Name: Normais e malignas Transplante de Células Muscle em imunológico comprometido Adulto Zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprenda a transplantar células musculares normais e malignas em zebrafish adultos imunocomprometidos rag2. Este método permite analisar regeneração muscular e transformação tumoral em vivo com sucesso.

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Este trabalho é apoiado por Alex Lemonade Fique Foundation (DML), American Cancer Society (DML), o MGH Howard Goodman Fellowship (DML) e dos Institutos Nacionais de Saúde concede R24OD016761 e 1R01CA154923 (DML). CNY Citometria de Fluxo Core e Análise de Fluxo de imagem, instrumentação compartilhada número de concessão 1S10RR023440-01A1. IMT é financiado por uma bolsa da Fundação Português para a Ciência e Tecnologia (Fundação para a Ciência e Tecnologia - FCT). QT é financiado pelo Conselho de Bolsas de Estudo China. Agradecemos Angela Volorio por seus comentários úteis e conselhos.

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Hospital Geral de Massachusetts Subcomissão de Investigação Animal Care, sob o protocolo nº 2011N000127. Seção 1. Skeletal Muscle Transplante Celular em RAG2 Adulto E450fs Homozygous Mutant Zebrafish 1. Preparação de Zebrafish Adulto Doadores músculo esquelético Cells <ol><li> Obter peixe-zebra transgénicos adultos que tenham marcado por fluorescência muscular. Nesta experiência, 30 α -actina-RFP doador de peixe 25, foram utilizadas para transplantar 1 x 10 6 culas por peixe destinatário. </li><li> Sacrifício do peixe-zebra dador em 1,6 mg / ml tricaina metanossulfonato (MS222) durante 10 minutos ou até que não haja movimento opérculo é evidente. </li><li> Coloque o peixe doador em uma toalha de papel absorvente e especial sobre o consumo do músculo dorsal usando uma lâmina de barbear limpo. O corte deve ser feita perto do anus em um ângulo de 45 ° para maximizar a recolha de tecido (como observado na Figura 1A </strong&gt;). Coloque tecido dissecado em um ambiente limpo 10 centímetros placa de Petri. </li><li> Adicionar 500 ul de tampão de suspensão (0,9x pré-arrefecida de tampão fosfato salino (PBS) suplementado com 5% de Soro Fetal Bovino (FBS)) para o tecido dissecado. Até 10 dador de peixe-zebra pode ser colocado em conjunto neste volume. </li><li> Picar o tecido com uma lâmina de barbear&gt; 20 vezes até que as células estão em uma suspensão uniforme. Toda a musculatura dorsal é homogeneizado incluindo pele, ossos e barbatanas. Adicionar 2 ml de tampão de suspensão. Usando uma pipeta de 5 ml, tritura-se a suspensão de células ≥20 vezes para dissociar as células. </li><li> Filtra-se a suspensão de células através de um coador de malha de 40 um para um tubo cónico de 50 ml colocados em gelo. </li><li> Lava-se a placa de Petri com um adicional de 2,5 mL de tampão de suspensão para recolher tecido remanescente e filtra-se através do mesmo filtro e tubo cónico, para um volume final de 5 ml (10 dador de peixe pode ser usado por isolado). NOTA: pele, os ossos e as aletas serão excluídos seguinte filtração. </li&gt; <li> Se for o caso, combine suspensões semelhantes para o mesmo tubo cônico. </li><li> Contar o número total de células viáveis ​​usando o corante azul de tripano e um hemocitómetro. </li><li> Reservar 500 ul por citometria de fluxo, se desejado (opcional, passo 2). </li><li> Centrifuga-se a suspensão de células 1000 xg, durante 10 min, a 4 ° C. </li><li> Rejeitar sobrenadante e ressuspender as células em 3,33 x 10 5 células / mL (0,9 vezes PBS + 5% de FBS). No total, 3 ul será injectada por peixe receptor para um total de 1 x 10 6 células por recipiente (passo 3). NOTA: Menos de 3 ul de suspensão de células deve ser transplantadas para o peixe destinatário. Se o número de células é limitante, tão baixa quanto 5 x 10 4 culas por receptor pode levar a enxerto com sucesso (Tabela 1). </li></ol> 2. Citometria de Fluxo de Análise de Doadores Skeletal Muscle celular Preparação (Opcional) <ol><li> Isolar o músculo de um tipo selvagem, peixes não-transgénicos como delineado in passo 1.1. Este exemplo serve como controlo negativo e é útil para definir portões Citometria de Fluxo. </li><li> Adicionar um corante de viabilidade adequada. Por exemplo, adicionam-se 5 ml de solução de estoque de DAPI (500 ng / uL) em 500 uL de preparação de músculo. Vortex ligeiramente antes da análise. Adquirir 5 x outubro 3-1 x 10 4 eventos. Analisar amostras de controlo de tipo selvagem primeiro a colocar portões seguido por análise de células musculares isoladas a partir de peixes transgénicos. NOTA: A citometria de fluxo de análise é geralmente realizada dentro de 1 hora após a dissecação do tecido muscular, tempo durante o qual as células dissecadas reter mais do que 60% ​​de viabilidade (Figura 2). As células devem ser mantidas em gelo em todos os momentos. Viabilidade celular total pode ser reavaliado antes do transplante utilizando corante azul tripan e um hemocitômetro. </li></ol> 3. intramuscular Transplante de Células musculares esqueléticas em RAG2 Adulto Homozygous Mutant Zebrafish <ol><li> Limpe a 10 μ; L 26S G micro-seringa através da elaboração e expulsando solução a 10% de lixívia (5 vezes), seguido de etanol a 70% (5 vezes), e, em seguida, seguido de tampão de suspensão (0.9x PBS + 5% de FBS, 10 vezes). </li><li> Anestesiar peixes 2-4 meses de idade homozigoto RAG2 mutante ou peixe tipo de destinatário selvagem (como controles) pela adição de gotas individuais de metano tricaina (MS222, 4 mg / ml solução estoque) em uma placa de Petri contendo o peixe em água do sistema até que os movimentos lentos opérculo e peixe são ainda. NOTA: Dose de anestesia tricaina dependerá da idade e tamanho do peixe-zebra destinatário. </li><li> Coloque zebrafish destinatário anestesiados em uma toalha de papel úmido ou esponja, com o lado esquerdo virado para cima. </li><li> Insira a agulha da seringa na musculatura látero-dorsal (consulte a Figura 1A). Certifique-se de que as injecções são efectuadas com um ângulo de 45 °. Injectar 3 ul da suspensão de células (preparado no passo 1.12) por peixe para um total de 1 x 10 6 células por recipiente.