Normais e malignas Transplante de Células Muscle em imunológico comprometido Adulto Zebrafish

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como preparar e transplantar músculo normal e maligno de peixes-zebra doadores transgênicos para receptores peixes-zebra imunodeficientes rag2. O transplante muscular envolve, inicialmente, o isolamento do músculo marcado com fluorescência mediante dissecção da musculatura dorsal.

Após a homogeneização, as células musculares de peixe-zebra são filtradas e transformadas em uma suspensão de células únicas. Em seguida, as células são transplantadas por via intramuscular em peixes-zebra mutantes rag dois, e a microscopia de epifluorescência é utilizada para acompanhar o enxerto tecidual nos animais receptores já a partir de 10 dias após o transplante. De forma semelhante, um sarcoma primário de rabdomiossarcoma embrionário pode ser coletado, preparado como uma suspensão e transplantado por via intraperitoneal em peixes-zebra mutantes rag dois.

Em seguida, a microscopia é utilizada para acompanhar o enxerto do tecido e as células tumorais propagadas podem ser utilizadas em aplicações posteriores. A principal vantagem do uso do transplante de células em peixes-zebra imunocomprometidos adultos é que ele fornece uma plataforma universal para o transplante alogênico de diversos tecidos e tipos de tumores. Os tecidos podem ser enxertados a partir de uma variedade de origens genéticas de doadores, sem necessidade de supressão imunológica nos peixes receptores.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na biologia de células-tronco e regenerativa, como a capacidade de autorrenovação de progenitores. Também podemos utilizar estes métodos para enxertar tumores em peixes com mutação rag dois e, em seguida, identificar substâncias químicas novas que, por exemplo, inibam o crescimento tumoral. A demonstração da preparação e transplante de células musculares normais e malignas será realizada por Chin, Tang e Anes, dois talentosos estudantes de pós-graduação no laboratório LAL. Inicie sacrificando peixes-zebra doadores com músculo marcado fluorescentemente.

Peixes adultos doadores de alfa-actina RFP típicos fornecem entre 500.000 e 2 milhões de células musculares. Em nosso experimento exemplar, utilizamos 30 peixes doadores para transplantar em 20 peixes receptores, com um milhão de células cada. Após a eutanásia dos peixes doadores, seque o animal colocando-o sobre uma toalha de papel descartável.

Use uma lâmina de barbear para colher a musculatura dorsal. O corte deve ser feito em um ângulo de 45 graus posterior à região do ânus, incluindo ossos e tecido da pele; transfira 10 seções musculares dorsais colhidas para uma placa de Petri limpa. Em seguida, adicione 500 microlitros de tampão de suspensão 0,9 XPBS 5% FBS gelado.

Em seguida, pique o tecido até obter uma suspensão homogênea, utilizando uma pipeta serológica de cinco mililitros. Adicione dois mililitros de tampão de suspensão ao homogeneizado e, então, aspire e expulse a suspensão pela pipeta 20 vezes. Em seguida, filtre a suspensão utilizando um filtro de 40 mícrons e colete as células em um tubo cônico de 50 mililitros sobre gelo. Mantenha as células frias durante o restante do procedimento.

Lave o tecido remanescente no funil com 2,5 mililitros de suspensão, tampeze e transfira para o tubo cônico de 50 mililitros. Agora, conte o número total de células viáveis utilizando azul de tripano e concentre-as por centrifugação a 1000 ×g durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, ressuspenda as células em PBS 0,9 X com 5% de FBS a uma concentração de 333.000 células por microlitro.

Se o número de células doadoras for limitante, tão poucas quanto 50.000 células injetadas também podem levar a um enxerto bem-sucedido. Comece anestesiando peixes deficientes em rag dois, com dois a quatro meses de idade, em trica. Quando os movimentos das brânquias forem lentos e o peixe estiver imóvel, mova o peixe para uma toalha úmida com o lado esquerdo do peixe voltado para cima.

Agora, utilize uma microseringa de 10 microlitros, calibre 26 s, previamente limpa, para injetar três microlitros da suspensão de células musculares preparada. As injeções devem ser realizadas em um ângulo de 45 graus e injetadas diretamente na musculatura dorsolateral dos peixes receptores. É importante observar que, ao realizar o transplante intramuscular, um volume total inferior a três microlitros deve ser injetado nos peixes receptores. Em seguida, transfira cuidadosamente os peixes receptores para um tanque de recuperação contendo água limpa do sistema de criação de peixes.

