, Caco-2 celulares ou isolado enterócitos culturas têm sido utilizados para estudar mais detalhadamente a secreção intestinal de moléculas que entram nos vasos linfáticos 36-38. Um modelo avançado in vitro que é mais representativo do microambiente intestinal humana também foi descrita recentemente 39. Neste modelo, uma camada de células endoteliais linfáticas é co-cultivadas com células Caco-2, que permite uma análise mais detalhada da transferência de substâncias a partir do intestino para o sistema linfático. No entanto, em vitro sistemas de células não possuem fluxo cambial e transferir ou seja, a interligação com um lúmen intestinal e sangue subjacente e suprimento vascular linfático. Em uma abordagem alternativa, Kassis et al. Estabeleceram um dual-channel (alta velocidade vídeo de campo brilhante e fluorescência), em sistema de imagem situ que permite comparações quantitativas entre contração dos vasos, o fluxo de linfa e concentrações de lipídios fluorescentes em vasos linfáticos mesentéricos 33. Uma vantagem deste modelo sobre o acima mencionado em sistemas in vitro é que ele permite a localização precisa da passagem de células do sistema imunológico através dos vasos linfáticos. Medições absolutas de massa de lípidos (ou medicamento) de transporte são, no entanto, ainda não está estabelecida utilizando métodos de imagem. Estudos in vitro e in silico abordagens especificamente para prever o grau de transporte da droga lipófila através dos vasos linfáticos intestinais foram também publicados 40-42. Por exemplo, a afinidade ex vivo de vários compounds para chylomicrons plasma correlacionou-se razoavelmente bem com o seu transporte linfático in vivo 41. Posteriormente, o mesmo grupo estabeleceu um modelo em silico para prever a afinidade da droga para chylomicrons com base em múltiplos de 40 propriedades físico-químicas. Holm et al., Também estabelecida uma relativamente complexo no modelo para prever silico imediato transporte linfático de compostos lipofílicos em função dos descritores moleculares 42. Estes modelos podem proporcionar uma abordagem útil para prever a extensão de transporte linfático de drogas desconhecidas. A validação dos modelos com uma grande variedade de drogas e em diferentes laboratórios, no entanto, ser necessário para confirmar a sua precisão e reprodutibilidade. A canulação do canal linfático mesentérico permanece, assim, os únicos meios para examinar directamente o conteúdo de drenagem linfática do intestino delgado e a velocidade de trânsito do complexo conjunto de factores (células, proteínas,peptídeos, lipídios, medicamentos) a linfa em uma situação in vivo. Aqui nós descrevemos um protocolo para a canulação do ducto linfático e carótida artéria mesentérica, que permite a coleta de linfa mesentérica e arterial sistêmica de ratos anestesiados. Os dados representativos demonstram como o modelo pode ser usado para examinar o transporte de lípidos e de drogas a partir do intestino, através do sistema linfático mesentérico. Isto é seguido por uma discussão das dificuldades que podem ser encontradas no estabelecimento do modelo e um guia de resolução de problemas. Uma vez estabelecido o modelo é uma ferramenta poderosa para investigar transporte linfático intestinal.