</li><li> Transferir cuidadosamente zebrafish injetado em um tanque limpo usando uma colher de plástico para se recuperar. </li><li> Avaliar zebrafish destinatário para as taxas de enxertia em 10, 20, 30 dias pós-transplante por imagem peixes anestesiados em campo brilhante e microscopia de epifluorescência. </li></ol> Seção 2. Embryonal (ERMS) Transplantation em Adulto Homozygous RAG2 Mutant Zebrafish 4. DNA microinjeção de embriões Zebrafish <ol><li> Linearizar o plasmídeo RAG2-kRASG12D 7 por digestão de 10 ug de ADN com XhoI, a 37 ° C durante 6 h ou O / N. </li><li> Purificar DNA por fenol padrão: clorofórmio e precipitado com etanol. Ressuspender em 20 ul de água desionizada (alternativamente, as colunas comerciais de purificação de fragmentos de ADN pode ser usado). </li><li> Executar o ADN digerido e digerido num gel de agarose a 1% e determinar a concentração de ADN bleitura espectrômetro y. Alternativamente, as amostras de executar a 1: 1, 1: 5, 1:10 e diluições sobre um gel de agarose a 1% e quantificar comparado a uma escada de ADN. </li><li> Prepara-se uma mistura de injecção a uma concentração final de 15 ng / uL de ADN digerido com RAG2-kRASG12D em KCI 0,1 M e Tris-EDTA 0,5x. A quantidade final de ADN injectado em 2 nl de volume de injecção será de 30 pg. NOTA: Até três construções de DNA diferentes podem ser co-injetado em um máximo de 60 pg de DNA por embrião de forma eficiente. Estes transgenes se integram no genoma e co-expressas no tumor em desenvolvimento 26. </li><li> Injectar linearizado RAG2-kRASG12D em embriões de estádio de uma célula, essencialmente como descrito 27 em peixes-zebra de uma estirpe de interesse (Figura 1B). As injecções devem ser realizados na célula e não na gema para maior eficiência. Neste experimento, a dupla transgênico AB-tensão; myf5-GFP, mylpfa-mCherry foi usado. Levante zebrafish usando o padrão de criação protocols 28. NOTA: sobrevivência Injection é muitas vezes dependente da cepa zebrafish utilizado. Em média, 30% dos embriões injectados irão desenvolver ERMS. 300-600 embriões devem ser injectada por experiência, a fim de assegurar que os tumores primários suficientes GFP-positiva e mCherry-positivos são gerados para o transplante e análise. </li></ol> 5. Triagem para ERMS primárias em Zebrafish Larvas <ol><li> Observe zebrafish injetado de 10 a 30 dias após a injeção para o surgimento de ERMS primárias visíveis externamente. </li><li> Aos 30 dias após a injecção, anestesiar zebrafish destinatário adicionando gotas individuais de metano tricaina (MS222 solução stock 4 mg / ml) em uma placa de Petri contendo sistema de água de peixe até movimentos opérculo lento e peixes ainda estão. NOTA: Dose de anestesia tricaina irá depender da idade e tamanho do peixe-zebra destinatário. Zebrafish portadores de tumores primários requerem doses mais baixas de tricaina. </li><li> Selecione ERMS-bearing primáriopeixes que são myf5-GFP -positivo e mylpfa-mCherry -positivo, utilizando um microscópio de epifluorescência. </li></ol> 6. ERMS Tumor Preparação <ol><li> Sacrifício peixe-zebra ERMS-rolamento primário seleccionado em 1,6 mg / ml tricaina metanossulfonato (MS222) durante 10 minutos ou até que não haja movimento opérculo é evidente. </li><li> Processar cada peixe-zebra portadores de tumor separadamente. Coloque o peixe num prato de Petri limpo e dissecar em torno do tumor utilizando uma lâmina de barbear e uma pinça fina (como mostrado na Figura 1B). Transfira o tecido tumoral dissecados para um prato limpo Petri. </li><li> Adicionar 100 ul de 0,9x pré-gelada de tampão de fosfato salino (PBS) suplementado com 5% de Soro Fetal Bovino (FBS). Mince tecido com uma lâmina de barbear limpo&gt; 20 vezes até que as células estão em uma suspensão uniforme. </li><li> Adicionar 900 ul do mesmo tampão (PBS 0,9x + 5% de FBS), pipetar para cima e para baixo várias vezes para dissociar células, utilizando um 1000 ul filtrados ponta da pipeta. Filtrar através de um 40 &amp;# 956; m mesh peneira para o correspondente tubo de 50 ml. Guarde no gelo. </li><li> Lava-se a placa de Petri com um adicional de 2-4 ml de tampão, e passam através do mesmo filtro de malha e para dentro do tubo cónico correspondente. </li><li> Centrifugar a 1.000 xg, durante 10 min, a 4 ° C. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender em 100 ul de tampão. </li><li> Contar o número total de células viáveis ​​usando o corante azul de tripano e um hemocitómetro. </li><li> Dilui-se as células à concentração desejada no mesmo tampão (PBS 0,9x + 5% de FBS). As células devem ser diluídas a 5 x 10 3 células / ul de transplante de 5 ul por recipiente em peixes-zebra de um total de 2,5 x 10 4 culas por recipiente. </li><li> A análise de citometria de fluxo também pode ser realizada com uma pequena quantidade da suspensão do passo 6.5 para quantizar as proporções relativas de células fluorescentes na amostra. NOTA: Separe 100 ml de suspensão de células (após filtragem na etapa 3.5) e diluir com 400 ulde 0,9x PBS + 5% de FBS tampão de suspensão para análise de citometria de fluxo. Para garantir a correcta delimitação, realizar análises adicionais usando tecido