Name: Preparação de uma única célula suspensões para Análise de citometria de fluxo de diferentes regiões da pele do rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Aprenda a preparar suspensões de células únicas da pele de camundongo para citometria de fluxo. Este método preserva marcadores de superfície imunológicos e permite identificar populações de leucócitos residentes em diferentes regiões da pele.

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Este trabalho foi apoiado por doações da Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, IG14593, MFAG13235), da Fondazione Cariplo (Grant 2010-0678 e NANOVAC) e da Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica.

Estudo aprovação: Os protocolos experimentais foram aprovados pelo Ministério da Saúde italiano (Roma, Itália) de acordo com o Decreto legislativo 27 gennaio 1992, n. 116 &quot;della Direttiva Attuazione n. 86/609 / CEE, em materia di Protezione degli animali utilizzati um fini Sperimentali o ad altri fini scientifici.&quot; 1. A obtenção de amostras de pele <ol><li> Euthanize o mouse por deslocamento cervical. </li><li> Orelha: <ol><li> Cortar a parte sem pêlos das orelhas do rato. </li><li> dorsal separada e lado ventral por separá-las com uma pinça. Remova qualquer cartilagens restantes raspando suavemente a parte interna das orelhas com uma pinça. </li></ol></li><li> pele do tronco: <ol><li> Raspar toda a pele do animal, tanto com um barbeador elétrico e com loção depilatória delicado. </li><li> Cortar a amostra de pele desejado (de 2 cm2 até a pele do animal inteiro). <ol><li> Se cortando todo o dorsal e venpele do rato tral, fazer um corte vertical no meio do mouse para trás e, em seguida, corte ao longo das fronteiras das áreas raspadas ao redor do corpo do rato. </li><li> Suavemente separar a pele a partir do peritoneu e os músculos das costas, mantendo a amostra de pele ainda com a pinça enquanto separa a amostra de pele, com as pontas afiadas redonda fechada de uma tesoura cirúrgica ou bisturi. </li></ol></li><li> Prepara-se uma placa de cultura de células de 100 milímetros contendo 10 ml de PBS gelado. </li><li> Eliminar a gordura subcutânea por submersão da amostra de pele em PBS na placa preparado no passo 1.3.3 e raspagem da amostra de pele com fórceps. </li></ol></li><li> Rabo: <ol><li> Cortar a cauda do rato. </li><li> Fazer um corte vertical na cauda, ​​com uma tesoura cirúrgica ou bisturi cirúrgico, a partir da base da cauda e atingindo até a ponta da cauda. </li><li> Use uma pinça para separar a pele da cauda. Agarrar a borda do corte na base da cauda e puxe na direcção da ponta, mantendo ocorpo da cauda com uma pinça. </li><li> Remova qualquer excesso de gordura suavemente raspando a amostra de pele. </li></ol></li><li> salteador <ol><li> Cortar o pé inteiro do rato com uma tesoura cirúrgica. Evitando cortar qualquer pele aveludada. </li><li> Cortar a pele do pé longitudinalmente desde o tornozelo até o início dos dígitos. </li><li> Manter os ossos do tornozelo com uma pinça ou com a mão enquanto agarrando a pele com uma pinça e puxar a pele para os dígitos como se tirar uma luva. </li></ol></li></ol> 2. Digestão <ol><li> Prepare o coquetel de digestão da solução-mãe (preparado como no Lista de Materiais) com a seguinte receita: mistura de enzimas (ver Lista de Materiais para as especificações) 300 ug / ml, DNAse1 50 U / ml. Dilui-se em meio RPMI 5% de FBS. </li><li> Pique amostras de pele com uma tesoura em pequenos pedaços num prato de Petri com 35 milímetros 2 ml de cocktail de digestão (para a pele do tronco: 2 ml de mistura de digestão a cada 2 cm2 de pele, até 3 mL no total). </li><li>Incubar a 37 ° C durante 90 min. Agitar suavemente a placa de Petri 1-2 vezes durante a incubação. </li><li> Pour amostras de pele digeridas sobre um filtro de 70 | iM de células em 66 milímetros placa de Petri contendo 1 ml de RPMI 1640, FBS a 5%. </li><li> Lavar o filtro com 5 ml de meio RPMI 1640 FBS a 5%. </li><li> Espremer a amostra através do filtro de células com um êmbolo da seringa. </li><li> êmbolo flush, placa de Petri e filtro com 20 ml de RPMI1640 5% FBS, transferir para tubo de 50 ml. </li></ol> 3. Os anticorpos e rotulagem <ol><li> Lava-se a suspensão obtida duas vezes com 5 ml de PBS, 1% de FBS (ou BSA). </li><li> Rotular a suspensão de células obtida com os anticorpos desejados. <ol><li> Ressuspender as amostras em 100 ul / amostra de uma mistura contendo 2 ug / mL de aCD16 / CD32 (clone 2.4G2) diluída em PBS 1% de FBS. </li><li> Incubar durante 15 min a 4 ° C, a fim de bloquear a ligação não específica dos anticorpos desejados, via receptores de Fc. </li><li> Adicionar os anticorpos indicados na Tabela1. <ol><li> Prepara-se uma mistura diluir os anticorpos desejados em 100 ul / amostra de PBS a 1% de FBS, para uma concentração de 4 ug / ml. </li><li> Adicionar 100 ul da mistura preparada no passo 3.2.3.1 para cada amostra de modo a que no tubo, haverá um volume de 200 ul de mistura de anticorpo a uma concentração final de 2 ug / ml. </li></ol></li><li> Incubar durante 30 min a 4 ° C e cobrir de luz. </li></ol></li><li> Lava-se com 1 ml de PBS, 1% de FBS, centrifugar durante 5 minutos a 400 xg, descartar o sobrenadante e ressuspender em 300 ul de PBS, 1% de FBS. </li><li> Adicionar DAPI a uma concentração final de 2 ug / ml e incubar a 4 ° C, protegida da luz durante 10 min. </li><li> Analisar as amostras obtidas por FACS. <ol><li> Para isolar leucócitos, use a seguinte estratégia gating: <ol><li> Primeiro eliminar as células mortas por gating sobre a população DAPI-. </li><li> Seleccione interiores do FSC-A vs. FSC W, como indicado na Figura 1 </strong&gt;. </li><li> Portão as células com base no tamanho e granularidade típico dos leucócitos de interesse. </li><li> Escolha CD45 + células no FSC-A trama CD45 conforme indicado na Figura 1. </li></ol></li><li> Distinguir as diferentes populações de leucócitos através da expressão de marcadores de superfície como se segue: <ol><li> Identificar DCs como CD11c + II + células MHC. Estes podem ser depois analisados ​​para a expressão de CD207 para distinguir as células de Langerhans e CD207 + Dérmico DCs de CD207- Dérmico DCs. </li><li> Identificar Macrófagos como CD64 + / 80 + F4 células. </li><li> Identificar as células B como as células CD19 + + MHCII. </li><li> Identificar células T CD8 como + ou células CD4 +. </li></ol></li></ol></li></ol>