<table><tbody><tr><td>Solução salina estéril</td><td>Baxter healthcare</td><td>AHB 1307</td><td>Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é Baxter 100 ml sacos de solução salina, caixa de 50</td></tr><tr><td>70% etanol em água</td><td>Qualquer</td><td></td><td>marca pode ser usada</td></tr><tr><td>Solução de gluconato de clorexidina (Microshield 4)</td><td>Livingstone International</td><td>JJ60243L</td><td>Qualquer marca pode ser usada. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =JJ60243L</td></tr><tr><td>Solução de Betadine</td><td>Livingstone International</td><td>BU0510</td><td>Qualquer marca pode ser usada. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =BU0510</td></tr><tr><td>Ilium Ketamil (Cetamina 100 mg/ml)</td><td>PROVET VICTORIA&nbsp;</td><td>KETA I 1</td><td>http://www.provet.com.au/</td></tr> <tr><td>Ilium Xylazil (Xylazine 100 mg/ml)</td><td>PROVET VICTORIA&nbsp;</td><td>TRO-3828</td><td>http://www.provet.com.au/</td></tr> <tr><td>ACP 10 Injeção (Acepromazina 10 mg/ml)</td><td>PROVET VICTORIA&nbsp;</td><td>VTG-DACP010020</td><td>http://www.provet.com.au/</td></tr> <tr><td>Pentobarbitone de sódio</td><td>PROVET VICTORIA&nbsp;</td><td>24529</td><td>Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é Lethabarb&reg; 325 mg/ml de pentobarbital sódico, Virbac Animal Health. http://www.provet.com.au</td></tr><tr><td>Heparina (35000I.U. em 35 mL)</td><td>Sigma Pharmaceuticals</td><td>337220</td><td>http://sigmaco.com.au/</td></tr> <tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) sal dissódico di-hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1644</td><td>Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é o sal dissódico de EDTA da Sigma.&nbsp;</td></tr><tr><td>Cânula de polietileno (PE) o.d. 0,96 mm x i.d. 0,58 mm</td><td>Extensões de microtubos</td><td>PE8050</td><td>Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é a tubulação PE 0,96 x0,58 mm, cânula</td></tr> de <tr><td>polietileno (PE) de 30 m o.d. 0,8 mm x i.d. 0,5 mm</td><td>Extensões de microtubos</td><td>PE9658</td><td>Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é a tubulação PE 0,8 x0,5 mm, 30 m</td></tr><tr><td>Régua</td><td>Qualquer</td><td></td><td>marca pode ser usada</td></tr><tr><td>Marcadores</td><td>Qualquer</td><td></td><td>marca pode ser usada</td></tr><tr><td>Isqueiro</td><td>Qualquer</td><td></td><td>marca Qualquer marca pode ser usada</td></tr><tr><td>Adesivo veterinário</td><td>Qualquer</td><td></td><td>marca pode ser usada</td></tr><tr><td>Agulhas de calibre 23</td><td>Livingstone International</td><td>DN23GX0.75LV</td><td>Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é a Agulha Descartável Livingstone, Estéril, 23GX0.75inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT= 6& search=DN23GX0.75LV</td></tr><tr><td>Agulhas de 25 gauge</td><td>Livingstone International</td><td>DN25GX1.0LV</td><td>Qualquer marca pode ser usada. O exemplo aqui é a Agulha Descartável Livingstone, Estéril, 25GX1.0inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search= DN25GX1.0LV</td></tr><tr><td>Seringa de 1 ml</td><td>Livingstone International</td><td>T3SS01TA</td><td>Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é a seringa Terumo 1 ml Slip Tuberculin 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =T3SS01TA</td></tr><tr><td>seringa de 10 ml</td><td>Livingstone International</td><td>T3SS10SA</td><td>Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é a seringa Terumo 10 ml Slip 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =T3SS10SA</td></tr><tr><td>Cotonetes de gaze</td><td>Livingstone International</td><td>GSC075</td><td>Qualquer marca pode ser usada e cortada no tamanho necessário. Exemplo aqui é cotonetes de gaze de algodão preenchidos 7,5x7,5 cm, 8 camadas. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =GSC075</td></tr><tr><td>Cotonetes</td><td>Livingstone International</td><td>CTAST075DP</td><td>Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é o aplicador de algodão Livingstone com ponta dupla de plástico. 75MM. 100/PK. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =CTAST075DP</td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento</td><td>Ratek</td><td>WT1</td><td>Qualquer marca que mantenha a temperatura em 37C pode ser usada. Exemplo aqui é a bandeja de aquecimento Ratek.</td></tr><tr><td>Aparelho Harvard de luz cirúrgica</td><td></td><td>72-0215 com 72-0267</td><td>Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é o aparelho Harvard V-Lux 1000 Cold Light Source com guia de luz bifurcada Gooseneck, preto, 4,7 mm de diâmetro de fibra (cada braço). http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_50601_ -1_HAI_ProductDetail e&nbsp; http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_35487_ -1_HAI_ProductDetail___</td></tr><tr><td>Microscópio cirúrgico</td><td>Zeiss</td><td>495005-0014-000</td><td>Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é o estereomicroscópio Zeiss Stemi 2000-C com suporte S Double Spot e KL 300 LED. https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=e&i=10143</td></tr><tr><td>Sutura de seda</td><td>Livingstone International</td><td>DTSK163019F4</td><td>Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é &nbsp; 3/8 Círculo Reverso Sutura de Seda 3/0 Fio 19mm. