Name: Reconstituição funcional e atividade do canal Medidas de purificada tipo selvagem e mutante CFTR Protein (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Aprenda a reconstituir e medir a atividade do canal CFTR purificado em proteolipossomas para estudar a função iônica e os efeitos de moduladores moleculares na Fibrose Cística.

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

<ol><li>Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+mechanisms+underlying+CFTR+channel+activity%2C+the+molecular+basis+for+cystic+fibrosis+and+strategies+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+Biochem%22%5BJournal%5D)">Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy.</a> Essays Biochem. 50 (1), 233-248 (2011).</li>
<li>Bear, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+functional+reconstitution+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> Cell. 68 (4), 809-818 (1992).</li>
<li>Cai, Z., Sohma, Y., Bompadre, S. G., Sheppard, D. N., Hwang, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+high-resolution+single-channel+recording+to+functional+studies+of+cystic+fibrosis+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Application of high-resolution single-channel recording to functional studies of cystic fibrosis mutants.</a> Methods Mol Biol. 741, 419-441 (2011).</li>
<li>Genetic Analysis Consortium. , 
 <a target="_blank" href="http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/Home.html">http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/Home.html</a> (1989).</li>
<li>Kerem, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene%3A+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis.</a> Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+defective+anion+transport+in+L+cells+expressing+recombinant+forms+of+CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of defective anion transport in L cells expressing recombinant forms of CFTR.</a> Hum Mol Genet. 2 (8), 1253-1261 (1993).</li>
<li>Mendoza, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+efficient+correction+of+DeltaF508+CFTR+revealed+by+analyses+of+evolved+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Requirements for efficient correction of DeltaF508 CFTR revealed by analyses of evolved sequences.</a> Cell. 148 (1-2), 164-274 (2012).</li>
<li>Rabeh, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+both+NBD1+energetics+and+domain+interface+is+required+to+restore+DeltaF508+CFTR+folding+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Correction of both NBD1 energetics and domain interface is required to restore DeltaF508 CFTR folding and function.</a> Cell. 148 (1-2), 150-163 (2012).</li>
<li>Aleksandrov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+modulation+balances+thermodynamic+stability+and+restores+function+of+DeltaF508%5BTitle%5D)+AND+%22CFTR.+J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Allosteric modulation balances thermodynamic stability and restores function of DeltaF508.</a> CFTR. J Mol Biol. 419 (1-2), 41-60 (2012).</li>
<li>Ramsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CFTR+potentiator+in+patients+with+cystic+fibrosis+and+the+G551D+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation.</a> N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).</li>
<li>Riordan, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+recombinant+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+from+Chinese+hamster+ovary+and+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of recombinant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from Chinese hamster ovary and insect cells.</a> J. Biol. Chem. 270 (28), 17033-17043 (1995).</li>
<li>Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae.</a> JoVE. (61), (2012).</li>
<li>Ostedgaard, L. S., Welsh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Partial purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> J Biol Chem. 267 (36), 26142-26149 (1992).</li>
<li>Peng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+affinity+isolation+of+recombinant+protein+using+the+baculovirus%2Finsect+cell+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">One-step affinity isolation of recombinant protein using the baculovirus/insect cell expression system.</a> Protein Expr Purif. 4 (2), 95-100 (1993).</li>
<li>Ramjeesingh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+procedure+for+the+efficient+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> Biochem J. 327 (1), 17-21 (1997).</li>
<li>Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+crystallization+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> J Biol Chem. 279 (37), 39051-39057 (2004).</li>
<li>Ramjeesingh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+reconstitution+of+epithelial+chloride+channel+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Purification and reconstitution of epithelial chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Methods Enzymol. 294, 227-246 (1999).</li>
<li>Sorscher, E. J., Sommerfelt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+recombinant+protein+derived+from+the+baculovirus+expression+system+using+glutathione+affinity+agarose%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Purification of recombinant protein derived from the baculovirus expression system using glutathione affinity agarose.</a> Methods Mol Biol. 3, 337-348 (1995).</li>
<li>Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29+potentiator+VX-770+%28ivacaftor%29+opens+the+defective+channel+gate+of+mutant+CFTR+in+a+phosphorylation-dependent+but+ATP-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner.</a> J Biol Chem. 287 (44), 36639-36649 (2012).</li>