tumoral transgênica única ou músculo isolado do tipo selvagem adulto, myf5-GFP e mylpfa-mCherry peixe. Execute Citometria de Fluxo essencialmente como descrito no passo 2 da secção 1. </li></ol> 7. Transplante de ERMS em Adulto RAG2 Homozygous Mutant Zebrafish <ol><li> Limpar a 10 ul 26S G micro-seringa através da elaboração e expulsando 10% de solução de lixívia (5 vezes), seguido de etanol a 70% (5 vezes), e, em seguida, seguido de tampão de suspensão (0.9x PBS + 5% de FBS, 10 vezes ). </li><li> Anestesiar destinatário homozigoto peixes mutantes RAG2 adicionando gotas individuais de metano tricaina (MS222 / solução stock 4 mg ml) em uma placa de Petri contendo o peixe em água do sistema até que os movimentos são lentos e opérculo peixes ainda estão. </li><li> Coloque zebrafish destinatário anestesiados em uma toalha de papel molhado ou spoESL, com o lado ventral para cima. </li><li> Injectar 5 ul da suspensão de células para dentro da cavidade peritoneal (2,5 x 10 4 culas por recipiente). NOTA: A agulha de injecção deve ser limpo entre as injecções de diferentes tumores, tal como descrito na etapa 4.1. 5 a 10 ul pode ser eficientemente transplantado intraperitonealmente, dependendo do tamanho do peixe destinatário. Tumor de enxerto pode ser realizada por injecção de 1 x 04-05 outubro x 10 5 células não separados por peixe destinatário (Tabela 1). </li><li> Com cuidado, coloque zebrafish destinatário em um tanque limpo com uma colher de plástico. </li><li> Avaliar zebrafish destinatário para as taxas de enxertia em 10, 20, 30 dias pós-transplante por imagem peixes anestesiados em campo brilhante e microscopia de epifluorescência. </li><li> Utilize peixes enxertada para aplicações a jusante, nomeadamente a triagem de fluorescência de células activadas (FACS) para avaliar o estado de diferenciação (Figura 3H), Analy histológica convencionalsis (Figura 3F), respostas de terapia de imagem 15, e / ou transplante de série se aproxima incluindo análise de diluição limitante 11. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Enxerto eficiente e robusta de adulto dorsal do músculo esquelético foi atingido com um método de preparação de células muito simples, seguidas por injecção de células na musculatura dorsal do peixe RAG2 mutante homozigótica. Em geral, os procedimentos de injecção por via intramuscular foram muito robusta, com alguma morte associada imediatamente após o procedimento de implante, que varia entre 10% a 35%, dependendo da experiência. Otimização adicionais provavelmente vai centrar-se na utilização de pequenas agulhas de calibre para injeção e desenvolvimento de aparelhos de injeção estacionário usando um microscópio e micromanipulator, o que facilitará a facilidade de implantação de células. Nossa abordagem também usou células musculares, não triados de animais dadores e continha apenas cerca de 30% de células progenitoras muscular. A utilização de linhas transgénicas repórter que rotulam células estaminais e FACS isolamento provavelmente irá fornecer suspensões de células enriquecidas que levam ao aumento enxerto em peixes destinatário. Músculo Esquelético cells também pode ser enriquecido e cultivadas antes do transplante, como anteriormente descrito 29. Notavelmente, os resultados indicam que os passos de estabelecimento de nicho e diferenciação de tecido muscular dador ocorre antes dos 10 dias pós-transplante, a construção deste modelo experimental como uma plataforma robusta e rápida para avaliar o enxerto ea regeneração musculares. Além disso, estas experiências duramente contrastam com os concluída em ratos, onde pré-lesão do músculo com cardiotoxina ou cloreto de bário é necessário dois dias antes enxerto 30,31. É provável que a lesão produzida agulha durante o procedimento de transplante de enxerto potencia, estimulando a produção de um ambiente de regeneração no animal receptor 32,33. Nós também prevêem que o nosso método irá ser facilmente adaptado para o transplante de tecido de músculo esquelético a partir de peixe-zebra mais novo, permitindo uma análise de mutações genéticas que afectam o desenvolvimento precoce do músculo esqueléticomas levar a letalidade nos estágios larvais. Nós também fornecemos um protocolo detalhado para enxerto de ERMS peixe-zebra por injecção intraperitoneal em RAG2 peixes mutantes não-condicionado, homozigotos. Esta abordagem era útil para a expansão de tumores primários transgénicos duplos sem a necessidade de gerar tumores dentro de uma linha transgénica singeneicos. O nosso trabalho recente demonstrou que as abordagens de transplante de células fornecer novos modelos experimentais para avaliar a sensibilidade ERMS fármaco in vivo, em que um único tumor pode ser expandida em milhares de animais e avaliada pelos seus efeitos sobre o crescimento, a auto-renovação, e neovascularização 15. Por outro lado, temos enxertados com sucesso uma ampla variedade de tumores em peixes mutante homozigótica RAG2 incluindo células T de leucemia linfoblástica aguda, melanoma, e ERMS 23. Olhando para o futuro, nós encaramos essas linhas será útil para avaliar as propriedades funcionais importantes de câncer emvivo incluindo a avaliação heterogeneidade intra-tumoral, invasão, metástase, angiogénese, e resistência à terapia. Além disso, a geração de RAG2 homozigótico mutante peixe na opticamente clara Casper estirpe zebrafish 34 irá provavelmente facilitar imagiologia directa de muitas destas características de cancro. No total, nós fornecemos protocolos detalhados para o sucesso do enxerto, de músculo esquelético fluorescently marcado normal e maligno em RAG2 para adulto homozigoto mutante zebrafish imune comprometido.