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =DTSK163019F4</td></tr><tr><td>Lâminas de bisturi</td><td>Ferramentas de Belas Ciências (FST)</td><td>10020-00</td><td>Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é a lâmina de bisturi FST # 20. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=191</td></tr><tr><td>Cabo de bisturi</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>10004-13</td><td>Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é o cabo de bisturi FST #4. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=298&CategoryId=51</td></tr><tr><td>1 x Tesoura cirúrgica pequena</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>14060-09</td><td>Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é a tesoura fina FST, 9 cm com aresta de corte de 21 mm, afiada, reta. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=40&CategoryId=17</td></tr><tr><td>2 x Fórceps com ponta curva serrilhada</td><td>Ferramentas de Ciência Fina (FST)</td><td>11001-13</td><td>Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é a pinça de padrão padrão FST de 13 cm com ponta curva de 2,8x1,4 mm. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=405&CategoryId=32</td></tr><tr><td>1 x Tesoura de Iridectomia</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>15000-08</td><td>Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é a tesoura de mola FST Vannas - aresta de corte de 2,5 mm, reta. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=17&CategoryId=16&nbsp;</td></tr><tr><td>1 x Fórceps com ponta serrilhada reta</td><td>Ferramentas de Ciência Fina (FST)</td><td>11650-10</td><td>Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é FST Graefe 10 cm reto com ponta serrilhada de 1 x 0,99 mm. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=390&CategoryId=32</td></tr><tr><td>1 x Fórceps com ponta fina reta lisa e afiada</td><td>Ferramentas de Ciência Fina (FST)</td><td>11251-10</td><td>Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é a pinça FST Dumont #5 reta de 11 cm com ponta de 0,08 x 0,04 mm. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=335&CategoryId=29</td></tr><tr><td>1 x Pinça com pinça curva fina e lisa</td><td>Ferramentas de Ciência Fina (FST)</td><td>11063-07</td><td>Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é a pinça FST Delicate 9 cm com ponta lisa de 0,4 x 0,3 mm. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=360</td></tr><tr><td>2 x Ferramentas</td> de <td>Ciência Fina Hemostats (FST)</td><td>13010-12</td><td>Qualquer marca pode ser usada. Nem todos os operadores usam os hemostáticos. Exemplo são os hemostáticos Micro-Mosquito FST de 12 cm com ponta serrilhada e reta de 20 mm de comprimento x 1,3 mm de largura. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=377&CategoryId=33</td></tr><tr><td>1 x Suporte de agulha de sutura</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>12001-13</td><td>Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é o porta-agulhas FST 13cm Hasley com ponta de 16 mm de comprimento x 1,9 mm de largura. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=254&CategoryId=70</td></tr><tr><td>1 x Grampo de artéria</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>18050-28</td><td>Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é FST Bulldog Serrefines reto, 28 mm de comprimento, dimensão de mandíbula de 9x1,6 mm com prensa de grampo médio. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=270&CategoryId=82</td></tr><tr><td>Ácido oleico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O1008</td><td>Quando necessário, qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é 99% de ácido oleico puro. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/o1008?lang=en&region=AU</td></tr><tr><td>ácido 14C-oleico</td><td>Perkin&nbsp;</td><td>NEC317050UC&nbsp;</td><td>Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é Ácido Oleico, [1-14C]-, 50&micro; Ci (1,85 MBq). http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/NEC317050UC</td></tr><tr><td>Taurocolato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4009</td><td>Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é o hidrato de sal de sódio do ácido taurocólico &ge; 95% (TLC) . http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4009?lang=en&region=AU</td></tr><tr><td>Halofantrine</td><td>Glaxo Smith Kline</td><td></td><td>Halofantrine foi gentilmente cedida como um presente da Glaxo Smith Kline</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71507</td><td>Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é o fosfato de sódio monobásico monohidratado, BioXtra, para biologia molecular, >99,5%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71643?lang=en&region=AU</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71643</td><td>Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é fosfato de sódio dibásico di-hidratado, BioUltra, para biologia molecular, >99%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71507?lang=en&region=AU</td></tr></tbody></table>

