Utilizando Murino Inducible telomerase alelos nos Estudos de degeneração / regeneração tecidual e Câncer

O objetivo geral do experimento a seguir é manipular dois alelos de batida mase induzíveis murinos in vivo e in vitro para estudos de degeneração e regeneração tecidual e estudos de câncer. Isso é conseguido implantando comprimidos de hidroxitamoxifeno em animais para reativar mase in vivo. Como segunda etapa, as células-tronco neurais são isoladas de animais que são então tratadas com hidroxi tamoxifeno para reativar mase in vitro.

Em seguida, a fluorescência dos telômeros em C dois hibridização ou peixe é realizada em células cultivadas e tecidos cerebrais formais e fixados embebidos em parafina, a fim de verificar a atividade do mase. Os resultados mostraram que os tratamentos com hidroxitamoxifeno podem reativar de forma robusta a atividade mase, o que pode aliviar os fenótipos do envelhecimento e promover a formação de tumores com base no exame histopatológico. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos do envelhecimento e do câncer, como se podemos ou não retardar o processo de envelhecimento modulando a atividade do trauma do HT ou como direcionar especificamente Thomas para tratar o câncer.

Demonstrando este procedimento estará o instrutor Dr.Takashi Shingu e um técnico April Un do meu laboratório. Comece este procedimento com a geração do Turt ER e bloqueie os alelos de turt de bloqueio de parada conforme descrito no protocolo de texto, esterilize todas as ferramentas cirúrgicas antes da injeção, prossiga para anestesiar os camundongos conforme descrito no protocolo de texto. Após a anestesia profunda, remova o animal anestesiado da câmara de indução e mantenha a cabeça dentro do tubo conectado à câmara de flúor iso.

Aperte as almofadas das patas dos ratos para garantir que o animal esteja profundamente anestesiado. Coloque também pomada em ambos os olhos Para evitar que os olhos se desenhem, limpe as costas dos ratos com solução de iodopovidona. Em seguida, injete um pellet de hidroxitamoxifeno de liberação lenta com um trocarte de precisão sob a pele das costas.

E empurre o pellet até a linha média entre dois ombros. Sele a incisão com um aplicador de clipe de ferida e monitore os camundongos quanto à recuperação. Para anestesia.

Retire os cérebros de camundongos de um dia e mantenha os quatro cérebros removendo os bulbos olfativos e o cerebelo. Mantenha os quatro tecidos cerebrais em um mililitro de meio de cultura a frio e armazene a quatro graus Celsius. Certifique-se de processar o tecido neural dentro de uma hora.

Determine o peso do tecido para garantir que o limite de 400 miligramas por digestão não seja excedido. Coloque o cérebro na tampa de uma placa de Petri de 35 milímetros de diâmetro e esmague o cérebro usando um bisturi. Usando uma ponta de pipeta de um mililitro, adicione um mililitro de solução salina de equilíbrio de Hank ou HBSS.

Em seguida, pipetar os pedaços de volta para um tubo de 15 mililitros após enxágue com centrífuga HBSS a 300 vezes G por dois minutos em temperatura ambiente. Depois de remover cuidadosamente o sobrenadante, adicione 1.950 microlitros de enzima pré-aquecida. Misture um por até 400 miligramas de tecido.

Incubar a amostra no tubo de 15 mililitros durante 15 minutos a 37 graus Celsius. Misturar a amostra invertendo ou agitando o tubo de cinco em cinco minutos. Em seguida, prepare 30 microlitros de enzima Misture dois por amostra de tecido adicionando 20 microlitros de solução, três a 10 microlitros de solução quatro.

Em seguida, adicione à amostra invertendo suavemente para misturar, dissocie o tecido mecanicamente usando uma pipeta de pasta polida a fogo de ponta larga, pipetando para cima e para baixo 10 vezes lentamente, evitando a formação de bolhas de ar. Incube a 37 graus Celsius por 10 minutos, invertendo o tubo a cada três minutos. Em seguida, aplique a suspensão celular em um filtro de células de 70 mícrons colocado em um tubo de 50 mililitros.

Aplique 10 mililitros de solução salina tamponada com fosfato ou PBS através do filtro de células. Em seguida, rejeitar o filtro de células e centrifugar a suspensão de células a 300 vezes G durante 20 minutos. Defina a temperatura ambiente após a centrifugação, aspire completamente o sobrenadante.

Ressuspenda as células com meio de células-tronco até o volume necessário para outras aplicações para ativar a telematriz em fechaduras, travas de parada. Células-tronco neurais de Turt. Trate as células com 100 micromolares hidroxi tamoxifeno por dois dias para ativar as células-tronco neurais emase e turtér.

Mantenha as células em meio de cultura com hidroxitamoxifeno 100 micromolares para realizar peixes telômeros. Primeiro, prepare os cromossomos metafásicos de células cultivadas para seções de tecido fixadas em formalina e embebidas em parafina ou FFPE. Analisar a amostra em xileno e reidratar em série de etanol durante cinco minutos cada e em PBS durante cinco minutos.

Em seguida, fixe as seções em uma proporção de três para um de metanol para ácido acético por uma a duas horas. Desidrate as seções em uma série de etanol frio por cinco minutos cada e lave a seco ao ar em um XPBS a 37 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, na natureza, os cromossomos em 4% de formaldeído a 37 graus Celsius por dois minutos.

Desidrate as seções em uma série de etanol frio como antes e seque ao ar depois de seco, aplique 12 a 25 microlitros da mistura de hibridização de ácido nucleico peptídico em cada lâmina. Sele a lamínula com cimento de borracha postando preparações cromossômicas naturais e seções de tecido a 80 graus Celsius por quatro minutos. Em seguida, hibridize em temperatura ambiente ou 37 graus Celsius por duas a quatro horas em uma câmara úmida.

Em seguida, lave as amostras em temperatura ambiente com tampão de lavagem por 15 minutos duas vezes. Em seguida, lave-os em temperatura ambiente por cinco minutos com PBS e interpole 23 vezes. Por fim, contra-core as lâminas com DPI ou fluorescência vermelha distante para exame microscópico.

Quando os telômeros foram reativados transitoriamente em camundongos disfuncionais com telômeros, os fenótipos degenerativos puderam ser melhorados em vários órgãos, como o cérebro e os testículos, para determinar o impacto da reativação dos telômeros nas células. Células-tronco neurais in vitro cultivadas foram isoladas de camundongos G four lock stop locks de última geração, TURT e G quatro turt ER. Quando os telômeros foram reativados em células-tronco neurais disfuncionais dos telômeros, a capacidade de auto-renovação aumentou muito.

A neurogênese in vitro também foi significativamente aprimorada para determinar o impacto da reativação do mase na tumorgênese no contexto da disfunção dos telômeros, a reativação do mase pelo tratamento com tamoxifeno foi realizada em um modelo de tumor de próstata. Modelo de linfoma endotético de células T. O tratamento resultou em tumorgênese muito aumentada em ambos os modelos.

Por fim, os peixes telômeros foram realizados em FFPE, tecidos cerebrais de camundongos e cromossomos metafásicos. Nessas imagens, vermelho indica DNA verde, indica coloração de telômeros e ciano indica coloração de centrômero. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como ativar a atividade de trauma no mTOR ER e travar bloqueios, animais mTOR e linhagens celulares, e como usá-los para estudar suas perguntas sobre câncer e agente.