Peixe-zebra são um modelo excelente para estudos de regeneração, porque eles podem regenerar aletas amputados, bem como um cérebro danificado, retina, espinal medula, coração, músculo esquelético e de outros tecidos 1. Células-tronco e estudos regenerativos no peixe-zebra adulto em grande parte voltada para a caracterização da regeneração em resposta à lesão, enquanto a identificação de células-tronco e progenitoras de vários tecidos por transplante de células só recentemente foi explorado 2. Zebrafish também se tornaram cada vez mais utilizado para o estudo do câncer através da geração de modelos de cancro transgênicos que imitam doenças humanas 3-10. No cenário de câncer, as abordagens de transplante de células tornaram-se amplamente adotada e permitir a avaliação dinâmica de processos importantes de câncer, incluindo a auto-renovação 11, a heterogeneidade funcional 12,13, neovascularização 14, proliferação,respostas de terapia 15 e invasão 16,17. No entanto, células enxertadas são muitas vezes rejeitadas a partir de peixes destinatário deverá acolher defesas imunitárias que atacam e matam o enxerto 18. Vários métodos têm sido utilizados para superar a rejeição das células enxertadas. Por exemplo, os animais receptores do sistema imune pode ser transitoriamente ablação por uma dose baixa de irradiação gama antes do transplante 18,19. No entanto, o sistema imune receptor irá recuperar por 20 dias pós-irradiação e matar células de dador 18. Alternativamente, o tratamento com dexametasona tem sido utilizada para suprimir a função de células T e B, fornecendo supressiva condicionado se encontra imune e facilitar o enxerto de uma vasta gama de tumores humanos para até 30 dias 14. Estas experiências requer dosagem de droga constante e são limitados para o estudo de tumores sólidos. Ensaios de enxerto a longo prazo usaram linhas singï¿½icos geneticamente idênticos 20-22, em que o doador e recipient células são imunes correspondido. No entanto, estes modelos requerem linhagens transgênicas de interesse a ser atravessado para o fundo singeneico por mais de quatro gerações para produzir linhas totalmente singï¿½icos. Para obviar a problemas de rejeição imunitária no receptor de peixe, o nosso grupo desenvolveu recentemente uma comprometida RAG2 E450fs mutante linha homozigótica (ZFIN designação alelo RAG2 fb101), que reduziram a função das células T e B e que permitam o enxerto de uma vasta gama de tecidos 23 imunológico. Similar imunocomprometidos modelos de rato foram utilizados extensivamente para o transplante de células de rato e de 24 tecidos humanos. Aqui, apresentamos métodos para o transplante de músculo esquelético e rabdomiossarcoma embrionário (ERMS), um sarcoma pediátrica que compartilha características com o músculo esquelético, no RAG2 recentemente descrito homozigoto peixe-zebra mutante. A disponibilidade de um peixe-zebra adulto comprometido imuneexpande nossa capacidade de realizar estudos de transplante de células em grande escala para visualizar diretamente e avaliar com células-tronco auto-renovação dentro dos tecidos normais e malignas. Com este método, marcado por fluorescência a partir de preparações de células de músculo adulto α-actina-RFP 25 peixes-zebra transgénicos robustamente enxertar em RAG2 peixe-zebra mutante homozigótica após a injecção na musculatura dorsal. Além disso, demonstramos o enxerto e expansão da -GFP myf5 primário; mylpfa- ERMS transgênicos mCherry após a injeção intraperitoneal em RAG2 E450fs peixe-zebra mutante homozigoto. A utilidade destes protocolos ultrapassa os exemplos mostrados e pode ser facilmente aplicado a tecidos regenerados adicionais de peixe-zebra e cancros.