a linfa mesentérica duct canulada rat modelo: aplicação para a avaliação de intestinal linfática transporte da droga

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

O sistema linfático intestinal desempenha um papel-chave no transporte de fluidos, a absorção de lipídios e função imunológica. A linfa flui directamente a partir do intestino delgado através de uma série de vasos linfáticos e dos nodos que convergem na conduta de linfa mesentérica superior. A canulação do canal linfático mesentérico permite assim a obtenção de linfa mesentéricos que flui a partir do intestino. Linfático mesentérico consiste de uma fracção celular de células imunitárias (99% de linfócitos), fracção aquosa (fluido, péptidos e proteínas, tais como as citoquinas e as hormonas do intestino) e fracção de lipoproteína (lípidos, moléculas lipofílicas e apo-proteínas). O modelo de canulação ducto linfático mesentérico pode, portanto, ser usadas para medir a concentração e velocidade de transporte de uma variedade de factores a partir do intestino, através do sistema linfático. Alterações a estes factores em resposta a desafios diferentes (por exemplo, dietas, antigénios, medicamentos) e na doença (por exemplo, doença inflamatória do intestino, HIV, diabetes) pode também be determinada. Uma área de interesse é expandir o papel do transporte linfático na absorção de drogas e pró-drogas lipofílicas administrados por via oral que se associam com as vias de absorção intestinal de lipídios. Descrevemos aqui, em detalhe, um modelo de rato canulado ducto linfático mesentérico, que permite a avaliação da taxa e extensão de lípido e o transporte da droga através do sistema linfático, durante várias horas, após a libertação intestinal. O método é facilmente adaptável para a medição de outros parâmetros de linfa. Nós fornecer descrições detalhadas das dificuldades que podem ser encontradas ao estabelecer esse método cirúrgico complexo, bem como dados representativos de experiências fracassadas e bem sucedidas para fornecer instruções sobre como confirmar o sucesso experimental e interpretar os dados obtidos.

Os resultados de uma experiência representativa para quantificar a extensão cumulativa e taxa de lípido e o transporte da droga através do sistema linfático intestinal após o parto utilizando o modelo de canulação da linfa mesentéricos são mostrados na Figura 4 e na Figura 5. Nesta experiência, 200 ug do modelo lipofílico halofantrina fármaco foi administrado dentro do duodeno de ratos ao longo de 2 horas, em uma formulação contendo 40 mg de ácido oleico (incluindo 2-5 uCi de 14</s...

Aqui descrevemos uma técnica para canular o ducto linfático mesentérico em ratos que permite a quantificação do transporte de lipídios e drogas através do sistema linfático após a administração intestinal. A técnica pode ser adaptada para avaliar as concentrações de linfa mesentérica e/ou transporte de fluidos, células imunes, peptídeos, proteínas e moléculas lipofílicas.

A linfa mesentérica Duct canulada Rat Modelo: Aplicação para a Avaliação de Intestinal Linfática transporte da droga

