Name: Utilizando Murino Inducible telomerase alelos nos Estudos de degeneração / regeneração tecidual e Câncer (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Aprenda a manipular alelos de telomerase induzíveis em murinos para estudar degeneração e regeneração tecidual e câncer. Este método utiliza hidroxitamoxifeno para reativar a telomerase in vivo e in vitro.

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J.H. é apoiado pelo NIH K99/R00 Pathway to Independence Award (5K99CA172700) e NCI Brain Cancer SPORE Career Development Award (2P50CA127001).

NOTA: Todas as etapas deste protocolo foram aprovados pela UT MD Anderson Cancer Center. 1. Produção de mTERT-ER Alelo <ol><li> Introduzem knock-in contendo o vector de direccionamento ERT2-LBD (Ligand Binding Domain) a montante e na grelha com a sequência genómica mTERT (exão 1 através intrão 2) e um Lox - pgk - Neo - Lox fragmento (Figura 1A) em células ES de ratinho com electroporação. </li><li> Cultura as células ES em neomicina para 6-10 dias. Escolha clones resistentes à neomicina e expandir em placas de 48 poços. Extrair o DNA genômico utilizando um kit comercial e confirmar a knock-in alelo por Southern Blot. </li><li> Injectar duas linhas ES com mais de 95% cariótipo normal em C57BL / 6 blastocistos com um kit de micromanipulação sob um microscópio invertido. Implantar os blastocistos para o útero de mães de aluguel 23. Acoplar as quimeras masculinas de alto grau (70-90%) a C57BL / 6 femachos. </li><li> Confirme a genotipagem dos animais heterozigotos mTERT-ERneo por Southern Blot. </li><li> Companheiro os heterozigotos animais mTERT-ERneo e animais EIIa-Cre para excluir a cassete NeoR. Companheiro os animais heterozigotos para C57BL / 6 animais por pelo menos três vezes, e outras inter-raciais heterozigotos animais mTERT-ER para gerar homozygosity. </li></ol> 2. Geração de LSL-mTERT Alelo <ol><li> Introduzir o knock-in segmentação vector contendo um LoxP - Stopper triplo - Neo - fragmento LoxP ea seqüência genômica mTERT (entre exão 1 e intron 2, Figura 1B) em ratos com células ES eletroporação 23. </li><li> Cultura as células ES em neomicina para 6-10 dias. Escolha clones resistentes à neomicina e expandir em placas de 48 poços. Extrair o DNA genômico utilizando um kit comercial e confirmar a knock-in alelo por Southern Blot 23. </li><li> Inject dois ES linhas com mais de 95% cariótipo normal em camundongos C57BL / 6 blastocistos com um kit de micromanipulação sob um microscópio invertido. Implantar os blastocistos para o útero de mães de aluguel 23. Acoplar as quimeras masculinas de alto grau (70-90%) a C57BL / 6 fêmeas. </li><li> Confirme a genotipagem dos animais heterozigotos LSL-mTERT por Southern Blot. </li><li> Companheiro os animais heterozigotos para C57BL / 6 animais por pelo menos três vezes, e ainda mais inter-raciais heterozigotos animais LSL-mTERT para gerar homozygosity. </li></ol> 3. A reativação da telomerase em mTERT-ER e LSL-mTERT Mice In Vivo Para mTERT-ER <ol><li> Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos antes da injeção. </li><li> Anestesiar os ratos com isoflurano câmara (4% para indução e 2% para manutenção) em 50% (v / v) de oxigénio / 50% (v / v) de mistura de gás de monóxido de diazoto. Ou anestesiar ratos por uma mistura de cetamina-xilazina (100 mg / kg de peso corporal + 10 mg / kg de peso corporal). </li><li> Após a anestesia profunda for atingido, o animal anestesiado e remover a partir da câmara de indução, e manter a sua cabeça dentro do tubo ligado à câmara de isoflurano (2%). </li><li> Aperte os pés dos ratos para assegurar que o animal está profundamente anestesiados. Coloque pomada em ambos os olhos, a fim de evitar que os olhos sequem. Seque a parte traseira dos ratos com uma solução de povidona-iodo. </li><li> Injectar o pellet de libertação lenta 4-OHT trocarte com precisão (10 L), sob a pele das costas e empurrar o sedimento todo o caminho para a linha média entre dois ombros. </li><li> Selar a incisão com ferida aplicador de clipe e monitorar os ratos para recuperação da anestesia. Retire os clips 10 dias mais tarde. Calor suplementar não é necessário porque o procedimento esteja concluído em breve. </li><li> Período de tratamento com 4-OHT sedimento deve ser optimizado de acordo com o objectivo do estudo. </li></ol> Para LSL-mTERT &lt;ol&gt; <li> O tamoxifeno (10 mg / ml, dissolvida