<table><tbody><tr><td>Solução tampão Tris-EDTA 1x</td><td>Microinjeção Sigma-Aldrich</td><td>93283-100ML</td><td>. Mistura de injeção.</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Fisher Science Education</td><td>S77375-1</td><td>Microinjeção. Mistura de injeção.</td></tr><tr><td>Enzima de restrição XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td>Microinjeção. Linearização de plasmídeo.</td></tr><tr><td>Kit de purificação de PCR QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28104 (50) ou 28106 (250)</td> <td>Microinjeção. Para purificação de plasmídeo linearizado de até 10 kb.</td></tr><tr><td>Fenol/clorofórmio/álcool isoamílico</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1753I-100</td><td>Microinjeção. Para purificação de plasmídeo linearizado.</td></tr><tr><td>Agarose UltraPura, 500&nbsp; g</td><td>Microinjeção Invitrogen</td><td>16500-500</td><td>. Quantificação de plasmídeo linearizado.</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>http://www.nanodrop.com/Productnd2000overview.aspx</td><td>Microinjeção. Quantificação de plasmídeo linearizado.</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindo, dicloridrato)</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td>citometria de fluxo/FACS</td></tr><tr><td>Tubo inferior redondo de poliestireno de 5 ml</td><td>BD Falcon</td><td>Tubo de coleta de citometria de fluxo</td><td>352058</td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td> Programa de <td>Produtos de Pesquisa de Pedidos Especiais (SORP)</td> da <td>BD Biosciences</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Tubo inferior redondo de polipropileno de 5 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td>Tubo de coleta FACS</td></tr><tr><td>BD LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td>Special Order Research Products (SORP) programa</td><td>de citometria de fluxo</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4 (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td>transplante</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-01</td><td>transplante</td></tr><tr><td>de metanossulfonato de tricaína (MS-222)</td><td>Western Chemical Inc.</td><td>http://www.wchemical.com/tricaine-s-ms-222.html</td><td>Transplante. Anestésico. Cuidado: Irritante. Irritante para os olhos, sistema respiratório e pele.</td></tr><tr><td>Underpads de bancada absorventes VWR</td><td>VWR</td><td>56616-018</td><td>Transplante. Toalhas de papel comuns ou esponja podem ser usadas como alternativa.</td></tr><tr><td>Lâminas de barbear industriais Singe Edge</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>placa de Petri para transplante</td></tr><tr><td>, poliestireno descartável estéril</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td>filtro de células para transplante</td></tr><tr><td>, 40 &micro; m Nylon</td><td>Falcon-Corning Incorporated</td><td>352340</td><td>transplante</td></tr><tr><td>50 ml Tubo de centrífuga</td><td>Corning Incorporated</td><td>430828</td><td>transplante</td></tr><tr><td>Mancha azul de tripano (0,4%)</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>conjunto de hemacitômetro para</td></tr><tr><td>transplante&nbsp;</td>Seringa Hamilton <td>para transplante</td> <td>Hausser Scientific</td><td>1483</td></tr><tr><td>, agulha fixa, volume 10 &micro; l, tamanho da agulha 26s ga (ponta chanfrada)</td> <td>Hamilton</td><td>80366</td><td>transplante</td></tr><tr><td>Austin's A-1 Bleach, Commercial</td><td>James Austin Company</td><td></td><td>Transplantation. Qualquer solução comercial pode ser usada.</td></tr><tr><td>Etanol 190 Prova</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>DSP-MD.43</td><td>Microinjeção (purificação de plasmídeo linearizado) e transplante. Qualquer comercial&nbsp; solução pode ser usada.</td></tr><tr><td>Microcentrífuga de alta velocidade, microcentrífuga digital 300D</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>C0265-24</td><td>transplante</td></tr><tr><td>Sorvall Legend XFR Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004539&nbsp;</td><td>transplante. Número de catálogo para 120 V, 60 Hz (US).</td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas de 5 ml</td><td>BD Falcon</td><td>357529</td><td>transplante</td></tr><tr><td>Corning Stripettor Plus Controlador de pipetagem</td><td>Corning Incorporated</td><td>4090</td><td>Transplantation. Qualquer controlador de pipetagem automático pode ser usado.</td></tr><tr>Luvas <td></td><td></td><td>de exame sem pó</td><td>Todas as etapas. Qualquer marca comercial pode ser usada.</td></tr><tr><td>Filtre as pontas da pipeta e as micropipetas</td><td></td><td></td><td>Todas as etapas. Qualquer marca comercial pode ser usada.</td></tr><tr><td>Fórceps Dumont #5</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>11205-20</td><td>transplante</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio Fluorescente</td><td>Olympus</td><td>MVX10</td><td>Pontuação. Qualquer estereomicroscópio fluorescente apropriado pode ser usado.</td></tr><tr><td>Olympus DP72 microscópio câmera digital</td><td>Olympus</td><td>DP72</td><td>Pontuação. Várias câmeras adequadas para o sistema de imagem selecionado podem ser usadas.</td></tr></tbody></table>

normais e malignas transplante de células muscle em imunológico comprometido adulto zebrafish

Normal and Malignant Muscle Cell Transplantation into Immune Compromised Adult Zebrafish

Zebrafish tornaram-se uma ferramenta poderosa para a avaliação do desenvolvimento, regeneração e câncer. Mais recentemente, protocolos de transplante de aloenxerto de células têm sido desenvolvidas que permitem o enxerto de células normais e malignas em irradiadas, singeneicos, e peixe-zebra adulto imune comprometido. Estes modelos, quando juntamente com protocolos de transplante de células otimizados permitir a rápida avaliação da função das células-tronco, a regeneração após lesão, e câncer. Aqui, apresentamos um método de transplante de células de adulto zebrafish músculo esquelético e rabdomiossarcoma embrionário (ERMS), um sarcoma pediátrica que compartilha características com o músculo embrionária, em imunológico comprometido adulto RAG2 E450fs peixe-zebra mutante homozigoto. É importante notar que estes animais carecem de células T e reduziram a função das células B, facilitar o enxerto de uma vasta gama de tecidos de animais dadores não relacionados. Os nossos protocolos optimizados mostram que marcado por fluorescência de células de músculo preparções de peixes-zebra transgénicos α-actina-RFP enxertar robustamente quando implantado na musculatura dorsal de RAG2 peixes mutantes homozigotos. Nós também demonstramos enxerto de ERMS fluorescentes-transgênica onde fluorescência está confinada às células com base no estado de diferenciação. Especificamente, foram criados em ERMS AB-estirpe myf5-GFP; mylpfa-mCherry animais transgénicos duplos e tumores injectados no peritoneu de peixe adulto imunológico comprometido. A utilidade destes protocolos se estende para o enxerto de uma grande variedade de células normais e malignas doadoras podem ser implantados na musculatura dorsal do peixe-zebra ou peritoneu de adulto.

