Funcional e morfológica de Avaliação de Diafragma Innervation por frênico Neurônios Motores

O objetivo geral deste procedimento é avaliar quantitativamente a inervação funcional e morfológica do diafragma pelos neurônios motores frênicos da medula espinhal cervical. Isso é realizado através da realização do registro do potencial de ação muscular composto a partir do hemidiafragma em animais anestesiados após estimulação supramáxima do nervo frênico ipsilateral. O próximo passo é realizar a imuno-histoquímica do diafragma de montagem total para avaliar morfologicamente a inervação de junções neuromusculares individuais.

Em última análise, a combinação de análises compostas de potencial de ação muscular e junção neuromuscular fornece uma abordagem poderosa para estudar quantitativamente a inervação diafragmática em modelos de roedores da doença do SNC e do SNP. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da lesão medular, como as intervenções terapêuticas podem ser usadas para restaurar com sucesso a função diafragmática? As implicações desta técnica se estendem à terapia para doenças como lesão traumática da medula espinhal e ILS, porque a função respiratória diafragmática desempenha um papel fundamental no resultado do paciente em ambas as condições debilitantes, Demonstrando o procedimento estará o Dr. Kali, um pós-doutorado em meu laboratório, Melanie Martin, uma estudante de graduação no laboratório do Dr. Wright, e Tamara Holla, uma técnica de pesquisa em meu laboratório.

Depois de anestesiar o animal, coloque-o na prancha cirúrgica, com o lado dorsal voltado para baixo e prenda os membros anteriores à prancha. Em seguida, raspe a superfície ventral da base do crânio em direção ao abdômen em ambos os lados da linha média. Uma vez limpa a pele, posicione os eletrodos, prenda o solo à cauda e coloque o eletrodo de referência no abdômen inferior contralateral por via subcutânea.

O eletrodo de registro deve ser preparado com gel condutor na porção autoadesiva e, em seguida, fixado ao longo da margem costal unilateral. Agora coloque os eletrodos estimulantes, transcutâneos a meio centímetro de distância, laterais à traqueia e superiores à clavícula. Eles devem entrar perpendicularmente à pele e ter cerca de um centímetro de profundidade.

Esses eletrodos devem ser bem presos, melhor feitos manualmente. Conecte todos os eletrodos aos seus estimuladores e amplificadores apropriados. Os dados coletados devem ser gravados em um computador.

Para análise, defina os parâmetros de estímulo da estimulação unipolar para 0,5 milissegundos, pulsos supermáximos de um hertz. A amplitude pode variar de seis a oito volts. Defina o tempo de estimulação de interesse para 30 segundos e calcule a média da resposta de 10 estímulos consecutivos usando a linha de base para registrar a amplitude de pico de cada animal cerca de uma vez por semana, se desejado.

O manejo dos animais é detalhado no protocolo de texto. Depois de sacrificar um animal usando uma overdose de anestesia injetável, faça uma laparotomia usando bisturi ou tesoura. Faça uma incisão do processo xifóide ao longo da linha média.

Em seguida, usando um bisturi e uma pinça, separe cuidadosamente a pele e o tecido conjuntivo da musculatura. Remova o diafragma puxando o processo xifóide e cortando o diafragma do osso circundante. Tenha cuidado para não danificar o músculo diafragma.

Transfira o lado superior do diafragma para uma placa de linha de silicone preenchida com aldeído paraforme 4% em PBS sob um estereoscópio. Prenda o tecido ao redor do diafragma, esticando o diafragma. Em seguida, remova o tecido conjuntivo da superfície superior usando uma pinça e uma tesoura.

Deixe o fixador agir por 20 minutos e depois remova-o usando três lavagens de 10 minutos em PBS. Em seguida, aplique glicina molar 0,1 com 2% BSA em PBS por 30 minutos. Em seguida, incubar o diafragma em solução de toin alfa conjugada com Domine por 15 minutos.

Lave a toxina do bangalô com PBS como feito para o fixador. Em seguida, mude o banho para metanol frio e resfrie o tecido por cinco minutos a 20 graus Celsius negativos. Após cinco minutos imediatamente, remova o metanol e lave o tecido com PBS como antes.

Agora, aplique um bloco usando solução de 0,2% TBP por uma hora. Troque a solução para o anticorpo primário em 0,2% TBP e deixe o tecido incubar durante a noite a quatro graus Celsius com agitação suave. No dia seguinte, use três lavagens de 10 minutos em 0,2% TBP para remover o anticorpo primário e, em seguida, incube o tecido na solução de anticorpo secundário por uma hora com balanço e no escuro mais tarde, use três lavagens em PBS para remover o anticorpo secundário e manter o tecido no escuro.

Em seguida, sob um estereoscópio, remova mais tecido conjuntivo na superfície superior do músculo. Uma vez limpo, monte e visualize o tecido sob um microscópio de epifluorescência vertical, analise quantitativamente a morfologia do hemidiafragma corado. Use ampliação de 20 e 40 x Porque o diafragma é analisado como uma montagem inteira.

A maior parte da coloração fluorescente está fora de foco. Usando um microscópio padrão, é melhor realizar a análise em tempo real. Para pontuar adequadamente a morfologia do NM js individual, divida o músculo em três seções para análise com base nos padrões topográficos de inervação da medula espinhal.

Começando na região da maioria ventral, analise todos os njs visíveis ao longo das fibras musculares, não analise mais profundamente do que as primeiras três a quatro fibras da superfície porque a penetração dos anticorpos nunca é completa. Um NMJ intacto tem um axônio pré-terminal que é espesso e todas as regiões do terminal nervoso se sobrepõem completamente aos receptores de acetilcolina muscular subjacentes. Uma JNM parcialmente enervada terá algumas regiões dos receptores de acetilcolina subjacentes desocupadas.

Uma JNM completamente desnervada não mostrará correspondência com os receptores de acetilcolina no terminal nervoso. Outros njs na região devem mostrar outra morfologia ou o sucesso dos anticorpos A penetração estaria em questão se mais de um axônio pré-terminal inerva uma JNM. O NMJ é multiplicado.

A desnervação inervada pode ter ocorrido neste caso, seguida de reinervação. Se houver sobreposição no terminal nervoso com os receptores de acetilcolina subjacentes e o axônio pré-terminal for muito fino, a JNM é finamente inervada. Isso também é uma indicação de reação.

Em um experimento envolvendo spra adulta, os controles de ratos Dolly receberam uma laminectomia, enquanto outros receberam uma lesão medular unilateral de hemicontusão. Em C quatro. Cinco semanas depois, o pico de amplitude do cmap foi registrado do hemidiafragma ipsilateral até a laminectomia ou local da lesão.

Foi significativamente reduzido nos ratos SCI em comparação com os ratos de controle apenas laminectomia em um experimento diferente envolvendo ratos que expressam mutação humana, então D uma proteína para servir como modelo de um LS. A morfologia da JNM no hemidiafragma estava completamente intacta em animais controle do tipo selvagem. No entanto, nos ratos transgênicos, o njs apresentou patologia significativa. Alguns mostraram desnervação completa marcada pela ponta da flecha.

Outros njs foram parcialmente desnervados, marcados pela ponta da flecha e, como visto no NMJ à direita, outros njs foram inervados multiplicamente, e outros tinham axônios pré-terminais finos aqui marcados com uma ponta de flecha. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como avaliar quantitativamente a inervação funcional e morfológica do diafragma pelos neurônios motores frênicos. Obrigado por assistir e boa sorte com todos os seus experimentos.