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a taxa e a extensão do transporte de lipídios e fármacos para o sistema linfático intestinal após administração intestinal. Isso é realizado primeiramente isolando e canulando o ducto linfático mesentérico para coleta de linfa. Na segunda etapa, o duodeno é canulado para permitir a infusão no intestino, e em seguida a artéria carótida é canulada para permitir a coleta de amostras sanguíneas.No passo final, o tratamento experimental é administrado no duodeno e a linfa e o sangue são coletados para a quantificação dos níveis sistêmicos de lipídios ou fármacos. Em última análise, este modelo pode ser utilizado para avaliar a absorção total e o transporte linfático intestinal de lipídios e fármacos após a administração intestinal. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a cânulação direta do ducto linfático mesentérico e a coleta de linfa durante todo o período experimental.Isso permite uma estimativa da quantidade absoluta de material que flui para dentro e através da linfa mesentérica. In vivo, embora este modelo permita a avaliação in vivo do transporte de fármacos e lipídios. Ele também pode ser usado para medir o transporte linfático intestinal de qualquer fator de interesse, bem como a alteração no transporte linfático desses fatores em resposta a diferentes desafios ou estados patológicos.A demonstração visual deste método é essencial, pois a canulação do ducto linfático mesentérico é complicada e difícil devido ao fato de que o ducto é pequeno, frágil e ainda mais difícil de localizar em animais em jejum. A demonstração do procedimento será realizada por minha colega e também membro do corpo docente aqui na Universidade Monash, Dra. Natalie Cus, e por um pós-doutorando sênior do grupo, Dr. LJ Hugh. No dia anterior à cirurgia, corte as cânulas nos comprimentos apropriados e use uma lâmina cirúrgica estéril para fazer um bisel na ponta de cada pedaço de tubo. Em seguida, para preparar a cânula intraduodenal, enrole a cânula sobre si mesma e aqueça-a para criar um ponto de fixação no tubo.No dia da cirurgia, depile os pêlos da região abdominal direita, do pescoço e da clavícula esquerda de uma rata adulta anestesiada e, em seguida, limpe as regiões cirúrgicas assépticamente com três fricções sucessivas de solução de poviodine e etanol a 70% para canular o ducto linfático. Posicione o animal com o lado direito voltado para cima e use uma lâmina de bisturi estéril para abrir a camada superior da parede muscular abdominal com uma incisão reta de quatro centímetros, estendendo-se do processo xifoide até a região lateral direita, aproximadamente dois centímetros abaixo da margem costal. Retraia o intestino delgado sob a parede abdominal esquerda e use dois a três pedaços de gaze estéril saturados com solução salina normal para mantê-lo no lugar.Em seguida, suspenda o rato sobre uma seringa plástica de 10 mililitros posicionada horizontalmente sob o dorso do animal, ao nível do rim direito. Para auxiliar na visualização do ducto linfático mesentérico, localize o ducto linfático mesentérico superior, que possui aproximadamente 0,5 a 1 milímetro de diâmetro, posicionado perpendicularmente ao rim direito e imediatamente cranial e paralelo à artéria mesentérica pulsátil de cor vermelho-escura. Observe que, em ratos não jejuados, como mostrado aqui, o ducto linfático mesentérico superior é branco, opaco e mais fácil de visualizar do que em ratos jejuados.Em seguida, passe um par de pinças retas através do leito adiposo perirrenal na margem inferior do rim direito, paralelamente ao ducto linfático mesentérico superior e através das camadas de tecido conjuntivo imediatamente abaixo da veia cava. Então, usando a ponta das pinças, puxe a cânula linfática através do leito adiposo perirrenal, com uma extremidade imediatamente adjacente ao ducto linfático mesentérico e a outra exteriorizada do animal ao nível do rim direito. Em seguida, utilizando um microscópio cirúrgico e pinças de joalheiro, isole o ducto linfático mesentérico através das camadas sobrejacentes de tecido conjuntivo e adiposo por dissecação romba, começando pela extremidade inferior e tomando cuidado para não danificar o ducto linfático quando este for isolado.Use a ponta da pin&ccedil;a de ponta fina para fazer um pequeno orif&iacute;cio no ducto linf&aacute;tico. Ap&oacute;s garantir que o cateter linf&aacute;tico esteja completamente preenchido com solu&ccedil;&atilde;o anticoagulante e sem bolhas de ar, use um pequeno par de pin&ccedil;as para inserir o cateter linf&aacute;tico cerca de dois a quatro mil&iacute;metros dentro do ducto linf&aacute;tico mesent&eacute;rico atrav&eacute;s da pun&ccedil;&atilde;o. Se a canula&ccedil;&atilde;o for bem-sucedida, um fluxo gradual de linfa intestinal ser&aacute; observado na extremidade coletora livre do cateter.Quando isso ocorrer, aplique uma pequena gota de cola de cianoacrilato sobre o orifício de entrada no ducto linfático para fixar a cânula, tomando cuidado para não obstruir o vaso com excesso de cola ao cânular o duodeno. Primeiro, localize o tecido como a seção rosa-avermelhada do intestino delgado, que, ao ser suavemente puxada para baixo, revela o estômago. Em seguida, use uma agulha estéril de calibre 23 para fazer um pequeno furo de punção no duodeno na região do piloro, aproximadamente dois centímetros abaixo da junção entre o estômago e o duodeno.Em seguida, insira a extremidade em gancho em formato de js da cânula duodenal através da punção e fixe a cânula no lugar com uma gota de cola acrílica Sano. Depois, use suturas para fechar a incisão na parede muscular