Preparação de uma única célula suspensões para Análise de citometria de fluxo de diferentes regiões da pele do rato

O objetivo geral deste procedimento é preparar uma suspensão de célula única da pele do camundongo para identificar as diferentes populações de células imunes residentes por meio de análise citofluorimétrica. para identificar e isolar as diferentes populações de células imunes residentes na pele. Usando essa técnica, os pesquisadores podem digerir facilmente as amostras de diferentes regiões da pele do camundongo sem danificar as células imunes de interesse.

Para obter amostras de pele da orelha do camundongo, corte as partes sem pelos das orelhas e use uma pinça para separar os lados dorsal e ventral dos órgãos. Em seguida, raspe suavemente o ouvido interno para remover qualquer cartilagem restante. Para obter amostras de pele em pedaços, raspe todo o cabelo do animal com uma tesoura, seguido da aplicação de loção depilatória.

Depois de alguns minutos, limpe a loção e faça um corte vertical no meio das costas do mouse, continuando a incisão ao longo das bordas das áreas raspadas ao redor do corpo do mouse. Usando uma pinça para manter a pele no lugar enquanto separa a amostra com as pontas fechadas e arredondadas de uma tesoura cirúrgica ou bisturi, separe suavemente a pele do peritônio e dos músculos das costas. Em seguida, mergulhe a pele em uma placa de cultura de células de 100 mm contendo 10 ml de PBS gelado e use uma pinça para raspar a gordura subcutânea.

Para obter uma amostra de pele da cauda, corte a cauda e use uma tesoura cirúrgica para fazer um corte vertical começando da base da cauda até a ponta. Usando uma pinça, segure a borda da incisão na base da cauda e, em seguida, segurando o corpo da cauda com outro par de pinças, puxe suavemente a pele em direção à ponta. Remova qualquer excesso de gordura raspando suavemente a amostra de pele.

O pé do rato é cortado e, em seguida, para obter uma amostra de pele da almofada do pé, use uma tesoura cirúrgica para cortar a pele do pé longitudinalmente do tornozelo até o início dos dedos, tomando cuidado para evitar cortar qualquer cabelo. Em seguida, segure os ossos do tornozelo com uma pinça enquanto agarra a pele com a outra e puxe a pele em direção aos dedos como ao remover uma luva. Para rotular as células da pele, para cada amostra, transfira o tecido para uma placa de Petri de 35 milímetros contendo 2 mililitros de coquetel de digestão recém-preparado.

Usando uma tesoura, corte a amostra em pedaços pequenos e incube os fragmentos de tecido a 37 graus Celsius por 90 minutos com uma a duas agitações suaves durante o período de incubação. Em seguida, despeje o tecido da pele digerido em uma peneira de células de 70 mícrons em uma placa de Petri de 66 milímetros contendo 1 mililitro de RPMI 1640 suplementado com FBS por prato. Lave o filtro com cinco mililitros de meio fresco e, em seguida, use um êmbolo de seringa para espremer as amostras através da malha do filtro.

Enxágue o êmbolo, o prato e a peneira com 20 mililitros de meio fresco e transfira a pasta de tecido para um tubo cônico de 50 mililitros. Depois que todas as amostras tiverem sido processadas, centrifugue as células e ressuspenda os pellets em 100 microlitros por amostra de dois microgramas por mililitro de anticorpo bloqueador de CD16 CD32 em PBS mais 1% FBS. Após 15 minutos a quatro graus Celsius, adicione 100 microlitros de anticorpos, conforme indicado na tabela, às amostras apropriadas por 30 minutos a quatro graus Celsius protegidos da luz.

No final da incubação, lave as células em um mililitro de PBS mais FBS e ressuspenda os pellets em 300 microlitros de FBS PBS. Em seguida, rotule as células com 2 microgramas por mililitro de DAPI por 10 minutos a quatro graus Celsius protegidos da luz. Para isolar os leucócitos, primeiro bloqueie a população positiva para DAPI para eliminar as células mortas.

Em seguida, selecione os singlets em uma área de dispersão direta por gráfico de largura de dispersão direta e bloqueie as células com base no tamanho e granularidade dos leucócitos de interesse. Em seguida, selecione as células CD45 positivas e, em seguida, para cada amostra, identifique as populações de células dendríticas da pele por sua expressão de CD11C e MHC classe dois. Identifique os macrófagos por sua expressão de CD64 e F480, as células B por sua expressão de CD19 e MHC classe dois e as células T pela expressão de CD4 ou CD8.

O isolamento das células imunes da pele, como acabamos de demonstrar, produz uma população de mais de 50% das células viáveis de todas as regiões da pele, entre 5.000 e 15.000 por centímetro quadrado, das quais são CD45 positivas. Um número suficiente de células dendríticas, macrófagos, células B e células T também pode ser obtido para análise a jusante de um centímetro quadrado de pele de camundongo, conforme indicado. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como digerir um tecido cutâneo não inflamado e isolar os leucócitos para análise por fax.