<li>Alkhouri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+properties+of+molecular+probes+for+the+rescue+site+on+mutant+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and properties of molecular probes for the rescue site on mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> J Med Chem. 54 (24), 8693-8701 (2011).</li>
<li>Eckford, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VX-809+and+Related+Corrector+Compounds+Exhibit+Secondary+Activity+Stabilizing+Active+F508del-CFTR+after+Its+Partial+Rescue+to+the+Cell+Surface%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">VX-809 and Related Corrector Compounds Exhibit Secondary Activity Stabilizing Active F508del-CFTR after Its Partial Rescue to the Cell Surface.</a> Chem Biol. 21 (5), 666-678 (2014).</li>
<li>Kim Chiaw, P., Wellhauser, L., Huan, L. J., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+corrector+modifies+the+channel+function+of+F508del-CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A chemical corrector modifies the channel function of F508del-CFTR.</a> Mol.Pharmacol. 78 (3), 411-418 (2010).</li>
<li>Verkman, A. S., Galietta, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+channels+as+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Chloride channels as drug targets.</a> Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 153-171 (2009).</li>
<li>Pasyk, S., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+interaction+of+a+small-molecule+modulator+with+G551D-CFTR%2C+a+cystic+fibrosis-causing+mutation+associated+with+severe+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Direct interaction of a small-molecule modulator with G551D-CFTR, a cystic fibrosis-causing mutation associated with severe disease.</a> Biochem J. 418 (1), 185-190 (2009).</li>
<li>Norez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+CFTR+chloride+channel+activity+and+pharmacology+using+radiotracer+flux+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Determination of CFTR chloride channel activity and pharmacology using radiotracer flux methods.</a> J Cyst Fibros. 3 (2), 119-121 (2004).</li>
<li>Whitney, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+alginate+secretion+across+the+bacterial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Structural basis for alginate secretion across the bacterial outer membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (32), 13083-13088 (2011).</li>
<li>Islam, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton-dependent+gating+and+proton+uptake+by+Wzx+support+O-antigen-subunit+antiport+across+the+bacterial+inner+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Proton-dependent gating and proton uptake by Wzx support O-antigen-subunit antiport across the bacterial inner membrane.</a> mBio. 4 (5), e00678-e00613 (2013).</li>
<li>Ramjeesingh, M., et al. Ch. 16. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRamjeesingh%2C+M+%22Reliable+Lab+Solutions%3A+Essential+Ion+Channel+MethodsReliable+Lab+Solutions%22">Reliable Lab Solutions: Essential Ion Channel MethodsReliable Lab Solutions</a>. Conn, P. M. , Academic Press. 337-357 (2010).</li>
<li>Wellhauser, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+modulator+interacts+directly+with+deltaPhe508-CFTR+to+modify+its+ATPase+activity+and+conformational+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability.</a> Mol Pharmacol. 75 (6), 1430-1438 (2009).</li>
<li>Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+reconstitution+of+purified+human+Hv1+H%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels.</a> J Mol Biol. 387 (5), 1055-1060 (2009).</li>
<li>Chang, X. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+A+%28PKA%29+still+activates+CFTR+chloride+channel+after+mutagenesis+of+all+10+PKA+consensus+phosphorylation+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein kinase A (PKA) still activates CFTR chloride channel after mutagenesis of all 10 PKA consensus phosphorylation sites.</a> J. Biol. Chem. 268 (15), 11304-11311 (1993).</li>
<li>Gadsby, D. C., Nairn, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+CFTR+Cl-+ion+channels+by+phosphorylation+and+dephosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.Second+Messenger+Phosphoprotein+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of CFTR Cl- ion channels by phosphorylation and dephosphorylation.</a> Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res. 33, 79-106 (1999).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATPase+activity+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> J Biol Chem. 271 (45), 28463-28468 (1996).</li>
<li>Ma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazolidinone+CFTR+inhibitor+identified+by+high-throughput+screening+blocks+cholera+toxin-induced+intestinal+fluid+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion.</a> J Clin Invest. 110 (11), 1651-1658 (2002).</li>
<li>Kopeikin, Z., Sohma, Y., Li, M., Hwang, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanism+of+CFTR+inhibition+by+a+thiazolidinone+derivative%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">On the mechanism of CFTR inhibition by a thiazolidinone derivative.</a> J Gen Physiol. 136 (6), 659-671 (2010).</li>
<li>Wang, X. F., Reddy, M. M., Quinton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+new+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+inhibitor+on+Cl-+conductance+in+human+sweat+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of a new cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibitor on Cl- conductance in human sweat ducts.</a> Exp Physiol. 89 (4), 417-425 (2004).</li>
</ol>

