Reconstituição funcional e atividade do canal Medidas de purificada tipo selvagem e mutante CFTR Protein

O objetivo geral deste procedimento é medir a função de uma população de canais CFTR em um sistema reconstituído e examinar a resposta desses canais à presença de moléculas moduladoras. Isso é realizado primeiramente purificando a proteína CFTR selvagem ou mutante de células SF nine por meio de um procedimento rápido de purificação, que fornece proteína CFTR funcional em solução com detergente. O segundo passo consiste em reconstituir a proteína purificada em proteolipossomos de lipídio definido, escolhido pelo pesquisador.

Em seguida, um gradiente químico de iodeto é estabelecido através da membrana pela remoção do iodeto lipossomal em excesso, gerando uma força motriz para o movimento iônico através do canal CFTR. O passo final consiste em ativar o canal e iniciar a liberação de iodeto dos lipossomos proteicos na presença da molécula moduladora de interesse. Em última instância, um eletrodo seletivo para iodeto é utilizado para monitorar, em tempo real, a função do canal CFTR neste sistema reconstituído.

Este método permite o estudo da atividade do canal de cloreto de uma população purificada de moléculas de CFTR após a reconstrução em lipossomos de fosfolipídios. Embora este método tenha sido escolhido para fornecer informações sobre a função do canal C-F-D-R-N nove e o efeito de moduladores de pequenas moléculas, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como a caracterização funcional de outras proteínas de membrana. Para obter sucesso, indivíduos novos neste método precisam garantir que tenham otimizado as proporções de proteína para lipídio em seu sistema, que não estejam trabalhando com proteína pouco funcional ou não funcional e que tenham gerado um gradiente suficiente de iodeto através de vesículas bem seladas.

Para preparar o lipídio, primeiro seque cinco miligramas de fosfatidilcolina de ovo ou PC de ovo em um tubo de vidro não borossilicatado sob fluxo de gás argônio por 20 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, calcule o volume do tampão seis conforme indicado no protocolo do texto e adicione diretamente o tampão seis ao lipídio. Sobre o tubo de vidro, coloque uma tampa de perfil e, então, vortexe o tubo por dois minutos à temperatura ambiente para suspender o lipídio no tampão.

Em seguida, suspenda o lipídio em temperatura ambiente usando uma agulha de 25 mm acoplada a uma seringa de um mililitro até que não haja filme de lipídio visível na parede do tubo. O tampão ficará turvo devido ao lipídio suspenso. Soneque o lipídio no tubo por uma rajada de 22 segundos em um banho de ultrassom com gelo, e depois coloque o tubo sobre gelo para repouso por um minuto.

Realize este ciclo três vezes. Em seguida, adicione a proteína CFTR ao lipídio, obtendo um volume final de um mililitro. Misture a proteína com uma suspensão de lipídio 10 vezes usando uma agulha de 25 graus.

Coloque a amostra em gelo por 30 minutos, agitando o tubo cinco vezes a cada cinco minutos para misturar durante a incubação da amostra. Quebre a aba inferior de uma coluna de centrifugação descartável para ligação de detergente e centrifugue a coluna por dois minutos a 2000 vezes G. Para remover o tampão de armazenamento, lave a coluna com cinco mililitros do tampão sete e centrifugue a coluna por quatro minutos a 2000 vezes G para eluir o tampão de lavagem.

Lave a coluna três vezes, transfira toda a amostra proteína-lipídio de um mililitro para o topo da resina da coluna e, em seguida, incube a coluna por dois minutos à temperatura ambiente. Centrifugue a coluna à temperatura ambiente por quatro minutos a 2000 vezes G. Em seguida, transfira a amostra turva de proteolipossomos para um tubo microfusão limpo e coloque o tubo no gelo. Embeba cinco gramas de esferas de Cidex G-50 em 50 mililitros do tampão nove por pelo menos duas horas à temperatura ambiente.

Em seguida, carregue quatro colunas pequenas de triagem com as esferas saturadas até que fiquem pelo menos três quartos cheias. Centrifugue as colunas por quatro minutos a 2000 vezes G para remover o tampão em excesso da resina. Aproximadamente 2,25 mililitros de resina compactada devem permanecer na coluna após a centrifugação.