Um procedimento para a preparação e transplante de células do músculo esquelético de doadores transgênicos α-actina-RFP em imunológico comprometido homozigoto peixe-zebra mutante RAG2 Foi demonstrado (Protocolo ponto 1, a Figura 1A e Figura 2). O tecido muscular esquelético foi preparado a partir de doadores transgénicos-α-actina RFP e a suspensão de célula única resultante continha 84,3% de células viáveis, tal como avaliado por exclusão com DAPI seguinte análise de citometria de fluxo (Figura 2B). Células RFP-positivos composta de 35,3% desta suspensão de células individuais (Figura 2C). Transplante de células em músculo esquelético dorsal do peixe RAG2 homozigótico mutante receptor conduziu a enxerto consistente e forte, tal como avaliado por diferenciação de células individuais em fibras multinucleadas (1 x 10 6 células injectadas por peixe, Tabela 1, Figura 2D-I). Selvagem tipobeneficiário peixes o enxerto falhou fibras musculares durante a experiência de 30 dias (n = 13). Aos 10 dias após o transplante, 9 em cada 14 RAG2 do peixe-zebra mutante homozigótica continha fibras musculares RFP-positiva próximo do local de injecção (64,3%, Figura 2E, F). Importante, músculo-RFP positivo enxertada persistiu 30 dias pós-transplante (Figura 2G-I), com um subconjunto de animais a ser seguido durante 115 dias após a enxertia e exibindo enxertia músculo robusto e persistente (dados não mostrados). Estes resultados são semelhantes às descritas anteriormente pelo nosso grupo de 23 utilizando o mesmo protocolo (Tabela 1). Nós também apresentamos um método para a geração, a preparação e a transplantação de células tumorais ERMS na cavidade peritoneal de peixe destinatário RAG2 homozigótico mutante (Protocolo ponto 2, Figura 1B e Figura 3). ERMS foram gerados em DOUBLe transgénico myf5-GFP; mylpfa-mCherry peixe que foram mostrados para permitir a visualização de heterogeneidade intra-tumoral e análise funcional de subpopulações de células de tumor após transplante de 11. No entanto, a melhor caracterização molecular de cada subpopulação é difícil porque os peixes são pequenos quando eles desenvolvem ERMS entre 10 a 30 dias de vida e o número de células tumorais são limitantes para aplicações a jusante. Uma solução consiste em expandir o número de células de tumor por enxertando ERMS em peixes-zebra receptor adulto. Até à data, experiências semelhantes foram concluídos utilizando-CG1 estirpe peixe singeneicos e necessária em excesso de 4 gerações de retrocruzamento para desenvolver linhas singeneicas que eram transgénicos para myf5-GFP; mylpfa-mCherry. Para contornar esses problemas, nós demonstraram a utilidade da imunológico comprometido RAG2 homozigoto zebrafish receptor mutante enxertar ERMS primárias a partir de um peixe-zebra AB-tensão. Todos os ERMS primárias em vós implantada em rag2 animais mutantes homozigóticos, facilitando a expansão do tumor (Tabela 1). Resultados semelhantes foram relatados recentemente, onde 24 dos 27 RAG2 peixe-zebra mutante homozigoto ERMS enxertadas, enquanto 0 de 7 selvagens irmãos tipo engrafted doença 23. Um exemplo representativo de uma ERMS enxertada é mostrado aos 30 dias pós-transplante na Figura 3E. Enxertada ERMS partilham características histológicas de rabdomiossarcoma embrionário, semelhante à encontrada no tumor primário (Figura 3B e 3F). A análise FACS confirmou que continha ERMS funcionalmente distinta células de tumor e células diferenciadas que expressam myf5-GFP e / ou mylpfa-mCherry propagação. As taxas de sobrevivência após o procedimento de injecção intraperitoneal foram em excesso de 95%. Zebrafish Destinatário geralmente sucumbem de carga tumoral após os 30 dias pós-transplante ponto de tempo. Figura 1. Protocolo esquemática para (A) normal e (B) a transplantação de células do músculo esquelético maligna para RAG2 mutante homozigótica peixe-zebra. etapas opcionais são marcados com (*). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52597/52597fig2highres.jpg" width="700px" /> Figura 2. enxerto do músculo esquelético em RAG2 homozigoto peixe-zebra mutante. (A)-α-actina RFP transgênico zebrafish doador. (B) A viabilidade celular de suspensão de células do músculo isolado, tal como avaliado por exclusão de corante de DAPI e citometria de fluxo. (C) Percentagem de células RFP-positivos encontrados dentro da suspensão de células do músculo do doador α-actina-RFP (vermelho), em comparação com um controlo do tipo selvagem(Cinza). (DE) Mesclado campo brilhante e imagens fluorescentes de animais selvagens do tipo (D) ou RAG2 peixe mutante homozigoto (E) aos 30 dias pós-transplante. taxas (F) ao longo do tempo o enxerto. Red indica número de animais enxertados enquanto cinza mostra peixes não enxertada. Número de animais analisados ​​em cada ponto de tempo são indicados. (GI) imagens de ampliação alto da região em caixa em painel E mostradas na 10 (L), 20 (H) e 30 (I) dias pós-transplante, que mostra a retenção de fibras musculares diferenciadas ao longo do tempo (pontas de seta). Barras de escala igual a 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52597/52597fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52597/52597fig3highres.jpg" width="700px" /> Figura 3. Transplantes de myf5-GFP; mylpfa-mCherry ERMS em mutante homozigótica RAG2 . peixe-zebra (AD) RAG2-kRASG12D ERMS primárias induzidas decorrentes AB-deformação myf5-GFP; zebrafish mylpfa-mCherry aos 