Os autores reconhecem o conselho do Dr. Mohabir Ramjeesingh durante o desenvolvimento dos métodos de purificação descritos aqui. Estes estudos foram apoiados por subvenções de funcionamento a CEB dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR) e fibrose cística Canadá (CFC). PDWE foi apoiado em parte pela Irmandade prêmios através do CIHR e CFC. Os autores reconhecem a prestação de corrector, potenciador e compostos inibidores de Dr. R. Pontes (Rosalind Universidade de Medicina e Ciência) e distribuição pelos Fundação de Fibrose Cística Therapeutics (CFFT). Os autores reconhecem também um excelente serviço pela facilidade de cultura celular Baylor (NIH concessão P30 CA125123) em expressar Wt e proteína CFTR mutante usando o sistema de baculovirus. O inativo VX-770 analógico, V-09-1188, foi um presente de Vertex Pharmaceuticals.

Houve um número limitado de protocolos de purificação de comprimento completo, o isolamento de CFTR funcional, a partir de uma variedade de sistemas de sobre-expressão celulares. O método descrito aqui é vantajosa, pois permite rápida purificação do WT-CFTR ou altamente enriquecido de F508del- e G551D-CFTR em quantidades moderadas, que é altamente funcional em ensaios, incluindo ATPase e medidas diretas de função de canal, incluindo medições de canal único em bicamada planar sistemas e medidas comprovados da função do c...