É fundamental que a resina esteja adequadamente hidratada para a eluição com as protealipossomas. Em seguida, transfira 125 microlitros da amostra de protealipossomas para o topo de cada coluna e centrifugue por quatro minutos a 2000 vezes. Reúna os EITs para uso nos experimentos de FLX com iodeto.

Coloque um pequeno bastão de agitação de F felpudo em uma cavidade de uma placa de 96 poços e, em seguida, adicione 150 microlitros de VX sete 70 numa concentração de 20 micromolar no tampão nove ao poço. Use uma ponta de pipeta para remover quaisquer bolhas. Em seguida, adicione 150 microlitros da amostra de proteolipossomo ao poço, atingindo um volume total de 300 microlitros.

Coloque a placa de 96 poços sobre uma placa agitadora a 130 rotações por minuto. Insira a ponta do eletrodo sensível ao iodeto na solução sem tocar o bastão de agitação ou o fundo do poço. Para registrar os traçados do sinal do eletrodo, filtre o sinal por meio de um filtro passa-baixa com uma taxa de amostragem de dois hertz e registre os traçados da amostra por cinco minutos para permitir que a amostra atinja o equilíbrio.

Deve produzir uma linha de base estável e quase plana. Em seguida, adicione três microlitros de uma solução estoque de 100 milimolar de magnésio A TP em pH 7. Para ativar os canais CFTR, deixe a amostra equilibrar por mais cinco minutos até atingir uma nova linha de base.

Em seguida, adicione três microlitros de uma solução estoque de dois micromolares. Uma valinomicina para eliminar o gradiente eletroquímico gerado pela atividade da CFTR. Registre a diminuição da voltagem devida à atividade de FLX de iodeto mediada pela CFTR por pelo menos cinco minutos.

Em seguida, adicione três microlitros de uma solução de Triton X 100 a 10% à amostra para liberar o iodeto do lúmen do proteolipossomo como controle. A liberação significativa de iodeto indica que o iodeto aprisionado nas vesículas não era limitante para a atividade da CFTR. Após medir a amostra, prepare uma série de diluições de iodeto de potássio, de concentrações micromolares a nanomolares, no tampão nove.

Partindo da solução mais diluída, registre a resposta do eletrodo em milivolts em cada concentração de iodeto para gerar uma curva padrão. O CFTR do tipo selvagem foi ensaiado para iodeto. A atividade de fluxo de F foi medida em anomoles por segundo após a reconstituição.

O fluxo de íons iodeto é significativamente estimulado na presença de CFTR e ATP em comparação com o controle sem CFTR e pela adição de ATP. Quando o CFTR é fosforilado pela proteína quinase dependente de AMP cíclico, uma subunidade catalítica conhecida como PKA; inversamente, o pré-tratamento com o potente inibidor de CFTR, o inibidor CFTR-172, reduz a taxa de fluxo de iodeto. A capacidade do VX-770 de potencializar o fluxo de iodeto do CFTR selvagem foi testada na ausência e na presença de fosforilação por PKA. O VX-770 aumentou o fluxo relativo de iodeto apenas na presença de CFTR fosforilado. O efeito eficaz do VX-770 foi avaliado utilizando uma variante do CFTR chamada DeltaF508-CFTR, e o análogo inativo V091188 não potencializa a atividade do DeltaF508-CFTR fosforilado, enquanto o VX-770 aumenta o fluxo relativo de iodeto. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída, desde a purificação até as medições da atividade de CFTR, em um dia de trabalho típico de oito horas; a purificação do CFTR leva aproximadamente quatro horas e a reconstrução leva mais uma hora antes do início do ensaio eFlex.

Após este procedimento, outros métodos, incluindo um ensaio de T PS e a condução de um canal único para realizar uma medição na para lipídio S, podem ser realizados utilizando a mesma preparação da proteína CFDR para caracterizar ainda mais a interação com as moléculas pequenas. Utilizando esses métodos, um pesquisador de fibrose cística poderá responder perguntas fundamentais na área de moduladores do CFTR, nomeadamente, se o modulador interage diretamente com a proteína CFTR e qual é o mecanismo de ação desse modulador.