30 dias de vida. (EH) RAG2 homozigoto peixe-zebra mutante enxertada com ERMS e analisados ​​aos 30 dias pós-transplante. (A, E) de campo claro e imagens fluorescentes de ERMS primárias e transplantados mesclada. Área tumoral é delineado e ponta de seta indica local de injecção em E. (B, F) e hematoxilina-eosina parafina de primário (B) e ERMS enxertadas (F) mostrando as áreas de maior celularidade associada com o câncer. (C,G) A viabilidade celular, tal como avaliado por exclusão de corante de DAPI e citometria de fluxo. (D, H) sub-populações de células tumorais fluorescentes, como avaliado por citometria de fluxo. Barras de escala igual a 2 mm (A, E) e 50 mm (B, F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52597/52597fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Tabela 1" src="/files/ftp_upload/52597/52597table1.jpg" width="700px" /> Tabela 1. Resultados de enxerto e transplante de células do músculo ERMS. (*) Indica dados previamente relatados utilizando as mesmas técnicas 23. Os dados são reproduzidos com autorização da Nature Methods. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52597/52597table1.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta tabela</a>.

Aqui, apresentamos um protocolo para transplante de células do músculo esquelético do peixe-zebra e rabdomiossarcoma embrionário (ERMS) em peixe-zebra mutante homozigoto rag2E450fs imune adulto. Este protocolo permite a análise eficiente da regeneração e transformação maligna das células musculares.

Normais e malignas Transplante de Células Muscle em imunológico comprometido Adulto Zebrafish

Zebrafish have become a powerful tool for assessing development, regeneration, and cancer. More recently, allograft cell transplantation protocols have ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como preparar e transplantar músculo normal e maligno de peixes-zebra doadores transgênicos para receptores peixes-zebra imunodeficientes rag2. O transplante muscular envolve, inicialmente, o isolamento do músculo marcado com fluorescência mediante dissecção da musculatura dorsal.Após a homogeneização, as células musculares de peixe-zebra são filtradas e transformadas em uma suspensão de células únicas. Em seguida, as células são transplantadas por via intramuscular em peixes-zebra mutantes rag dois, e a microscopia de epifluorescência é utilizada para acompanhar o enxerto tecidual nos animais receptores já a partir de 10 dias após o transplante. De forma semelhante, um sarcoma primário de rabdomiossarcoma embrionário pode ser coletado, preparado como uma suspensão e transplantado por via intraperitoneal em peixes-zebra mutantes rag dois.Em seguida, a microscopia é utilizada para acompanhar o enxerto do tecido e as células tumorais propagadas podem ser utilizadas em aplicações posteriores. A principal vantagem do uso do transplante de células em peixes-zebra imunocomprometidos adultos é que ele fornece uma plataforma universal para o transplante alogênico de diversos tecidos e tipos de tumores. Os tecidos podem ser enxertados a partir de uma variedade de origens genéticas de doadores, sem necessidade de supressão imunológica nos peixes receptores.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na biologia de células-tronco e regenerativa, como a capacidade de autorrenovação de progenitores. Também podemos utilizar estes métodos para enxertar tumores em peixes com mutação rag dois e, em seguida, identificar substâncias químicas novas que, por exemplo, inibam o crescimento tumoral. A demonstração da preparação e transplante de células musculares normais e malignas será realizada por Chin, Tang e Anes, dois talentosos estudantes de pós-graduação no laboratório LAL. Inicie sacrificando peixes-zebra doadores com músculo marcado fluorescentemente.Peixes adultos doadores de alfa-actina RFP típicos fornecem entre 500.000 e 2 milhões de células musculares. Em nosso experimento exemplar, utilizamos 30 peixes doadores para transplantar em 20 peixes receptores, com um milhão de células cada. Após a eutanásia dos peixes doadores, seque o animal colocando-o sobre uma toalha de papel descartável.Use uma lâmina de barbear para colher a musculatura dorsal. O corte deve ser feito em um ângulo de 45 graus posterior à região do ânus, incluindo ossos e tecido da pele; transfira 10 seções musculares dorsais colhidas para uma placa de Petri limpa. Em seguida, adicione 500 microlitros de tampão de suspensão 0,9 XPBS 5% FBS gelado.Em seguida, pique o tecido até obter uma suspensão homogênea, utilizando uma pipeta serológica de cinco mililitros. Adicione dois mililitros de tampão de suspensão ao homogeneizado e, então, aspire e expulse a suspensão pela pipeta 20 vezes. Em seguida, filtre a suspensão utilizando um filtro de 40 mícrons e colete as células em um tubo cônico de 50 mililitros sobre gelo. Mantenha as células frias durante o restante do procedimento.Lave o tecido remanescente no funil com 2,5 mililitros de suspensão, tampeze e transfira para o tubo cônico de 50 mililitros. Agora, conte o número total de células viáveis utilizando azul de tripano e concentre-as por centrifugação a 1000 ×g durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, ressuspenda as células em PBS 0,9 X com 5% de FBS a uma concentração de 333.000 células por microlitro.Se o número de células doadoras for limitante, tão poucas quanto 50.000 células injetadas também