Transporte de cloreto através das membranas apicais das células epiteliais em tais tecidos como o pulmão, intestino, pâncreas e glândulas sudoríparas é mediado principalmente pela fibrose cística condutância transmembrana regulador (CFTR), um ATP e membro regulada por fosforilação do ABC (ATP Binding Cassete) C subfamília de proteínas de membrana (revisto em 1). Tal como outros membros da subfamília ABCC, CFTR é um multi-medindo proteína de membrana grande, integrante que se liga ao ATP dois locais de ligação de nucleótidos formadas na interface dos seus domínios de ligação a nucleótidos (NBDs), onde possui a actividade de ATPase modesta em uma única site. No entanto, ao contrário de outros membros da subfamília ABCC, CFTR evoluiu como um canal Cl regulamentado único e não como um transportador de soluto ativa. Mutações em causa CFTR a fibrose cística, uma doença que afeta vários órgãos, incluindo os pulmões, o trato gastrintestinal, pâncreas e trato reprodutivo, levando a morbidity e mortalidade em adultos jovens. Doença pulmonar normalmente representa mortalidade precoce em fibrose cística e, na maioria dos casos é causada pela perda de função de CFTR no epitélio superficial das vias aéreas condutoras. A falta de actividade do canal de cloreto CFTR, causa uma redução no ambos Cl - e o movimento da água através do epitélio da superfície de modificar a camada de fluido sobre a superfície apical do epitélio respiratório ciliado. Isso resulta em um líquido viscoso superfície das vias aéreas que prejudica a capacidade das células epiteliais respiratórias ciliadas para efetivamente patógenos limpar das vias aéreas. Como consequência, a maioria dos pacientes com FC sofrem de crises recorrentes de infecção pulmonar e lesão pulmonar devido à inflamação. Como esperado, os estudos do mecanismo de acção da proteína CFTR normal, focado primariamente em estudos electrofisiológicos detalhados da sua actividade de canal de propagação. Estudos de canal único mostraram diretamente que funções CFTR como PKA-dependente Cl- Canal que possui um portão regulamentado ATP 2. Estudos eletrofisiológicos detalhados fornecem uma grande quantidade de informações sobre os canais CFTR individuais 1,3, no entanto, pode haver preocupação quanto a saber se as características de qualquer canal único especial, que tem sido estudado é o reflexo de toda a população de canais CFTR e, portanto, o único canal resultados devem ser sempre considerados, juntamente com métodos para estudar a população macroscópica. Ensaio direta da atividade do canal população de CFTR purificado tem o potencial de fornecer informações sobre o defeito molecular associado com mutações causadoras de doenças e de conduzir a descoberta de moduladores químicos que reparo proteínas CFTR mutante. Até o momento, existem mais de 1.900 mutações diferentes em CFTR pensados ​​para causar fibrose cística 4. A mutação major, F508del-CFTR, encontrado em pelo menos um alelo em aproximadamente 90% dos pacientes na América do Norte e Europa conduz a uma proteína misfoldingnd retenção no retículo endoplasmático 5. F508del-CFTR também tem outras consequências, incluindo a atividade do canal com defeito 6-9. A ausência resultante de CFTR a partir da superfície da célula está associada a doença grave. G551D-CFTR, uma mutação menos comum, é pensado para ser ainda devidamente dobrada é disfuncional como um canal de cloro na superfície da célula 6. O desenvolvimento de pequenas moléculas e correctores de potenciadores tem o objectivo de corrigir dobragem e / ou o tráfico de mutantes tais como F508del-CFTR à superfície da célula, e de potenciação ou aumentando a actividade do canal de mutações tais como G551D quando presente na superfície da célula, respectivamente . Enquanto os corretores VX-809 e VX-661 (ainda não está aprovado para uso em pacientes, o potenciador Kalydeco (ivacaftor; VX-770) está sendo usado em 150 mg a cada 12 horas em pacientes com FC&gt; 6 anos com pelo menos um G551D -CFTR mutação, e, mais recentemente, para os pacientes com um dos G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255Pe G1349D. Kalydeco é seguro e resulta em melhoria das medidas clínicas da doença CF 10, no entanto, o mecanismo de ação desta pequena molécula foi mal compreendida no momento da aprovação do FDA para uso em pacientes. Um punhado de métodos de purificação de CFTR foram descritos anteriormente 2,11-18, muitos dos quais exigem um considerável período de tempo para completar. Numa publicação recente 19, um método único de purificação e rápida reconstituição foi descrito para CFTR superexpresso no sistema de expressão de S f 9 célula, e esta proteína purificada em sistemas lipidicos definidos foi utilizada para desenvolver um ensaio de actividade de canal de halogeneto de CFTR para uma população de CFTR moléculas. O ensaio recapitula os efeitos conhecidos da fosforilação, nucleotídeos e inibidores sobre a função CFTR. O sistema foi utilizado para interrogar os efeitos do potenciador VX-770 / Kalydeco em WT (tipo selvagem), F508del- e G551D-CFTR e foi mostrado para o primeirovez que o fármaco interage directamente com a proteína CFTR para potenciar a sua actividade de canal de uma forma independente de ATP, demonstrando a utilidade e aplicabilidade destes métodos para o estudo da interacção de CFTR e os mutantes com nucleótidos e pequenas moléculas a partir de uma perspectiva de população responder a perguntas clinicamente relevantes sobre a proteína. Os métodos também têm sido utilizados para estudar outras moléculas potenciador e seus derivados 20, bem como os efeitos de uma pequena molécula corrector sobre a actividade da proteína de 21. Os ensaios de efluxo de ter sido usado em muitos estudos anteriormente para investigar a actividade de mutantes CFTR e os efeitos dos compostos de CFTR-moduladores sobre a sua actividade, incluindo ensaios de células inteiras usando eléctrodos, marcadores radioactivos e fluoróforos 22,23, vesículas de membrana com eléctrodos selectivos de iões 24 e purificado CFTR reconstituído com traçadores radioativos 25. No entanto the utilização de eléctrodos selectivos de iões para estudar CFTR reconstituído purificado foi relatada pela primeira vez recentemente 19. Uma adaptação do método actual tem sido utilizada para a reconstituição e caracterização funcional de duas proteínas de membrana em Pseudomonas aeruginosa, um agente patogénico comum CF. Reconstituição de proteína de membrana purificado Alge exterior juntamente com medidas de efluxo iodeto foram utilizados para apoiar um modelo para a secreção de alginato aniônicos através deste transportador 26. A reconstituição e medições de efluxo de iodeto foram aplicados à proteína purificada Wzx, o que permitiu um modelo a ser proposto que sugere um mecanismo antiporte dependente de H + para o oligossacárido ligado a translocação-lípido através da membrana interna bacteriana por esta proteína de 27. Em ambos os casos foi utilizado o iodeto como um substituto para o substrato aniónico, embora em menor rendimento do que se poderia esperar de um substrato nativo. O método pode ser adequado para adaptação a outras proteínas com ctransporte ou condução ationic caminhos para substratos aniônicos. Aqui, um processo de purificação rápida é descrito para a proteína CFTR, e sua reconstituição em proteolipossomas de lipidico definido. O procedimento de reconstituição rápida pode ser facilmente adaptado para utilização com CFTR purificado por outros métodos, desde que o tipo de detergente utilizado na purificação é passível de remoção através dos métodos utilizados aqui ou podem ser trocados por um detergente adequado, antes do procedimento de reconstituição. O método de efluxo de iodeto para medição da actividade de canal de purificado e reconstituído proteína CFTR é descrito em pormenor e alguns resultados típicos, que podem ser obtidos com este método são apresentados.