em óleo de milho) é injectado intraperitonealmente dois dias consecutivos (200 ul / 25 g / dia). </li></ol> 4. Isolamento de células-tronco neurais e reativação da telomerase In Vitro <ol><li> Os ratinhos são sacrificados com dióxido de carbono e os cérebros são removidos. Siga o protocolo de produtos comercialmente disponíveis kit dissociação tecido neural como por fabricante. </li><li> Ressuspender o pó liofilizado no frasco rotulado Solução 4 com 1 ml de meio de cultura celular para a Solução 4. Não vórtice. Esta solução deve então ser dividido em alíquotas e armazenado a -20 ° C para uso posterior. </li><li> Pré-aqueça a mistura a 37 ° C durante 15 min antes da utilização. </li><li> Adicione Enzyme Mix 1: Solução 1 (50 mL) e solução 2 (1.900 mL). Adicione Enzyme Mix 2: Solução 3 (20 ul) e solução de 4 (10 ul). </li><li> Preparar a mistura de enzima 1.950 ul para 1 até 400 mg de tecido e vortex. Pré-aquecer a mistura a 37 ° C durante15 min antes de usar. </li><li> Retire o mouse cérebros de 1 dia, e manter os prosencï¿½alos retirando os bulbos olfatórios e cerebelo. Mantenha os tecidos do cérebro anterior em 1 ml de meio de cultura frio desde remoção e armazenar em 4 ° C. Certifique-se para processar o tecido neural dentro de 1 hora. </li><li> Determinar o peso do tecido para garantir que o limite de 400 mg por digestão não seja excedida. Inserir o cérebro na tampa de 35 mm de diâmetro numa caixa de Petri, e esmagar o cérebro usando um bisturi. </li><li> Usando uma ponteira 1 ml, adicionar 1 ml de HBSS (w / o Ca / Mg) e peças de pipeta de volta em um tubo de 15 ml. Enxágüe com HBSS (w / o Ca / Mg). Centrifuga-se a 300 x g durante 2 minutos à temperatura ambiente e aspirar o sobrenadante cuidadosamente. </li><li> Adicionar 1950 mL de mistura de enzimas pré-aquecida (1 Soluções 1 e 2) por cima de 400 mg de tecido. Incubar no tubo de 15 mL durante 15 min a 37 ° C, misturando por inversão ou agitação do tubo a cada 5 min. </li><li> Prepare mistura de enzimas 30 ul 2 por amostra de tecido, adicionando 20 &amp; #956; l de solução de 3 e 10 ul de solução de 4. Em seguida, adicionar a amostra. Inverta suavemente para misturar. Não vortex. </li><li> Dissociar o tecido usando mecanicamente uma ampla de ponta, fogo-polido Pasteur pipeta pipetando cima e para baixo 10 vezes lentamente. Evite a formação de bolhas de ar. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 10 min, invertendo o tubo a cada 3 min. </li><li> Repita o passo 4.11 e 4.12 passo se os tecidos são maiores do que 200 mg. </li><li> Aplicar a suspensão de células para um filtro de células de 70 mm, colocada sobre um tubo de 50 ml. Aplicar 10 ml de PBS através de filtro de células. Descartar filtro de células de suspensão de células e centrifugação a 300 g durante 20 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante completamente. </li><li> Ressuspender as células com meio de células estaminais para o volume necessário para outras aplicações. </li><li> Para activar a telomerase em LSL-mTERT NSC, tratar as células com 100 | iM de 4-OHT para dois dias. Para ativar a telomerase em mTERT-er NSC, manter as células em meio de cultura com 100 M 4-OHT. </li></ol> 5. Telomere FISH <ol><li> Prepare os cromossomas metafásicos a partir de células cultivadas. </li><li> Para FFPE (fixados em formalina e embebidos em parafina) secções de tecido, Desparafinar em xileno e re-hidratados em série de etanol durante 5 minutos cada (100%, 90%, 70%, etanol a 50%) e PBS durante 5 min. </li><li> Pós-correcção em metanol: ácido acético (3: 1) durante 1-2 horas. Desidratar em série de etanol frio durante 5 minutos cada (70%, 90%, etanol a 100%) e ar seco. Lavar em 1x PBS a 37 ° C durante 5 min. </li><li> Desnaturar cromossomas em formaldeído a 4% a 37 ° C durante 2 min. Desidratar em série de etanol frio 5 min cada (70%, 90%, etanol a 100%) e ar seco. </li><li> Aplicar 12 a 25 ul da mistura de hibridação de PNA para cada lâmina. (Mistura de hibridação: 70% de formamida, 0.06x SSC, 0,2% de BSA, 0,5 ng / uL de ARNt, 0,5 ng / mL ou a telómeros sondas de centrómero) </li><li> Selar a lamela com cimento de borracha. Preparações cromossômicas Post-desnaturar e cortes de tecidos a 80 ° C para 4 min. A hibridização à temperatura ambiente ou a 37 ° C por 2-4 horas em câmara úmida. </li><li> Lavar à temperatura ambiente com tampão de lavagem 2 x 15 min. (Tampão de lavagem: 70% de formamida, SSC 0.06x, pH 7,2). Lave à temperatura ambiente 3 x 5 min com PBST. Lâminas Counter-mancha com DAPI ou fluorescência vermelha distante para exame microscópico. