Um ensaio colorimétrico que mede Especificamente granzima B Actividade proteolítica: Hidrólise de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl
28 de novembro de 2014
Descrevemos um ensaio colorimétrico simples e quantitativo que mede especificamente a atividade proteolítica da Granzyme B (GzmB) humana, de camundongo ou de rato. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para determinar a atividade da protease de outras proteases de serina de grânulos pela hidrólise de outros substratos peptídicos sintéticos com uma sequência de reconhecimento apropriada.
O objetivo geral do seguinte experimento é medir a atividade proteolítica da protease ine granzima B. Isso é alcançado primeiro preparando um lisado das células de interesse e, em seguida, adicionando rapidamente o substrato às amostras. A atividade da granzima B é então medida por meio de uma reação colorimétrica. Em última análise, a clivagem altamente específica de alla alla as s benzo pela granzima B pode ser avaliada com base em sua especificidade exclusiva por resíduos de ácido aspártico.
A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a detecção da expressão da zona B usando PCR ou Western blot, é que a hidrólise do benzil é específica para a zona B e também indica que a protease está ativa. Para preparar a célula, os lisados primeiro isolam células NK primárias a partir de suspensões de células únicas de baços de camundongos selvagens C57 black six ou camundongos controle nulos para o gene da granzima B, por seleção negativa usando kits comercialmente disponíveis, de acordo com as instruções do fabricante, após as células terem sido ativadas. Lave o cultivo três vezes em PBS na velocidade máxima por dois a três segundos e, em seguida, re-suspenda o pellet contendo um mínimo de 5 milhões de células NK em 100 microlitros de tampão de lise Nont P40 em gelo por 20 minutos.
Em seguida, centrifugue o lisado em um microcentrífugo por 10 minutos a 15.000 Gs e transfira o sobrenadante para um novo tubo. Após determinar a concentração de proteína, de acordo com o protocolo comercialmente disponível apropriado, armazene o lisado numa concentração mínima de aproximadamente dois miligramas por mililitro a menos 20 graus Celsius para realizar um ensaio de atividade da enzima B. A seguir, dilua um mínimo de 100 microgramas de lisado proteico por amostra em tampão HEPES recém-preparado até um volume final de 160 microlitros.
Em seguida, utilizando uma pipeta multicanal, adicione 50 microlitros de amostra por poço, em triplicata, em uma placa de 96 poços de fundo redondo em vinil. Cuidando para incluir três poços controle contendo apenas tampão, adicione 100 microlitros de DTNB diluído a cada poço. Então, adicione rapidamente 50 microlitros de substrato recém-diluído de alal a asks s benzoyl a cada um dos poços com tampão apenas, seguidos pelos eventuais controles negativos, e finalizando com as amostras positivas esperadas.
Meça a atividade da aase pela hidrólise do alala como benzil em um leitor de microplacas a uma densidade óptica de 405 nanômetros, utilizando um protocolo de ensaio cinético que realiza 25 leituras a cada 15 segundos. Por fim, utilize o software do leitor de placas para calcular a taxa máxima de clivagem do substrato para cada poço e, em seguida, transfira os dados brutos para o software apropriado de análise estatística utilizando camundongos com inativação gênica da granzima. Descobriu-se que o substrato peptídico sintético alala como benzil é especificamente hidrolisado pela granzima B. Uma clivagem adicionalmente robusta do substrato sintético pode ser medida em lisados celulares de linfócitos NK primários selvagens, mas não em células NK de animais com inativação da granzima B, utilizados como controle.
Neste experimento, a atividade proteolítica da granzima A, que possui especificidade de substrato semelhante à tripsina e está presente em lisados de ambos os tipos de células, foi igual, medida pela hidrólise de BLT benzil. I-E-P-D-P-N-A tem sido usado genericamente para testar a atividade da granzima B entre espécies. Nesta análise representativa do experimento, a análise das sequências de tetrapéptidos revelou que a granzima B humana, mas não a murina, pode clivar eficientemente após a sequência IEPD, que corresponde à sequência de reconhecimento tanto na Bid humana quanto na murina. Em contraste, reduzir a quantidade de lisado de células de leucemia NK humanas de 30 microgramas para 10 microgramas ainda resulta em quantidade suficiente da enzima granzima B para hidrolisar o substrato I-E-P-D-P-N-A.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como escolher o substrato apropriado e os controles experimentais para a análise in vitro da enzima B vermelha humana e de camundongo.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um ensaio colorimétrico quantitativo para medir a atividade proteolítica da Granzima B (GzmB) em amostras humanas, de camundongo ou de rato. O método pode ser adaptado para outras proteases séricas de grânulos utilizando diferentes substratos peptídicos sintéticos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Atividade de protease
- Biologia celular
Contexto
- A granzima B é uma protease serina envolvida nas respostas imunes.
- A medição de sua atividade é fundamental para compreender seu papel na citotoxicidade mediada por células.