<table><tbody><tr><td>fos-colina 14</td><td>detergente Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com)</td><td>F312</td><td>Affymetrix: Anatrace Products; CAS#&nbsp; :77733-28-9</td></tr><tr><td>comprimidos de cocktail de inibidores de protease sem EDTA completos</td><td>Roche (www.roche-applied-science.com)</td><td>04 693 132 001</td><td>comprimidos de cocktail de inibidores de protease sem EDTA (1 em 50 ml ou mini: 1 em 10 ml) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001)</td></tr><tr><td>cOmplete ULTRA Tablets, Mini, sem EDTA, EASYpack&nbsp;</td><td>Roche (www.roche-applied-science.com)</td><td>05 892 791 001</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose</td><td>Qaigen GmbH</td><td>1018240</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Colunas de triagem</td><td>Fisher Healthcare</td><td>11-387-50</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Filtros centrífugos, Ultracel-100K</td><td>Millipore (www.millipore.com)</td><td>UFC910008</td><td></td></tr><tr><td>Proteína quinase A dependente de cAMP (PKA), subunidade</td> <td>catalíticaNew England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit)</td><td></td> <td>Peirce PKA também é adequado</td></tr><tr><td>PC, Ovo de galinha</td><td>Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)</td> <td>840051C</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)</td> <td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>PS, Brain Suíno</td><td>Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)</td> <td>840032C</td><td>O CFTR foi reconstituído com sucesso em Egg PC, POPC, 2:1 (p/p) Ovo PC:POPC, ou uma mistura de PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (p/p)</td></tr><tr><td>PE, Ovo de Galinha</td><td>Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)</td><td>841118C</td><td></td></tr><tr><td>Ergosterol</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>45480</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Coluna de rotação de remoção de detergente</td><td>Thermo Scientific</td><td>87779</td><td>Colunas de capacidade de 1 ml</td></tr><tr><td>valinomicina</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>V-0627</td><td></td></tr><tr><td>VX-770 (ivacaftor)</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1144</td><td></td></tr><tr><td>microeletrodo seletivo de iodeto</td><td>Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam)</td><td>LIS-146ICM</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Software Clampex 8.1</td><td>Axon Instruments (www.axon.com)</td><td></td><td>usamos componentes do sistema ClampX com um filtro caseiro para monitorar e registrar a resposta ao nosso eletrodo</td></tr><tr><td>Software Alternativo: Sistema ArrowLabb&nbsp;</td><td>Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam)</td><td>LIS-146LICM-XS</td><td>A Lazar Research vende um medidor que pode interagir com um computador e software para registrar a resposta da sonda.&nbsp; Este software deve ter uma função semelhante à nossa configuração.</td></tr><tr><td>pequenas barras de agitação</td><td>Big Science Inc (www.stirbars.com)</td><td>SBM-0502-CMB</td><td>escolha uma barra de agitação pequena o suficiente para caber facilmente em um poço de uma placa de 96 poços</td></tr><tr><td>Sephadex G50, fina</td><td>GE Health Care (www.gelifesciences.com)</td><td>17-0042-01</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Laboratory Supplies Co, Inc.</td><td>G112SP1G</td><td>Sonicadores de banho de outros fabricantes também devem ser adequados</td></tr></tbody></table>

reconstituição funcional e atividade do canal medidas de purificada tipo selvagem e mutante cftr protein