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Aqui, nós relatamos a geração de dois alelos telomerase murina induzidos e como reativar telomerase in vivo e in vitro. O passo fundamental para a reativação atividade mTERT-ER é manter uma concentração contínua do tamoxifeno, por isso optamos por usar 4-ESB peletes de libertação tempo fabricados pela Innovative Research of America. Os peletes manter libertando 4OHT a um nível de sangue no estado estacionário de 1 ng / ml para 60 dias. Em um estudo anterior, mostramos que a reativar a atividade da telomerase com esta estratégia foi capaz de melhorar os fenótipos degenerativas, como o esgotamento de células-tronco, insuficiência de respostas de lesão tecidual e falência de órgãos em vários órgãos que foram induzidos por disfunção dos telômeros em G4 mTERT ER / ER camundongos 20. Para além de se estudar a função de telomerase em envelhecimento, estes dois alelos de telomerase indutíveis também pode ser utilizado para estudar o cancro. Estudos anteriores levouvantagem desses alelos para explorar o papel de atrito dos telômeros e telomerase reativação na formação dos genomas e impactando a biologia do linfoma de células T do timo 21 e câncer de próstata 22. Estes dois estudos mostraram que a disfunção dos telômeros no final de geração G4 ATM - / - mTERT ER / ER e G4 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L camundongos fornece um mecanismo alimentando a captação de eventos mutagênicos antecipada para iniciação do tumor, mas impedindo a progressão de tumores completamente malignos. Quando a telomerase foi reactivado no contexto da instabilidade genómica induzidas por disfunção telomérica, checkpoints de dano de ADN e instabilidade cromossómica galopante foram suprimidos, permitindo o avanço completo de tumores malignos com novas propriedades biológicas tais como metástases ósseas do cancro da próstata e 21 infiltração cérebro de thymilinfoma c 21. Fenômenos semelhantes também foram observados em outros tipos de câncer, incluindo câncer de cólon e câncer de pâncreas (comunicações pessoais com Drs. Haoqiang Ying, Adam Boutin e Ronald DePinho). Porque a proteína TERT-ER pode ser facilmente ligada entre estados ligado e desligado, dependendo se os animais são tratados com tamoxifeno ou veículo, os modelos de tumor gerados pelo alelo mTERT-ER podem ser utilizados para testar a terapia anti-telomerase. Em estudo anterior, os tumores gerados no G4 ATM - / - mTERT ER animais / ER foram liberados de 4-OHT; no consumo de telomerase, os tumores eventualmente encolheu devido à reintegração do telômero induzida por disfunção checkpoints 21. No entanto, alguns dos tumores adquiriram resistência em resposta a telomerase extinção por activação de um alongamento de telómeros Alternativa (ALT) do mecanismo. Além disso caracterização destes tumores ALT + resistentes mostrou que they têm transcrição aberrante de genes envolvidos na biologia mitocondrial e defesa oxidativo incluindo um regulador mestre da síntese mitocondrial e oxidativa defesa PGC-1β. Knockdown de PGC-1β ou SOD2 (outro regulador de defesa oxidativo) elimina significativamente as células tumorais ALT + enquanto manter as células tumorais de telomerase + permanecem relativamente intacta 21. Uma limitação dessas dois alelos knock-in é que eles só podem proporcionar reactivação da telomerase ao nível endógeno porque eles são no locus nativo do gene da telomerase. Na maior parte dos cancros humanos, a telomerase é realmente sobre-expresso a um nível muito mais elevado. A fim de aumentar o nível de telomerase, uma modificação que pode considerar é inserir a construção mTERT-ER com um promotor mais forte, tal como PGK (fosfoglicerato quinase), promotor em Rosa26 local. Em conclusão, estes dois novos alelos indutíveis telomerase murino fornecer genet sem precedentesic ferramentas para estudar as funções de telomerase no envelhecimento e na homeostase dos tecidos, bem como a progressão do tumor, em especial sob o fundo do telómero instabilidade genómica induzidas por disfunção pré-adquirido. O alelo mTERT-ER também pode ser utilizado para estudar a terapia anti-telomerase, atravessando em outros modelos de tumor de rato propenso.