podem levar a um enxerto bem-sucedido. Comece anestesiando peixes deficientes em rag dois, com dois a quatro meses de idade, em trica. Quando os movimentos das brânquias forem lentos e o peixe estiver imóvel, mova o peixe para uma toalha úmida com o lado esquerdo do peixe voltado para cima.Agora, utilize uma microseringa de 10 microlitros, calibre 26 s, previamente limpa, para injetar três microlitros da suspensão de células musculares preparada. As injeções devem ser realizadas em um ângulo de 45 graus e injetadas diretamente na musculatura dorsolateral dos peixes receptores. É importante observar que, ao realizar o transplante intramuscular, um volume total inferior a três microlitros deve ser injetado nos peixes receptores. Em seguida, transfira cuidadosamente os peixes receptores para um tanque de recuperação contendo água limpa do sistema de criação de peixes.Continue injetando os peixes restantes e coloque-os em um único tanque de recuperação. Posteriormente, avalie as taxas de enxerto aos 10, 20 e 30 dias após o transplante utilizando microscopia de campo claro e microscopia de fluorescência em epifluorescência. Processe cada tumor separadamente.Sacrifique um peixe com rabdomiossarcoma embrionário. Coloque o peixe em uma placa de Petri limpa e dissecione o tumor dos tecidos não malignos utilizando uma lâmina de barbear e pinças finas. Uma dissecção cuidadosa ao redor do tumor resultará em maior pureza da suspensão celular obtida, com mínima contaminação por tecido muscular adjacente. Transfira o tumor dissecado para uma nova placa e adicione 100 microlitros de tampão de suspensão de PBS 0,9 X frio contendo 5% de FBS.Em seguida, pique o tecido com uma lâmina de barbear até obter uma suspensão homogênea. Em seguida, adicione mais 900 microlitros de tampão utilizando uma pipeta de um mililitro, seguido por trituração. Passe a suspensão pela pipeta várias vezes para dissociar as células.Agora filtre as células através de um filtro celular de 40 mícrons. Enxágue a placa adicionando dois a quatro mililitros adicionais de suspensão, tampão e filtre através do mesmo filtro celular. Concentre as células como anteriormente.Mantenha as células no gelo. Em seguida, re-suspenda as células em 100 microlitros de tampão e conte as células viáveis usando azul de tripano. Ajuste a concentração da suspensão celular para 5.000 células por microlitro.Em seguida, anestesie dois peixes-zebra receptores imunocomprometidos e coloque-os sobre uma toalha de papel limpa com o lado ventral voltado para cima. Usando uma agulha de seringa esterilizada de calibre 26, injete o volume desejado na cavidade peritoneal dos peixes-zebra receptores aqui.25.000 células são injetadas em cinco microlitros. No entanto, até 10 microlitros podem ser injetados com sucesso. Deixe os peixes injetados se recuperarem em um tanque de recuperação antes de devolvê-los ao sistema principal.Posteriormente, acompanhe os peixes receptores quanto ao enxerto utilizando microscopia de fluorescência epiluminescente e colete as células para estudos posteriores. Utilizando o procedimento descrito, células do músculo esquelético de doadores transgênicos de alfa actina RFP foram transplantadas para peixes-zebra imunocomprometidos homozigotos com mutação rag2. O tecido muscular esquelético produziu uma suspensão simples de células contendo 84,3% de células viáveis, conforme avaliado pela exclusão de DPI.Após a análise por citometria de fluxo, as células positivas para RFP compreendiam 35,3% dessa suspensão de células doadoras. O transplante de células para o músculo esquelético dorsal de peixes receptores RAG dois mutantes homozigotos resultou em enxertos consistentes e fortes. Isso foi confirmado pela formação de fibras musculares fluorescentes multinucleadas nos peixes receptores; peixes receptores selvagens não conseguiram incorporar as fibras musculares.No entanto, aos 10 dias pós-transplante, nove dos 14 peixes-zebra mutantes continham fibras musculares positivas para RFP próximas ao local de injeção. Importante, o músculo enxertado positivo para RFP persistiu por pelo menos 30 dias pós-transplante. De forma semelhante, obteve-se um enxerto robusto após o transplante de peixes mutantes RAG dois com rabdomiossarcoma embrionário ou ERMS.O ERMS enxertado compartilhava características histológicas com o tumor primário de ERMS, e a heterogeneidade das células tumorais foi mantida, conforme avaliado pela análise de fluorescência. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar transplantes musculares e transplantes intraperitoneais de tecidos normais e malignos utilizando peixes adultos imunocomprometidos como receptores. Após este procedimento, outros métodos, como classificação de células ativadas por fluorescência, análise de transplante em diluição limitante e PCR em tempo real, podem ser realizados para avaliar as diferenças funcionais e moleculares entre diferentes subpopulações tumorais.No geral, nossa abordagem permite o enxerto robusto e de longo prazo de tecido muscular fluorescente e tecido maligno em peixes imunocomprometidos com mutação no RAG dois. A vantagem desta abordagem é que o enxerto ocorre na ausência de supressão imunológica prévia dos peixes receptores e não requer compatibilidade imunológica entre os animais doadores e receptores.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

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