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<li>Rosenblum, M. D., Truong, H. A., Abbas, A. K., Gratz, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((177%3A+Maintenance+of+memory+regulatory+T+cells+in+peripheral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">177: Maintenance of memory regulatory T cells in peripheral tissues.</a> Cytokine. 63 (3), 284-285 (2013).</li>
<li>Kim, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TSLP+elicits+IL-33-independent+innate+lymphoid+cell+responses+to+promote+skin+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">TSLP elicits IL-33-independent innate lymphoid cell responses to promote skin inflammation.</a> Science translational medicine. 5 (170), (2013).</li>
<li>Gopinathan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+skin+structure%3A+scratching+the+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+drug+delivery+reviews%22%5BJournal%5D)">New insights into skin structure: scratching the surface.</a> Advanced drug delivery reviews. 54 (Suppl 1), S3-S17 (2002).</li>
<li>Sandrine, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD207%2B+CD103%2B+dermal+dendritic+cells+cross-present+keratinocyte-derived+antigens+irrespective+of+the+presence+of+Langerhans+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207 (1), 189-206 (2010).</li>
<li>Bernard, M., Samira, T., Sandrine, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+and+functions+of+dendritic+cells+and+macrophages+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The origins and functions of dendritic cells and macrophages in the skin.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (6), 417-428 (2014).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Descrevemos um método para a preparação de suspensões unicelulares a partir de regiões diferentes da pele do rato. O método de digestão adoptámos, não só dá rendimentos elevados mas também preserva a expressão de marcadores de superfície, que é fundamental para a análise de FACS subsequente. A utilização de uma mistura de colagenase I e II e termolisina, garante lote mínimo de diferenças de lote na actividade da enzima, tornando este método altamente reprodutível. Outros métodos publicados d...