A telomerase é uma enzima responsável pela manutenção de telómeros. Estes são seqüências repetitivas nas extremidades dos cromossomos que protegem a sua integridade. Os componentes principais são holoenzima telomerase de uma subunidade catalítica da transcriptase reversa (TERT) e uma sub-unidade de RNA (TERC) que serve como molde para a adição do telomérica repete 1,2. Embora geralmente reprimida nas células somáticas diferenciadas, a telomerase exibe atividade robusta e desempenha papéis importantes em células germinativas, as células cancerígenas e as células-tronco. mTERC e mTERT ratinhos knockout fornecer grande em sistemas de modelos in vivo para estudar as funções de telomerase em ambas as células estaminais e cancro. O mTERC e mTERT camundongos knockout (G1) não apresentaram fenótipos óbvias devido ao longo reserva dos telômeros em camundongos 3. No entanto, em série intercruzamento mTERC e mTERT camundongos knockout para geração tarde (G5-G6) resultou emerosão progressiva dos telômeros e, eventualmente provocado degeneração grave de tecidos altamente proliferativas 4. Geração tardia (G5-G6) mTERC - / - ratos são inférteis devido às altas taxas de apoptose em depleção de células do testículo e germe. G5-G6 mTERC - / - ratos também apresentam fenótipos degenerativas nos tecidos altamente proliferativas incluindo medula óssea, intestino e pele, devido às altas taxas de apoptose e capacidade de auto-renovação com defeito na haste de tecido / progenitoras compartimentos celulares 4. As células estaminais hematopoiéticas da medula óssea de tarde geração mTERC - / - ratos de perda de exposição de potencial proliferativo, comprometida capacidade de auto-renovação, reforçada apoptose e, eventualmente, de exaustão funcional 5,6. Da mesma forma, o aumento progressivo dos corpos apoptóticos em criptas intestinais foram observadas em cada geração sucessiva de G1-G6 mTERC - / - ratos 7,8. Tele efeito deletério dos telómeros disfuncionais não parece estar limitada a tecidos de rotatividade desde que tanto a proliferação de células estaminais neuronais adultas in vitro e in vivo a neurogénese foram gravemente prejudicadas na geração final (G4-G5) mTERC - / - murganhos 9 . O papel da telomerase em células-tronco é ainda apoiada pelos achados em um ser humano desordem genética disceratose congênita rara (DKC), que em alguns aspectos se assemelha envelhecimento prematuro 10,11. DKC é causada por mutações em TERC, TERC, e os genes que codificam disquerina, uma subunidade da telomerase núcleo, e outras proteínas associadas 12 disquerina. Em média, os telômeros em pacientes DKC são mais curtos do que 99% dos controles pareados por idade. A maior morbidade da doença é devido a anemia aplástica, o que é causado pela manutenção deficiente de células-tronco hematopoiéticas. Outros aspectos da doença, tais como leucoplasia oral, distrofia ungueal, retardati mentaison, testículos atrofia e complicações pulmonares, tudo sugere funções das células-tronco de tecidos e células progenitoras 10, achados em concordância com aqueles prejudicada em geração tarde de camundongos knockout telomerase. Pacientes DKC são propensos a síndrome mielodisplásica e têm uma maior prevalência de neoplasias malignas da mucosa. Assim, a deficiência de telomerase em pacientes humanos recapitula os defeitos de funções das células-tronco e predisposição tumor que são observados em camundongos knockout telomerase tarde geração. Telômeros curtos e alta atividade de telomerase são características do câncer. Como as células normais ou pré-malignas dividir, a atividade da telomerase resultados baixos ou ausentes na eventual erosão dos telômeros e ativação de postos de controle celulares semelhantes aos provocados por ADN-breaks de cadeia dupla (DSBs) 13. Como LAP clássicos, disfunção dos telómeros foi mostrado para induzir a p53 associada e respostas celulares, tais como a senescência e / ou apoptosis 14,15. Após a inativação mutacional de p53, ciclo celular e na sobrevivência das células são reforçadas em células com disfunção dos telômeros, o que fornece um mecanismo mutadora pró-cancerígena caracterizada por translocações e amplificações regionais e supressões 16,17. Ao mesmo tempo, continuou disfunção telomérica e instabilidade cromossómica associada galopante (mesmo em células p53 nulos) parecem restringir completo progressão maligna de tais cancros. Por exemplo, no final geração G4-G5 mTERC - / - Ink4a / Arf - / - ratos mostraram incidência do linfoma significativamente reduzido em comparação com Ink4a / Arf camundongos nula devido ao atrito dos telômeros. Em outro estudo, as lesões adenomatosos mais avançadas no G4 mTERT - / - mínimo de camundongos APC foram fortemente reprimidos em comparação com APC min camundongos devido à paragem do crescimento significativo e apoptose 18,19. Oobservação de que telómero disfunção induzida por instabilidade genómica inibe a progressão do tumor solicita a especulação de que a activação da telomerase pode permitir a progressão maligna, em parte, por reprimir a instabilidade do genoma para um nível compatível com a viabilidade das células do cancro e / ou de neutralização dependente de p53 ou mecanismos independentes do checkpoint. A fim de estudar se telomerase reativação pode parar ou mesmo reverter o envelhecimento das células-tronco, e se telomerase