Continue injetando os peixes restantes e coloque-os em um único tanque de recuperação. Posteriormente, avalie as taxas de enxerto aos 10, 20 e 30 dias após o transplante utilizando microscopia de campo claro e microscopia de fluorescência em epifluorescência. Processe cada tumor separadamente.

Sacrifique um peixe com rabdomiossarcoma embrionário. Coloque o peixe em uma placa de Petri limpa e dissecione o tumor dos tecidos não malignos utilizando uma lâmina de barbear e pinças finas. Uma dissecção cuidadosa ao redor do tumor resultará em maior pureza da suspensão celular obtida, com mínima contaminação por tecido muscular adjacente. Transfira o tumor dissecado para uma nova placa e adicione 100 microlitros de tampão de suspensão de PBS 0,9 X frio contendo 5% de FBS.

Em seguida, pique o tecido com uma lâmina de barbear até obter uma suspensão homogênea. Em seguida, adicione mais 900 microlitros de tampão utilizando uma pipeta de um mililitro, seguido por trituração. Passe a suspensão pela pipeta várias vezes para dissociar as células.

Agora filtre as células através de um filtro celular de 40 mícrons. Enxágue a placa adicionando dois a quatro mililitros adicionais de suspensão, tampão e filtre através do mesmo filtro celular. Concentre as células como anteriormente.

Mantenha as células no gelo. Em seguida, re-suspenda as células em 100 microlitros de tampão e conte as células viáveis usando azul de tripano. Ajuste a concentração da suspensão celular para 5.000 células por microlitro.

Em seguida, anestesie dois peixes-zebra receptores imunocomprometidos e coloque-os sobre uma toalha de papel limpa com o lado ventral voltado para cima. Usando uma agulha de seringa esterilizada de calibre 26, injete o volume desejado na cavidade peritoneal dos peixes-zebra receptores aqui.

25.000 células são injetadas em cinco microlitros. No entanto, até 10 microlitros podem ser injetados com sucesso. Deixe os peixes injetados se recuperarem em um tanque de recuperação antes de devolvê-los ao sistema principal.

Posteriormente, acompanhe os peixes receptores quanto ao enxerto utilizando microscopia de fluorescência epiluminescente e colete as células para estudos posteriores. Utilizando o procedimento descrito, células do músculo esquelético de doadores transgênicos de alfa actina RFP foram transplantadas para peixes-zebra imunocomprometidos homozigotos com mutação rag2. O tecido muscular esquelético produziu uma suspensão simples de células contendo 84,3% de células viáveis, conforme avaliado pela exclusão de DPI.

Após a análise por citometria de fluxo, as células positivas para RFP compreendiam 35,3% dessa suspensão de células doadoras. O transplante de células para o músculo esquelético dorsal de peixes receptores RAG dois mutantes homozigotos resultou em enxertos consistentes e fortes. Isso foi confirmado pela formação de fibras musculares fluorescentes multinucleadas nos peixes receptores; peixes receptores selvagens não conseguiram incorporar as fibras musculares.

No entanto, aos 10 dias pós-transplante, nove dos 14 peixes-zebra mutantes continham fibras musculares positivas para RFP próximas ao local de injeção. Importante, o músculo enxertado positivo para RFP persistiu por pelo menos 30 dias pós-transplante. De forma semelhante, obteve-se um enxerto robusto após o transplante de peixes mutantes RAG dois com rabdomiossarcoma embrionário ou ERMS.

O ERMS enxertado compartilhava características histológicas com o tumor primário de ERMS, e a heterogeneidade das células tumorais foi mantida, conforme avaliado pela análise de fluorescência. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar transplantes musculares e transplantes intraperitoneais de tecidos normais e malignos utilizando peixes adultos imunocomprometidos como receptores. Após este procedimento, outros métodos, como classificação de células ativadas por fluorescência, análise de transplante em diluição limitante e PCR em tempo real, podem ser realizados para avaliar as diferenças funcionais e moleculares entre diferentes subpopulações tumorais.

No geral, nossa abordagem permite o enxerto robusto e de longo prazo de tecido muscular fluorescente e tecido maligno em peixes imunocomprometidos com mutação no RAG dois. A vantagem desta abordagem é que o enxerto ocorre na ausência de supressão imunológica prévia dos peixes receptores e não requer compatibilidade imunológica entre os animais doadores e receptores.