A pele é um dos maiores órgãos do corpo e sua grande superfície está continuamente exposta ao ambiente externo. Portanto, a pele deve proteger o organismo de ameaças potenciais para manter a homeostase, tanto por meios físicos quanto por fornecer proteção ativa contra a entrada potencial de patógenos. De maneira semelhante à mucosa intestinal e pulmonar, a pele abriga uma variedade de células imunes que interagem continuamente com o epitélio para manter a vigilância imunológica. Esse sistema complexo que envolve células imunes e não imunes da pele é reconhecido desde os primórdios da imunologia, quando em 1978 o termo "tecido linfóide associado à pele" (SALT) 1 foi cunhado pela primeira vez para descrever essa complexidade. 
O grande número de células imunes que residem na pele ajuda o organismo não apenas a combater possíveis invasões, mas também a orquestrar a cicatrização de feridas e a manter a tolerância aos autoantígenos e à microbiota da pele 2,3. 
Entre as células imunes residentes na pele, as células dendríticas (DCs) têm um papel crucial na formação das respostas imunes e na manutenção da homeostase 4. DCs dérmicas e células de Langerhans respondem prontamente a invasões de patógenos e, após a migração para os linfonodos, ativam as células T e induzem a expressão de receptores de homing da pele nas células T efetoras recém-geradas 5. As DCs também têm um papel fundamental na regulação da homeostase da pele. As DCs que migram da derme para os linfonodos em condições homeostáticas transportam antígenos sequestrados pela pele com o objetivo de induzir a tolerância das células T, principalmente por meio da diferenciação de células T reguladoras (Tregs) específicas para antígenos cutâneos 6-8. 
T as células representam a população mais abundante de células imunes na pele. Eles não apenas se infiltram na pele durante uma infecção, mas também representam uma população estável entre os linfócitos residentes na pele 9,10. As células T de memória residente CD8+ e CD4+ (rm)T residem na pele e, após uma infecção, podem responder muito antes de as células T efetoras serem recrutadas do sangue. Na pele, também reside uma população de Tregs residentes no tecido capazes de manter a tolerância aos antígenos cutâneos e à homeostase tecidual. Essas células são ativadas de forma rápida e potente após a exposição ao seu antígeno cognato e, portanto, foram definidas como Tregs de memória 11,12. 
Juntamente com DCs e células T, muitas células imunes inatas, como células NK, células T gama delta, ILCs 13 do grupo 2, mastócitos e macrófagos, povoam a pele e contribuem para a proteção do hospedeiro. Para analisar um ambiente tão complexo, é obrigatório obter suspensões unicelulares de espécimes de pele com alta eficiência, preservando ao mesmo tempo a expressão de marcadores de superfície para análise citofluorimétrica de fluxo ou classificação. 
A pele murina apresenta uma camada epidérmica externa, constituída principalmente por queratinócitos, células de Langerhans e células T epidérmicas dendríticas; e a camada dérmica abaixo. A derme abriga a maioria das células imunes e é formada por uma matriz extracelular na qual as fibras colágenas são as mais abundantes, especialmente o colágeno-I e o colágeno-IV. Ao contrário da pele humana, a pele do camundongo é coberta de pelos e, portanto, mais povoada por folículos pilosos. É, também, muito mais fino que a pele humana e contém uma camada muscular, o panículo carnoso, que ajuda na cicatrização de feridas 14. Essas características tornam mais difícil interromper com eficiência a rede de colágeno da derme, a fim de retirar as células imunológicas.
Neste artigo, fornecemos um método adequado para digerir a matriz extracelular que depende de um coquetel de colagenase 1 e 2 de alta pureza e termolisina. Além disso, como a análise da pele de diferentes regiões requer diferentes procedimentos experimentais, mostraremos diferentes métodos para obter com eficiência amostras de pele do coxim das patas, cauda, orelha e tronco. Em seguida, rotularemos as amostras para avaliar a presença de DCs (MHCII+CD11c+CD45+), macrófagos (CD11b+F4/80+CD45+), células T CD8+ e CD4+.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Supplemented RPMI 1640 medium&nbsp;</td><td></td><td></td><td>RPMI1640 suplementado com L-glu, pen-strep sem beta mercapto etanol</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM (Enzyme Mix)</td><td>Roche</td><td>5401119001</td><td>ressuspender [2.5&nbsp; mg/ml] em dH2O; Armazene alíquotas em -20&nbsp; &deg; C</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>D4263-1VL</td><td>ressuspende em RPMI 1640 sem soro [1,000&nbsp; U/ml]</td></tr><tr><td colspan="4">Materiais</td></tr>Tesoura Cirúrgica <tr><td>Fórceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Cirúrgica Bisturi Cirúrgico</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm Placas</td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>Petri 66 mm Placas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr>de Petri 100 mm<td>70 &micro; m Cell Strainers</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td><forte>Coquetel de digestão</forte></td><td></td><td></td><td>Diluído em RPMI 5% FBS</td></tr><tr><td>LIberase TM</td><td></td><td></td><td>300 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>DNAse1</td><td></td><td></td><td>50 U/ml</td></tr><tr><td colspan="4">Anticorpos</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Clone</td><td>Rótulo</td></tr><tr><td>aCD45.2</td><td></td><td>104</td><td>PE-Cy5.5</td></tr><tr><td>aCD11c</td><td></td><td>N418</td><td>PE-Cy7</td></tr><tr><td>CD11b</td><td></td><td>M1/70</td><td>FITC</td></tr><tr><td>F4/80</td><td></td><td>A 3-1</td><td>APC-Cy7</td></tr><tr><td>aCD4</td><td></td><td>Gk1.5</td><td>APC-Cy7</td></tr><tr><td>aCD8</td><td></td><td>53-6.7</td><td>PE</td></tr><tr><td>aCD64</td><td></td><td>X54-5/7.1</td><td>PE-Cy7</td></tr><tr><td>aCD207</td><td></td><td>4C7</td><td>APC</td></tr></tbody></table>