reativação pode promover a tumorigenesis contra o pano de fundo de instabilidade genômica, geramos dois induzï¿½eis alelos telomerase murino. O primeiro é de 4 hidroxitamoxifeno (4-OHT) (mTERT-ER) fusão terc-Receptor de Estrógeno -inducible knock-in alelo. Na ausência de 4-OHT, os ratinhos homozigóticos para mTERT-ER (ER designado mTERT / ER) são deficientes em actividade de telomerase e sustentar mesmos fenótipos celulares e citogenética convencional ou como mTERT mModelo knockout TERC. Após 4-OHT tratamento, a atividade da proteína TERT-ER pode ser restaurado para níveis comparáveis ​​à proteína TERT nativo 20, 21. O segundo alelo é um romance TERT inducible knock-in alelo contendo uma cassete LoxP-Stopper-LoxP intronic (LSL- mTERT); após excisão de LSL Cre-mediada, mTERT é re-expressos sob mecanismos de controle de expressão endógena 22.

<table><tbody><tr><td>Leica AM6000 Kit de Micromanipulação</td><td>Leica</td><td>Per quote</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI6000 B microscópio invertido</td><td>Leica</td><td>Per quote</td><td></td></tr><tr><td>Neomicina</td><td>Tecnologias de vida</td><td>21810031</td><td></td></tr><tr><td>vaporizador de isoflurano</td><td>Sistemas de anestesia veterinária</td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>isoflurano</td><td>Henry Schein</td><td>1005796</td><td></td></tr><tr><td>mistura de cetamina-xilazina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K113-10ML</td><td></td></tr><tr><td>4-OHT pó</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7904-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxfien</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5648-1G</td><td></td></tr><tr><td>4-OHT pellet</td><td>Innovative Research of America</td><td>Custermized</td><td></td></tr><tr><td>Precision Trochar (10 Gauge)</td><td>Innovative Research of America</td><td>MP-182</td><td></td></tr><tr><td>clipe de ferida aplicador</td><td>Fischer Scientific</td><td>01-804</td><td></td></tr><tr><td>clip</td><td>Fischer Scientific</td><td>01-804-5</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Dissociação de Tecido Neural</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life technologies</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>xileno</td><td>Fischer Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>metanol</td><td>Fischer Scientific</td><td>A-433S4</td><td></td></tr><tr><td>ácido acético</td><td>Fischer Scientific</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>Fischer Scientific</td><td>22-032-104</td><td></td></tr><tr><td>formamida</td><td>Fischer Scientific</td><td>F84-1</td><td></td></tr><tr><td>PNA sonda de telômero</td><td>Panagene</td><td>F1001-5</td><td></td></tr><tr><td>PNA sonda de centrômero</td><td>Panagene</td><td>F3003-5</td><td></td></tr><tr><td>20X SSC</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP1325-4</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-10G</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5636-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>cimento de borracha</td><td>Walmart</td><td>Elmer's</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizando murino inducible telomerase alelos nos estudos de degeneração / regeneração tecidual e câncer

Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer

Perda da integridade do genoma e sua sinalização de danos ao DNA associados e respostas checkpoint Telomere disfunção induzida são drivers bem estabelecidas que causam a degeneração do tecido durante o envelhecimento. Câncer, com taxas de incidência aumenta muito com a idade, é caracterizada por comprimentos dos telômeros curtos e alta atividade de telomerase. Para estudar os papéis de disfunção dos telômeros e telomerase reativação no envelhecimento e câncer, o protocolo mostra como gerar dois murino telomerase inducible knock-in alelos 4 hidroxitamoxifeno (4-OHT) -inducible terc-Receptor de Estrógeno (mTERT-ER) e Lox -Stopper-Lox TERT (LSL-mTERT). O protocolo descreve os procedimentos para induzir disfunção dos telômeros e reativar a atividade da telomerase em camundongos mTERT-ER e LSL-mTERT in vivo. Os dados representativos mostram que a reactivação da actividade da telomerase pode melhorar os fenótipos degenerativas do tecido induzidas por disfunção telomérica. Em order para determinar o impacto de reactivação da telomerase na tumorigénese, geramos modelo de tumor de próstata G4 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L-LSL mTERT L / L e modelo de linfoma de células T do timo G4 Atm - / - mTERT ER / ER . Os dados representativos mostram que a reativação da telomerase no cenário de instabilidade genômica induzida pela disfunção dos telômeros pode aumentar consideravelmente tumorigenesis. O protocolo também descreve os procedimentos utilizados para isolar células estaminais neurais (NSCs) a partir de ratinhos mTERT-ER e LSV-mTERT e reactivar a actividade de telomerase in vitro em NSC. Os dados representativos mostram que a reactivação da telomerase pode aumentar a capacidade de auto-renovação e neurogenesis in vitro. Finalmente, o protocolo descreve os procedimentos para a realização dos telômeros FISH (Fluorescence Hibridização In Situ) em ambos FFPE rato (fixados em formalina e Paraffin embutidos) tecidos cerebrais e cromossomos metafásicos de células em cultura.