- Métodos existentes, como PCR ou Western blot, não medem diretamente a atividade da protease.
- Este ensaio fornece uma medição específica e direta da atividade de GzmB.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um ensaio simples para quantificar a atividade da GzmB.
- Fornecer um método que possa ser adaptado para outras proteases.
- Aprimorar técnicas existentes ao oferecer especificidade para a atividade da GzmB.
Métodos Utilizados
- Preparação de lisados celulares de linfócitos NK primários.
- Uso de uma reação colorimétrica para medir a atividade da GzmB.
- Isolamento de células NK de baços de camundongos selvagens e nulos para o gene da granzima B.
- Hidrólise do substrato para avaliar a atividade de protease.
Resultados Principais
- O ensaio mede com sucesso a atividade da GzmB por meio da clivagem específica do substrato.
- Ele demonstra alta especificidade para a GzmB em comparação com outros métodos.
- Os resultados indicam que a protease está ativa com base na hidrólise do substrato.
- O método é adaptável para outras proteases serina de grânulos.
Conclusões
- O ensaio desenvolvido é uma ferramenta confiável para medir a atividade da GzmB.
- Oferece vantagens em relação aos métodos tradicionais ao avaliar diretamente a função da protease.
- Essa abordagem pode aprimorar a pesquisa sobre respostas imunes e biologia das proteases.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A medição precisa da atividade proteolítica da Granzima B é essencial para validar a função dos linfócitos citotóxicos no desenvolvimento de imunoterapias. Este ensaio colorimétrico fornece uma leitura direta e específica da atividade da protease, permitindo a redução de riscos mecanicistas do engajamento do alvo e do potencial pró-apoptótico em modelos pré-clínicos. Sua compatibilidade entre espécies apoia a continuidade translacional dos estudos em roedores para aplicações humanas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de vias de apoptose dependentes da granzima B em linfócitos citotóxicos.
- Valor Operacional: Distingue a protease ativa da mera expressão, reduzindo falsos positivos na validação de alvos.
- Valor Preditivo: Apoia a confirmação funcional da granzima B como fator mecanicista na eliminação imunomediada de tumores.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Utiliza o substrato Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl, hidrolisado exclusivamente pela Granzima B em sistemas humanos, de camundongo e de rato.
- Saída Quantitativa: Mede as taxas iniciais de hidrólise por meio de reação colorimétrica acoplada ao DTNB a 405 nm para análise cinética.
- Controle de Especificidade: Exclui interferência de caspases e outras granzimas devido à preferência única por aspartato.
- Reprodutibilidade: Compatível com lisados não fracionados e proteases recombinantes quando controles adequados são incluídos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Aplicável a modelos de imunovigilância tumoral, infecção viral e patologia autoimune em que a granzima B media a morte celular alvo.
- Continuidade Tradutiva: Permite a medição consistente da atividade entre espécies, apoiando a extrapolação de dados de camundongo para humanos.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Fornece um biomarcador baseado na atividade para priorizar candidatos com potencial citotóxico confirmado.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio insere-se na sequência de descoberta, desde a validação do alvo até a otimização do composto inicial, onde a atividade funcional da protease fornece informações sobre a eficácia biológica e o mecanismo de ação.
- Biologia da Descoberta: Confirma a hipótese de que a Granzima B induz apoptose em linfócitos efetores por clivagem específica de substrato.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas padronizadas de atividade para comparação entre condições ou perturbações genéticas.
- Análises: Gera dados cinéticos (Vmax) que permitem comparação entre amostras e avaliação estatística da capacidade proteolítica.
- Pesquisa Translacional: Apoia a validação pré-clínica ao verificar a atividade conservada entre Granzima B humana, de camundongo e de rato.
- Reutilização Empresarial: Plataforma adaptável a outras proteases de grânulos mediante substituição de substrato, aumentando a utilidade a longo prazo.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: A medição direta da função proteolítica reduz a dependência de marcadores indiretos, como níveis de mRNA ou proteína.
- Valor Operacional: Formato simples, baseado em placas, com tempo mínimo de manipulação manual e compatibilidade com leitores padrão de microplacas.
- Valor Estratégico: Permite decisões de avanço ou interrupção com base na atividade funcional, e não apenas na expressão, melhorando a confiança preditiva.
- Impacto no Portfólio: Facilita o avanço de imunoterapias com ajuste de risco ao confirmar a potência mecanicista no início do desenvolvimento.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no isolamento de células imunes primárias e na sua lise sob condições controladas para preservar a atividade de proteases.
- Depende do acesso a um leitor de microplacas capaz de realizar medições cinéticas de OD405 e software de análise compatível.
- Necessita da inclusão de controles com ausência de Granzima B para confirmar a especificidade do ensaio, conforme demonstrado na fonte.
- A adaptação a outras proteases exige a validação de substratos alternativos para manter especificidade e janela de sinal equivalentes.
- Limitação prática: o ensaio mede a atividade total do lisado e pode exigir fracionamento para estudos de localização subcelular.