preparação de uma única célula suspensões para análise de citometria de fluxo de diferentes regiões da pele do rato

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

A pele é um órgão de barreira que interage com o ambiente externo. Sendo continuamente expostas a potenciais invasões microbianas, a derme e a epiderme abrigam uma variedade de células imunes em condições homeostáticas e inflamatórias. Ferramentas para obter liberação de células da pele para análises citofluorimétricas são, portanto, muito úteis para estudar a complexa rede de células imunes que residem na pele e sua resposta a estímulos microbianos. Aqui, descrevemos uma metodologia eficiente para a digestão da pele de camundongos para obter suspensões unicelulares de forma rápida e eficiente. Este protocolo permite a manutenção da viabilidade celular máxima sem comprometer a expressão do antígeno de superfície. Também descrevemos como coletar e digerir amostras de pele de diferentes locais anatômicos, como orelha, tronco, cauda e pata. As suspensões obtidas são então coradas e analisadas por citometria de fluxo para discriminar entre diferentes populações de leucócitos.

A pele a partir de diferentes regiões do corpo foi digerida de acordo com o protocolo descrito e corados com os anticorpos indicados. A estratégia de propagação está representado na Figura 1. Em primeiro lugar seleccionar células vivas (células DAPI-), em seguida, no portão singuletos (FSC-A versus FSC-W) e em células com a morfologia de linfócitos (FSC vs SSC-A-A). Quando indicado, as células CD45 + de origem hematopoiética são selecionados. <p class="jov...

A pele abriga uma complexa rede de células imunológicas. Descrevemos uma metodologia eficiente para a digestão da pele de camundongos, de diferentes partes do corpo do animal, a fim de obter uma suspensão unicelular e analisar as diferentes populações de leucócitos residentes na pele por citometria de fluxo.

Preparação de uma única célula suspensões para Análise de citometria de fluxo de diferentes regiões da pele do rato