As estratégias para gerar murino mTERT-ER e LSL-mTERT knock-in alelos foram descritos na Figura 1A e 1B. Especificamente, um LoxP - Stopper triplo - Neo - fragmento LoxP foi inserido entre exão 1 e exão 2 de mTERT lócus para gerar alelo LSL-mTERT. Para gerar alelo mTERT-ER, domínio ERT2-LBD em grelha com o gene mTERT foi inserida no terminal N do exão 1. Nós mostramos que quando a telomerase foi transitoriamente reactivada em ratinhos disfunção dos telómeros, tratando-as com peletes de 4-OHT para 4 semanas, o fenótipo degenerativa poderia ser melhorado em vários órgãos, tais como tumores do cérebro (Figura 2A) e testículos (Figura 2B). A fim de determinar o impacto de reactivação da telomerase em células cultivadas in vitro, nós isolados de células estaminais neurais (NSCs) entre o final de geração G4 LSL-mTERT e G4 mTERTCamundongos -er. Mostrámos que, quando da telomerase foi reactivada em telómeros NSC disfuncionais, a capacidade de auto-renovação de NSC foi grandemente aumentada (Figura 3A), e em neurogenesis in vitro foi também significativamente melhorada (Figura 3B). De modo a determinar o impacto da telomerase reactivação em tumorigénese no contexto da disfunção telomérica, geramos PB-Cre4 Pten L / L-mTERT LSL / L (modelo de tumor de próstata) / L L L p53 e ATM - / - mTERT ER / ER (modelo de linfoma de células T do timo) coortes tarde geração. Quando a telomerase foi reactivada por tratamento com tamoxifeno nestes ratos com injecção (Figura 4A) ou peletes de 4-OHT, durante 8 semanas (Figura 4B), a tumorigénese foi grandemente melhorada em ambos modelo de tumor da próstata (Figura 4A) e modelo de linfoma de células T do timo ( <strong&gt; Figura 4B). Por fim, informamos os protocolos de realização dos telômeros FISH em tecidos cerebrais FFPE mouse (Figura 5) e cromossomos metafásicos (Figura 5, embutidas). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig1.jpg" /> Figura 1: (A) mTERT-ER knock-in estratégia. TV, visando vector; WT, alelo tipo selvagem; KI, knock-in alelo; LA, braço esquerdo; RA, braço direito; E1, o exão 1; E2, exão 2; neo, promotor PGK-driven gene resistente à neomicina; ER, domínio de ligação ao receptor de estrogénio modificado (ERT2) ligando; DT, dyphteria gene da toxina. (B) LSL-mTERT estratégia knock-in. TV, visando vector; WT, alelo tipo selvagem; KI, knock-in alelo; LA, braço esquerdo; RA, braço direito; E1, o exão 1; E2, exão 2; neo, promotor PGK-driven gene resistente à neomicina; ROLHA, três sequências de terminação da transcrição repetitivas; DT, dyphteria gene da toxina. <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: manter-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig2.jpg" /> Figura 2: Os dados representativos mostram que a telomerase reactivação melhora fenótipos degenerativas de órgãos Imagens representativas de cérebros (esquerda). e testículos (direito) de ratos G0 e G4 mTERT-ER tratados com placebo ou 4-OHT, durante 4 semanas. As barras de escala indicam 50 um. Re-print com a permissão de 20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52599/52599fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig3.jpg" /> Figura 3:. Os dados representativos mostram que a telomerase reactivação aumenta a auto-renovação e neurogénese de células estaminais neurais in vitro (A) Imagens representativas de células estaminais neuraiss isolados a partir de G4-LSL mTERT (painel superior) e G4 mTERT-ER (painel inferior) em crescimento em meio para mastócitos tratados com veículo ou 4-OHT. (B) Imagens representativas de neurogenesis in vitro (Tuj1 +) de células estaminais neurais isoladas de G4 mTERT ER-cultivadas em meio de diferenciação (com 1% de FBS) tratado com veículo ou 4-OHT. As barras de escala indicam 100 um. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig4.jpg" /> Figura 4:. Os dados representativos para mostrar telomerase reativação aumenta tumorigenesis contra o pano de fundo de instabilidade genômica (A) Imagens representativas de tumores de próstata dissecados de G0 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT +/-, G4 PB- Cre4 Pten L / L p53 L / L-LSL mTERT- / -, E G4 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L-LSL mTERT L / L tratados com tamoxifeno. Re-imprimir com a permissão de 22. (B) Imagens representativas de linfomas de células T do timo dissecados a partir G0 Atm - / - mTERT + / ER, G4 Atm - / - mTERT ER / ER tratados com veículo, e G4 Atm - / - mTERT ER / ER tratada com 4- OHT durante 8 semanas. As barras de escala indicam 1 cm. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig5.jpg" /> Figura 5: Imagens representativas de telomeric e FISH centromeric no tecido cerebral FFPE mouse e metaphase (no detalhe). O vermelho indica DNA, verde indica coloração dos telômeros, e ciano indica cecoloração ntromere. Barras de escala indicam um milímetro.