abdominal. A canulação da artéria carótida pode ser realizada antes ou depois da canulação do ducto linfático mesentérico. Geralmente preferimos canular a artéria carótida antes da canulação do ducto linfático, para reduzir a possibilidade de deslocar a cânula linfática ao movimentar o animal. Para canular a artéria carótida, primeiro marque a cânula da artéria carótida a 2,5 centímetros da ponta biselada, a fim de identificar a porção do tubo que será inserida na artéria.Em seguida, conecte a extremidade não biselada da cânula a uma agulha de 25 gauge acoplada a uma seringa preenchida com solução anticoagulante e encha a cânula com a solução, certificando-se de que não haja bolhas de ar. A seguir, faça uma incisão longitudinal de um a 1,5 centímetro através da camada cutânea acima do lado esquerdo da traqueia no plano sagital e, então, use pinças de ponta romba para dissecar o tecido conjuntivo subcutâneo e expor os músculos cervicais emparelhados subjacentes. Retraia os músculos cervicais para revelar a artéria carótida esquerda pulsante, localizada aproximadamente um centímetro abaixo da superfície da pele.Em seguida, limpe o tecido conjuntivo sobrejacente da artéria por dissecação romba e use pin&ccedil;as rombas para isolar uma se&ccedil;&atilde;o de aproximadamente um cent&iacute;metro da art&eacute;ria. A seguir, use pin&ccedil;as de ponta fina para passar dois fios de seda sob a art&eacute;ria car&oacute;tida, posicionando-os em cada extremidade da se&ccedil;&atilde;o isolada da art&eacute;ria. Em seguida, amarre o fio mais distante do cora&ccedil;&atilde;o e da clav&iacute;cula do rato e posicione um par de pin&ccedil;as retas de ponta fina sob a car&oacute;tida para ocluir o fluxo sangu&iacute;neo pela art&eacute;ria.Agora, utilizando tesoura de ponta fina para íris, faça uma pequena incisão na superfície superior da artéria, aproximadamente um terço do caminho a partir do topo da área isolada. Insira a ponta da cânula na artéria com uma pinça de ponta curva. Uma vez inserida, remova a pinça de ponta fina reta, ocluindo o fluxo sanguíneo, e avance a cânula 2,5 centímetros dentro da artéria utilizando dois pares de pinças.Um para segurar a cânula dentro da artéria e impedir que o sangue vaze de volta e outro para inserir a cânula. Em seguida, use um pequeno grampo arterial para fixar a cânula dentro da artéria. Injete solução anticoagulante na cânula, seguido pela retirada de uma pequena quantidade de sangue para confirmar a perviedade do tubo.Em seguida, lave a cânula com solução anticoagulante e feche a extremidade usando a chama de um isqueiro. Por fim, use os pontos para fixar a cânula no lugar e remova o grampeamento da artéria. Em seguida, posicione um terceiro ponto ao redor da artéria e da cânula, encurte o comprimento dos pontos ao redor da artéria e feche a incisão no pescoço com mais pontos após o período de recuperação, infundindo uma formulação de interesse no animal por meio da cânula duodenal.Como ilustrado no gráfico após a administração do modelo, o fármaco lipofílico halal fanene, a taxa média de fluxo linfático para ratos com cânula bem-sucedida foi entre 0,4 e 1,3 mililitros por hora. Em alguns animais, a taxa de fluxo linfático foi ligeiramente menor durante as primeiras uma a três horas após a cânula, antes de aumentar, um fenômeno comumente observado após cânula linfática bem-sucedida em ratos com cânula mal-sucedida. No entanto, a taxa de fluxo permanece substancialmente mais baixa do que a observada nos experimentos bem-sucedidos durante todo o período de coleta.Da mesma forma, nesses experimentos representativos, o transporte linfático cumulativo de triglicerídeos e halal RIN foi substancialmente menor nos animais com cânula mal posicionada. Enquanto nos grupos com cânula bem posicionada, o transporte cumulativo médio de halalan foi de 15,1% da dose e o transporte cumulativo de triglicerídeos foi de 61 miligramas ao longo de 10 horas. Neste experimento representativo de transporte de lipídios, a proporção da dose lipídica exógena radioativamente marcada administrada que foi transportada pela linfa foi de 54%. Esses valores não diferiram significativamente dos observados anteriormente.Para uma formulação semelhante, a taxa de transporte de triglicerídeos e fármacos para a linfa atinge um pico logo após a administração de lipídios e fármacos, e depois retorna aos níveis basais. Como é típico em experimentos de transporte intestinal de lipídios e fármacos pela via linfática. A taxa de transporte do fármaco na linfa durante cada período de tempo reflete esse cenário para o transporte de triglicerídeos, já que o fármaco é transportado para a linfa.Em associação com as lipoproteínas ricas em triglicerídeos. Uma vez dominada, a cânula pode ser concluída em até 30 minutos, caso não sejam encontradas dificuldades. Após este procedimento, os componentes presentes na linfa coletada podem ser isolados e utilizados em experimentos adicionais, como por exemplo para reinfusão em animais receptores, a fim de avaliar diretamente sua função, metabolismo, depuração ou padrões de distribuição. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão das técnicas para isolar e canular o ducto linfático mesentérico, a artéria carótida e o duodeno.Usando essas técnicas, você deverá ser capaz de avaliar o transporte de fármacos, lipídios e outros fatores do intestino através e para dentro da linfa mesentérica in vivo.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra uma técnica para canular o ducto linfático mesentérico em ratos. Este método permite o acesso direto a todo o volume de componentes presentes no fluido linfático.