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

O objetivo geral deste procedimento é preparar uma suspensão de células únicas a partir da pele de camundongo para identificar as diferentes populações de células imunes residentes por meio de análise citofluorimétrica, a fim de identificar e isolar as distintas populações de células imunes residentes na pele. Utilizando esta técnica, os pesquisadores podem facilmente digerir amostras de diferentes regiões da pele de camundongo sem danificar os marcadores de superfície das células imunes de interesse.Para obter amostras de pele da orelha do camundongo, corte as partes despilhadas das orelhas e use pin&ccedil;as para separar os lados dorsal e ventral dos &oacute;rg&atilde;os. Em seguida, raspe suavemente a orelha interna para remover qualquer cartilagem remanescente. Para obter amostras de pele em peda&ccedil;os, rape todos os pelos do animal com uma tesoura el&eacute;trica, seguido pela aplica&ccedil;&atilde;o de lo&ccedil;&atilde;o depilat&oacute;ria.Após alguns minutos, remova o creme e faça um corte vertical no meio das costas do camundongo, continuando a incisão ao longo das bordas das áreas depiladas ao redor do corpo do animal. Usando pinça para segurar a pele no lugar, separe delicadamente a pele do peritônio e dos músculos das costas com as pontas fechadas e arredondadas de uma tesoura cirúrgica ou com um bisturi. Em seguida, mergulhe a pele em uma placa de cultura celular de 100 mm contendo 10 ml de PBS gelado e use a pinça para remover a gordura subcutânea.Para obter uma amostra de pele da cauda, corte a cauda e use uma tesoura cirúrgica para fazer um corte vertical começando pela base da cauda até a ponta. Usando pinças, segure a borda da incisão na base da cauda; em seguida, segurando o corpo da cauda com outro par de pinças, puxe suavemente a pele em direção à ponta. Remova qualquer excesso de gordura raspando suavemente a amostra de pele.O pé do camundongo é cortado, e então, para obter uma amostra de pele da almofada do pé, use uma tesoura cirúrgica para cortar a pele do pé longitudinalmente do tornozelo até o início dos dígitos, tomando cuidado para evitar cortar qualquer pêlo. Em seguida, segure os ossos do tornozelo com uma pinça enquanto segura a pele com a outra mão e puxe a pele em direção aos dígitos, como ao retirar uma luva. Para marcar as células da pele, transfira o tecido, para cada amostra sequencialmente, para uma placa de Petri de 35 milímetros contendo 2 mililitros de coquetel de digestão recém-preparado.Com o auxílio de tesoura, pique a amostra em pequenos pedaços e incube os fragmentos de tecido a 37 graus Celsius por 90 minutos, com um a dois movimentos suaves durante o período de incubação. Em seguida, despeje o tecido cutâneo digerido sobre um filtro celular de 70 mícrons em uma placa de Petri de 66 milímetros contendo 1 mililitro de RPMI 1640 suplementado com soro bovino fetal por placa. Lave o filtro com cinco mililitros de meio fresco e, então, use o êmbolo de uma seringa para forçar as amostras através da malha do filtro.Lave o êmbolo, a placa e o funil com 20 mililitros de meio fresco e transfira a suspensão tecidual para um tubo cônico de 50 mililitros. Após processar todas as amostras, centrifugue as células e re-suspenda os pellets em 100 microlitros por amostra de anticorpo bloqueador anti-CD16/CD32 a 2 microgramas por mililitro em PBS mais 1% de FBS. Após 15 minutos a quatro graus Celsius, adicione 100 microlitros do anticorpo conforme indicado na tabela às amostras apropriadas, durante 30 minutos a quatro graus Celsius, protegidas da luz.No final da incubação, lave as células em um mililitro de PBS mais FBS e re-suspenda os pellets em 300 microlitros de PBS com FBS. Em seguida, marque as células com 2 microgramas por mililitro de DAPI durante 10 minutos a quatro graus Celsius, protegido da luz. Para isolar os leucócitos, primeiro selecione a população positiva para DAPI para eliminar as células mortas.Em seguida, selecione os singletes em um gráfico de área de dispersão para a frente por largura de dispersão para a frente e delimite as células com base no tamanho e na granularidade dos leucócitos de interesse. A seguir, selecione as células positivas para CD45 e, para cada amostra, identifique as populações de células dendríticas da pele pela expressão de CD11C e da classe II do MHC. Identifique os macrófagos pela expressão de CD64 e F480, as células B pela expressão de CD19 e da classe II do MHC e as células T pela expressão de CD4 ou CD8.O isolamento de células imunes da pele, conforme acabou de ser demonstrado, produz uma população com mais de 50% de células viáveis de todas as regiões da pele, entre 5.000 e 15.000 por centímetro quadrado, das quais são positivas para CD45. Um número suficiente de células dendríticas, macrófagos, células B e células T também pode ser obtido para análises posteriores a partir de um centímetro quadrado de pele de camundongo, conforme indicado. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como digerir um tecido cutâneo não inflamado e isolar os leucócitos para análise por citometria de fluxo.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Os fibroblastos de câncer associados (FAC) facilitar tumor iniciação, crescimento e progressão através de sinalização que promove a proliferação, angiogênese e inflamação. Descrevemos aqui um método para isolar populações puras de fibroblastos normais e cafés de rato fresca e tecidos humanos por selecção de células, utilizando PDGFRα como um marcador de superfície.