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

A fibrose cística condutância transmembrana regulador (CFTR) é um membro de formação de canal único da ATP Binding Cassette (ABC) superfamília de transportadores. A atividade do canal fosforilação e nucleotídeos cloreto dependente de CFTR foi freqüentemente estudada em sistemas de células inteiras e como canais de solteiro em pedaços de membrana extirpado. Muitas mutações causadoras de fibrose cística têm sido mostrados para alterar esta actividade. Embora um pequeno número de protocolos de purificação foram publicados, um método de reconstituição rápida, que retém a actividade de canal e de um método adequado para o estudo da actividade do canal de população num sistema purificado têm faltado. Métodos aqui descritos são rápidos para a purificação e a reconstituição funcional da proteína CFTR de comprimento completo em proteolipossomas de composição lipidico definido que retém a actividade como um canal de halogeneto regulamentado. Este método de reconstituição em conjunto com um ensaio baseado em fluxo romance de actividade de canal é um sistema adequado paraestudando as propriedades do canal população do tipo CFTR selvagem e os causadores de doenças mutantes F508del- e G551D-CFTR. Especificamente, o método tem utilidade em estudar os efeitos directos da fosforilação, os nucleótidos e as moléculas pequenas, tais como potenciadores e inibidores sobre a actividade do canal CFTR. Os métodos também são passíveis ao estudo de outros canais de membrana / transportadores para substratos aniónicos.

Descritos nesta publicação escrita são métodos para purificar, reconstituir e medir a atividade do canal regulamentado da proteína CFTR. Figura 1a mostra o fluxo de trabalho para a purificação, a reconstituição e procedimentos de efluxo de iodeto. Os métodos para a reconstituição e por medições de actividade do canal de fluxo iodeto também são mostrados em maior detalhe no vídeo associado. Purificação e reconstituição do CFTR em proteoliposomes C...

Descrito aqui é um procedimento rápido e eficaz para a reconstituição funcional da purificado do tipo selvagem e proteína CFTR mutante que preserva a atividade para este canal de cloro, que está com defeito na Fibrose Cística. Efluxo de iodeto de proteoliposomes reconstituídos mediadas por CFTR permite estudos da atividade do canal e os efeitos de pequenas moléculas.

Reconstituição funcional e atividade do canal Medidas de purificada tipo selvagem e mutante CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

O objetivo geral deste procedimento é medir a função de uma população de canais CFTR em um sistema reconstituído e examinar a resposta desses canais à presença de moléculas moduladoras. Isso é realizado primeiramente purificando a proteína CFTR selvagem ou mutante de células SF nine por meio de um procedimento rápido de purificação, que fornece proteína CFTR funcional em solução com detergente. O segundo passo consiste em reconstituir a proteína purificada em proteolipossomos de lipídio definido, escolhido pelo pesquisador.Em seguida, um gradiente químico de iodeto é estabelecido através da membrana pela remoção do iodeto lipossomal em excesso, gerando uma força motriz para o movimento iônico através do canal CFTR. O passo final consiste em ativar o canal e iniciar a liberação de iodeto dos lipossomos proteicos na presença da molécula moduladora de interesse. Em última instância, um eletrodo seletivo para iodeto é utilizado para monitorar, em tempo real, a função do canal CFTR neste sistema reconstituído.Este método permite o estudo da atividade do canal de cloreto de uma população purificada de moléculas de CFTR após a reconstrução em lipossomos de fosfolipídios. Embora este métod

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Biology

Biologia

Vamos demonstrar como estudar o efeito de uma única mutação de ponto na função de um canal iônico.

Mutagênese e Análise Funcional de canais iônicos Heterologously Expresso em células de mamíferos

Tentativas para expressam a fibrose cística reguladora da condutância transmembrana (CFTR)...