Telômero e telomerase desempenham papéis essenciais no envelhecimento e na tumorigênese. O objetivo deste protocolo é mostrar como gerar dois alelos knock-in de telomerase induzíveis por murinos e como utilizá-los nos estudos de degeneração/regeneração tecidual e câncer.

Utilizando Murino Inducible telomerase alelos nos Estudos de degeneração / regeneração tecidual e Câncer

Telomere dysfunction-induced loss of genome integrity and its associated DNA damage signaling and checkpoint responses are well-established drivers that ...

O objetivo geral do experimento a seguir é manipular dois alelos de batida mase induzíveis murinos in vivo e in vitro para estudos de degeneração e regeneração tecidual e estudos de câncer. Isso é conseguido implantando comprimidos de hidroxitamoxifeno em animais para reativar mase in vivo. Como segunda etapa, as células-tronco neurais são isoladas de animais que são então tratadas com hidroxi tamoxifeno para reativar mase in vitro.Em seguida, a fluorescência dos telômeros em C dois hibridização ou peixe é realizada em células cultivadas e tecidos cerebrais formais e fixados embebidos em parafina, a fim de verificar a atividade do mase. Os resultados mostraram que os tratamentos com hidroxitamoxifeno podem reativar de forma robusta a atividade mase, o que pode aliviar os fenótipos do envelhecimento e promover a formação de tumores com base no exame histopatológico. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos do envelhecimento e do câncer, como se podemos ou não retardar o processo de envelhecimento modulando a atividade do trauma do HT ou como direcionar especificamente Thomas para tratar o câncer.Demonstrando este procedimento estará o instrutor Dr.Takashi Shingu e um técnico April Un do meu laboratório. Comece este procedimento com a geração do Turt ER e bloqueie os alelos de turt de bloqueio de parada conforme descrito no protocolo de texto, esterilize todas as ferramentas cirúrgicas antes da injeção, prossiga para anestesiar os camundongos conforme descrito no protocolo de texto. Após a anestesia profunda, remova o animal anestesiado da câmara de indução e mantenha a cabeça dentro do tubo conectado à câmara de flúor iso.Aperte as almofadas das patas dos ratos para garantir que o animal esteja profundamente anestesiado. Coloque também pomada em ambos os olhos Para evitar que os olhos se desenhem, limpe as costas dos ratos com solução de iodopovidona. Em seguida, injete um pellet de hidroxitamoxifeno de liberação lenta com um trocarte de precisão sob a pele das costas.E empurre o pellet até a linha média entre dois ombros. Sele a incisão com um aplicador de clipe de ferida e monitore os camundongos quanto à recuperação. Para anestesia.Retire os cérebros de camundongos de um dia e mantenha os quatro cérebros removendo os bulbos olfativos e o cerebelo. Mantenha os quatro tecidos cerebrais em um mililitro de meio de cultura a frio e armazene a quatro graus Celsius. Certifique-se de processar o tecido neural dentro de uma hora.Determine o peso do tecido para garantir que o limite de 400 miligramas por digestão não seja excedido. Coloque o cérebro na tampa de uma placa de Petri de 35 milímetros de diâmetro e esmague o cérebro usando um bisturi. Usando uma ponta de pipeta de um mililitro, adicione um mililitro de solução salina de equilíbrio de Hank ou HBSS.Em seguida, pipetar os pedaços de volta para um tubo de 15 mililitros após enxágue com centrífuga HBSS a 300 vezes G por dois minutos em temperatura ambiente. Depois de remover cuidadosamente o sobrenadante, adicione 1.950 microlitros de enzima pré-aquecida. Misture um por até 400 miligramas de tecido.Incubar a