Isolamento de fibroblastos normais e associados ao câncer de tecidos frescos, classificando células activadas por fluorescência (FACS)

Este vídeo descreve o método rápido para isolar e cultivar os melanócitos e fibroblastos simultaneamente da pele do filhote de camundongo pós-natal. Essas células podem ser mantidas e manipuladas in vitro para estudar a biologia celular da pele, cicatrização de feridas e melanoma.

Cultura Rápida de Melanócitos Murinos Primários e Fibroblastos: Isolamento de Melanócitos e Fibroblastos de Amostra de Pele Murina Inteira

O vídeo demonstra a preparação de uma suspensão unicelular de células imunes a partir de um tecido cerebral murino. Envolve digestão enzimática para liberar células do tecido cerebral, seguida de centrifugação com gradiente de densidade para isolar as células imunes com base em suas densidades para obter a suspensão unicelular.

Preparando uma suspensão unicelular de células imunes a partir de tecido cerebral murino

Descrevemos um protocolo para isolar eficientemente as células T residentes na pele de biópsias de pele humana. Este protocolo produz um número suficiente de linfócitos viáveis residentes na pele humana para análise de citometria de fluxo e cultura ex vivo.

Isolamento de linfócitos da pele humana para análise fenotípica e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura de Células

O comportamento dos fibroblastos está subjacente a um espectro de entidades clínicas, mas permanecem mal caracterizados, em grande parte devido à sua heterogeneidade inerente. A pesquisa tradicional de fibroblastos depende da manipulação in vitro, mascarando o comportamento dos fibroblastos in vivo. Descrevemos um protocolo baseado em FACS para o isolamento de fibroblastos de pele de camundongo que não requer cultura de células.

Isolamento de fibroblastos de murino Dérmica por FACS

Um modelo ideal para estudar a biologia de células-tronco adultas é o folículo piloso de camundongo. Aqui apresentamos um protocolo para isolar diferentes populações de folículos pilosos, células-tronco e queratinócitos epidérmicos, empregando digestão enzimática da pele dorsal de camundongos seguida de análise FACS.

Isolando células-tronco do folículo piloso e epidérmico queratinócitos da Dorsal rato Pele

Este relatório descreve um protocolo cúbicos para esclarecer rato espessura biópsias de pele cheios, e visualizar os padrões de expressão de proteínas, células em proliferação e sebócitos com a resolução única célula em 3D. Este método permite uma avaliação precisa da anatomia da pele e patologia, e de fenótipos epidérmicas anormais nas linhas de rato geneticamente modificados.

Protocolo CUBIC Visualiza Protein Expression na resolução única célula em preparações e peles, inteiros Mount

Este protocolo descreve como isolar os queratinócitos da pele dos modelos do rato, manchar com os anticorpos metal-etiquetados, e analisar pilhas manchadas pela citometria maciça a fim examinar o teste padrão da expressão das proteínas do interesse nas fases diferentes do ciclo de pilha.

Isolação e mancha de keratinocytes da pele do rato para a análise específica do ciclo de pilha da expressão celular da proteína pela citometria maciça

Apresenta-se aqui um eficiente protocolo para o isolamento de células satélites de músculo de membros de camundongos (FACS) adaptado ao estudo da regulação da transcrição em fibras musculares por clivagem sob alvos e liberação utilizando nuclease (CUT&amp;RUN).

Um Protocolo Eficiente para Análise CUT&amp;RUN de Células Satélites de Camundongos Isoladas por FACS

Descrevemos protocolos para a preparação de suspensão unicelular de células epiteliais tímicas de camundongo e a coloração de moléculas intracelulares para análise citométrica de fluxo.

Preparação de Suspensão de Célula Única de Células Epiteliais Tímicas de Camundongo e Coloração de Moléculas Intracelulares para Análise por Citometria de Fluxo

Esse protocolo apresenta um método detalhado para isolar suspensões unicelulares de alta qualidade tanto de tecido pulmonar murino saudável quanto de tumores. Esse protocolo pode ser aplicado ao scRNA-seq, análise de citometria de fluxo e isolamento de células primárias.

Preparação otimizada de tecido pulmonar inteiro portador de tumor murino para citometria de fluxo e sequenciamento de RNA unicelular

Aprenda a preparar suspensões de células únicas da pele de camundongo para citometria de fluxo. Este método preserva marcadores de superfície imunológicos e permite identificar populações de leucócitos residentes em diferentes regiões da pele.

Preparação de uma única célula suspensões para Análise de citometria de fluxo de diferentes regiões da pele do rato

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