Expressão e purificação do Fibrose Cística proteína transmembranar regulador da condutância na Saccharomyces cerevisiae

A fibrose cística regulador da condutância transmembranar (CFTR), um canal de cloreto epitelial, tem sido relatado para interagir com várias proteínas e regulam importantes processos celulares, entre eles os CFTR PDZ motivo mediadas-interacções têm sido bem documentados. Este protocolo descreve métodos desenvolvidos para montar um macromolecular CFTR PDZ-dependente sinalização...

Análise in vitro de PDZ-dependentes Complexos Macromoleculares CFTR Sinalização

Procedimentos para a reconstituição completa da voltagem dependentes do canal de potássio protótipo em membranas lipídicas são descritos. Os canais reconstituídos são adequados para ensaios bioquímicos, gravações elétricas, triagem ligante e estudos de cristalografia de elétrons. Esses métodos podem ter aplicações gerais para os estudos estruturais e funcionais de outras proteínas de membrana.

Reconstituição de um canal de Kv para membranas lipídicas de Estudos estruturais e funcionais

A expressão heteróloga e purificação da fibrose cística reguladora da condutância transmembrana (CFTR) são desafios significativos e fatores limitantes para o desenvolvimento de drogas terapêuticas para a fibrose cística. Este protocolo descreve dois métodos para o isolamento de quantidades de miligrama de CFTR adequados para estudos funcionais e estruturais.

Purificação da fibrose cística condutância transmembrana Regulador proteína expressa em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

arritmias cardíacas hereditárias são geralmente causadas por mutações que alteram a entrega de superfície de um ou mais canais de íons. Aqui, nós adaptar ensaios de citometria de fluxo para proporcionar uma quantificação da expressão de proteína total e a superfície celular relativa dos canais de iões recombinantes expressas em células TSA-201.

Determinação da superfície celular Relativa e Expressão total de canais recombinante de iões utilizando Citometria de Fluxo

Este artigo descreve métodos específicos para obter quantidades bioquímicas de detergente-solubilizado TRPV1 para análises espectroscópicas. Os protocolos combinados fornecem ferramentas bioquímicas e biofísicas que podem ser adaptadas para facilitar estudos estruturais e funcionais para os canais de íon mamíferos em um ambiente controlado por membrana.

Purificação e reconstituição de TRPV1 para análise espectroscópica

Este protocolo apresenta um método para medir a ligação de adenina nucleotídica a receptores em tempo real em ambiente celular. A ligação é medida como transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) entre derivados de nucleotídeos trinitrofenila e proteínas marcadas com um aminoácido fluorescente não canônico.

Medindo a ligação de nucleotídeos a proteínas de membrana intactas e funcionais em tempo real

Este protocolo descreve um método para o estudo de proteínas de membrana eletrogênicas através da medição de mudanças no potencial de membrana. Este ensaio fornece uma plataforma para a leitura funcional de múltiplos canais iônicos expressos endogenamente em linhagens celulares epiteliais.

Ensaio de Potencial de Membrana Baseado em Fluorescência para Estudo Funcional de Alto Rendimento de Dois Canais Iônicos Endógenos em Duas Linhagens Celulares Epiteliais

A fluorometria sítio-dirigida funcional é um método para estudar movimentos do domínio de proteínas em tempo real. A modificação desta técnica para sua aplicação em células nativas agora permite a detecção e rastreamento de movimentos de sensores de voltagem únicos a partir de canais de Ca2+ dependentes de voltagem em fibras musculares esqueléticas isoladas de murino.

Fluorometria Sítio-Dirigida Funcional em Células Nativas para Estudo da Excitabilidade do Músculo Esquelético

A eletrofisiologia é o padrão-ouro para investigar a atividade do canal iônico. No entanto, existem muitas abordagens alternativas, incluindo métodos ópticos. Aqui, descrevemos um método para monitorar a atividade da repetição rica em leucina contendo canais de ânions formados por 8 canais (LRRC8) usando um método baseado em transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) entre subunidades.

Monitoramento da atividade de 8 canais (LRRC8/VRAC) de repetição rica em leucina usando transferência de energia de ressonância de Förster de emissão sensibilizada (SE-FRET)

Aprenda a reconstituir e medir a atividade do canal CFTR purificado em proteolipossomas para estudar a função iônica e os efeitos de moduladores moleculares na Fibrose Cística.

Reconstituição funcional e atividade do canal Medidas de purificada tipo selvagem e mutante CFTR Protein

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