Canulação do Ducto Linfático Mesentérico em Modelo de Rato para Colheita de Fluido Linfático

Este vídeo demonstra a canulação intraduodenal em um modelo de rato. Após anestesiar o rato, o duodeno é localizado e uma pequena punção é criada. Uma cânula em forma de J com ponta chanfrada é cuidadosamente inserida e presa, e a incisão é fechada. O modelo de rato canulado permite a infusão intra-intestinal para estudos de imunopatologia.

Canulação intraduodenal em modelo de rato para estudos de imunopatologia

Neste vídeo, demonstramos um procedimento cirúrgico para canular a artéria carótida esquerda em um modelo de rato.

Canulação da artéria carótida em modelo de rato

Apresentamos um procedimento cirúrgico para cateterizar o tronco linfático intestinal em porcos neonatais para coletar grandes quantidades de componentes do metabolismo lipídico da linfa eferente.

Long-Term Cateterismo do tronco linfa intestinal e Recolha de linfa no Neonatais Pigs

O acesso à infusão a longo prazo na artéria mesentérica superior (SMA) dos ratos é um procedimento cirúrgico que consiste na cannulação de um ramo proximal da SMA. A cânula sai da ferida abdominal e é encapsulada através do espaço subcutâneo de volta para a dobra interscapular.

Mirando o intestino delgado do rato: infusão de longo prazo na artéria mesentérica superior

Aqui, descrevemos um método preciso para coletar linfócitos toráclicos e observar a migração de linfócitos gut-tropic nos patches de Rato Peyer por 3 horas usando fotografia de lapso de tempo. Esta técnica pode esclarecer como a dinâmica dos linfócitos são afetadas em condições inflamatórias.

Observação microscópica da Dinâmica do Linfócito em Patches de Rat Peyer

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O Isolamento da Linfa Mesentérica Corrente em Camundongos para Quantificar a Cinética In Vivo de Absorção de Lipídios da Dieta e Secreção de Quilomícrons

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