amostra no tubo de 15 mililitros durante 15 minutos a 37 graus Celsius. Misturar a amostra invertendo ou agitando o tubo de cinco em cinco minutos. Em seguida, prepare 30 microlitros de enzima Misture dois por amostra de tecido adicionando 20 microlitros de solução, três a 10 microlitros de solução quatro.Em seguida, adicione à amostra invertendo suavemente para misturar, dissocie o tecido mecanicamente usando uma pipeta de pasta polida a fogo de ponta larga, pipetando para cima e para baixo 10 vezes lentamente, evitando a formação de bolhas de ar. Incube a 37 graus Celsius por 10 minutos, invertendo o tubo a cada três minutos. Em seguida, aplique a suspensão celular em um filtro de células de 70 mícrons colocado em um tubo de 50 mililitros.Aplique 10 mililitros de solução salina tamponada com fosfato ou PBS através do filtro de células. Em seguida, rejeitar o filtro de células e centrifugar a suspensão de células a 300 vezes G durante 20 minutos. Defina a temperatura ambiente após a centrifugação, aspire completamente o sobrenadante.Ressuspenda as células com meio de células-tronco até o volume necessário para outras aplicações para ativar a telematriz em fechaduras, travas de parada. Células-tronco neurais de Turt. Trate as células com 100 micromolares hidroxi tamoxifeno por dois dias para ativar as células-tronco neurais emase e turtér.Mantenha as células em meio de cultura com hidroxitamoxifeno 100 micromolares para realizar peixes telômeros. Primeiro, prepare os cromossomos metafásicos de células cultivadas para seções de tecido fixadas em formalina e embebidas em parafina ou FFPE. Analisar a amostra em xileno e reidratar em série de etanol durante cinco minutos cada e em PBS durante cinco minutos.Em seguida, fixe as seções em uma proporção de três para um de metanol para ácido acético por uma a duas horas. Desidrate as seções em uma série de etanol frio por cinco minutos cada e lave a seco ao ar em um XPBS a 37 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, na natureza, os cromossomos em 4% de formaldeído a 37 graus Celsius por dois minutos.Desidrate as seções em uma série de etanol frio como antes e seque ao ar depois de seco, aplique 12 a 25 microlitros da mistura de hibridização de ácido nucleico peptídico em cada lâmina. Sele a lamínula com cimento de borracha postando preparações cromossômicas naturais e seções de tecido a 80 graus Celsius por quatro minutos. Em seguida, hibridize em temperatura ambiente ou 37 graus Celsius por duas a quatro horas em uma câmara úmida.Em seguida, lave as amostras em temperatura ambiente com tampão de lavagem por 15 minutos duas vezes. Em seguida, lave-os em temperatura ambiente por cinco minutos com PBS e interpole 23 vezes. Por fim, contra-core as lâminas com DPI ou fluorescência vermelha distante para exame microscópico.Quando os telômeros foram reativados transitoriamente em camundongos disfuncionais com telômeros, os fenótipos degenerativos puderam ser melhorados em vários órgãos, como o cérebro e os testículos, para determinar o impacto da reativação dos telômeros nas células. Células-tronco neurais in vitro cultivadas foram isoladas de camundongos G four lock stop locks de última geração, TURT e G quatro turt ER. Quando os telômeros foram reativados em células-tronco neurais disfuncionais dos telômeros, a capacidade de auto-renovação aumentou muito.A neurogênese in vitro também foi significativamente aprimorada para determinar o impacto da reativação do mase na tumorgênese no contexto da disfunção dos telômeros, a reativação do mase pelo tratamento com tamoxifeno foi realizada em um modelo de tumor de próstata. Modelo de linfoma endotético de células T. O tratamento resultou em tumorgênese muito aumentada em ambos os modelos.Por fim, os peixes telômeros foram realizados em FFPE, tecidos cerebrais de camundongos e cromossomos metafásicos. Nessas imagens, vermelho indica DNA verde, indica coloração de telômeros e ciano indica coloração de centrômero. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como ativar a atividade de trauma no mTOR ER e travar bloqueios, animais mTOR e linhagens celulares, e como usá-los para estudar suas perguntas sobre câncer e agente.

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