Long Term Intravital Multiphoton Microscopia de imagem de células imunes no saudáveis ​​e doentes do fígado por meio CXCR6.Gfp Reporter Mice

O objetivo geral do experimento a seguir é acompanhar a migração e a interação dos leucócitos em uma doença inflamatória hepática em progresso. Para compreender melhor a sequência de eventos subjacentes ao recrutamento dessas células para o tecido hepático e seu possível envolvimento na imunopatologia. Isso é conseguido primeiramente realizando uma traqueotomia para obter controle sobre a respiração do camundongo, um passo crucial para garantir a sobrevivência prolongada do animal.

Como segundo passo, realiza-se uma laparotomia no camundongo para expor cirurgicamente o fígado, permitindo o acesso ao órgão com o microscópio de múltiplos fótons. Em seguida, o fígado é fixado e posicionado mediante sua imersão em agarose, a fim de minimizar artefatos de movimento. A aquisição de imagens pode ser realizada durante várias horas, gerando sequências de alta resolução com lapso de tempo que acompanham as alterações no recrutamento, posicionamento e interação de leucócitos individuais.

No processo de desenvolvimento da inflamação hepática, este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da inflamação hepática aguda e crônica, como o recrutamento de leucócitos, interações entre células ou mecanismos de imunopatologia. A principal vantagem desta técnica em comparação com a microscopia convencional é que a microscopia multifocal permite a obtenção de imagens de longa duração com praticamente nenhuma perturbação da amostra, baixo branqueamento do corante ou fototoxicidade, além de cortes ópticos com profundidade de até 100 micrômetros no tecido, o que se deve à física única do laser de luz no espectro vermelho distante. Este método pode, portanto, fornecer informações sobre doenças hepáticas.

Pode ser facilmente adaptado a outros sistemas. Uma vez que o método de estabilização e fixação do tecido pode ser aplicado a praticamente todas as questões de microscopia intravital, é possível obter imagens facilmente de órgãos como baço, rim ou até tumores subcutâneos usando células relacionadas fluentes. Também é possível visualizar todos os subconjuntos de leucócitos e observar suas interações e a inflamação hepática.

Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades devido à extrema complexidade da cirurgia em pequenos animais. No entanto, devido à nossa própria experiência, esse é apenas um fator limitante por algumas semanas e exige apenas alguma prática prática. Devido à fragilidade do tecido hepático, os passos de preparação são difíceis de aprender, e a demonstração visual do método é essencial. Após preparar os anestésicos, encha o estágio de aro do camundongo com 3%aros, despejando-o em um ângulo de 40 graus.

Em seguida, certifique-se de que a área cirúrgica esteja completamente desinfetada, assim como todos os instrumentos necessários e demais itens. Então, anestesie o camundongo por meio de uma injeção intraperitoneal de um coquetel anestésico. Cinco minutos depois, verifique os reflexos do animal, desinfete a pele e aplique pomada oftálmica nos olhos.

Agora, fixe o camundongo à mesa de preparação. Usando fita adesiva, posicione-o de modo a expor suavemente a face ventral, esticando levemente o pescoço. Uma faixa de borracha presa aos incisivos pode conseguir isso.

Agora, realize uma incisão inicial abaixo do queixo, com cerca de 0,5 a um centímetro de comprimento. Em seguida, dissecar cuidadosamente o tecido conjuntivo entre as glândulas salivares e localize o tubo muscular que envolve a traqueia. Rasgue suavemente o músculo para expor a traqueia.

Puxe um fio sob a traqueia, em seguida abra a traqueia com tesoura microcirúrgica usando uma incisão em forma de T. Insira o tubo de ventilação cerca de meio centímetro. Avance o tubo utilizando pinça anatômica pequena.

Em seguida, fixe o tubo com pontos de sutura. Depois, para maior segurança, suture o tubo à pele, feche a incisão na pele usando cianoacrilato e fixe o tubo à cabeça do animal. Usando fita adesiva, mantenha a anestesia com um fluxo contínuo de 2% iso fluorina.

Após preparar o camundongo para cirurgia, faça uma pequena incisão na pele abaixo do esterno e prolongue o corte lateralmente abaixo das costelas em ambos os lados. Cauterize todos os vasos sanguíneos expostos nesse processo. Para minimizar o sangramento, realize um pequeno corte inicial na linha do cotovelo para obter acesso à cavidade abdominal.

Estenda o corte horizontalmente, selando todos os vasos sanguíneos e obtendo acesso ao fígado. Agora, transfira o camundongo para a plataforma de trabalho e empilhe lâminas em ambos os lados do animal para ajudar a mantê-lo no lugar. Essas pilhas devem ter a mesma altura do camundongo, de modo que a plataforma para o fígado, que será colocada posteriormente, não exerça pressão excessiva sobre o abdômen.

Agora, utilizando pontos na esterno, afaste as costelas. Um fio 4-0 será suficiente. Após afastar as costelas, corte os ligamentos que conectam o fígado e o diafragma, cortando até a aorta, mas trabalhe com extrema cautela para não romper ou cortar o vaso. Corte também o ligamento que conecta o fígado ao trato gastrointestinal.

Gire o rato 45 graus para melhorar o acesso ao lobo hepático maior. Pegue um lamínula padrão e fixe fita ao longo de suas bordas para que não fiquem afiadas. Coloque-a sobre a cavidade abdominal.

Isso servirá como uma plataforma para posicionar o fígado sobre a platina. Deslize cuidadosamente uma sonda com ponta dupla esférica ou uma espátula acolchoada sob o fígado e segure a parte superior do órgão. O uso de pressão com um tecido úmido lesará imediatamente o tecido hepático, portanto é essencial manipular o órgão com cuidado.

Em seguida, levante o lobo sobre a lâmina e puxe-o suavemente para a posição desejada. O lobo geralmente terminará dobrado ou encurvado; tente desdobrar as bordas levantando o tecido com uma espátula fina ou um pedaço de tecido úmido. A seguir, adicione suportes laterais na forma de lamínulas ou lâminas.

Empilhe as lamínulas para que tenham a mesma altura do lobo hepático. O posicionamento e fixação do fígado são as etapas mais cruciais do protocolo. Qualquer estresse mecânico, torção ou pressão provocará dano tecidual imediato ou, pelo menos, fluxo sanguíneo prejudicado nos vasos sinusoidais.

Agora, coloque uma lamínula grande com as bordas coladas sobre o lobo hepático apoiado pelos suportes laterais. Posicione esta lamínula da forma mais nivelada possível. Ela não deve comprimir o fígado.

O tecido branco indica fluxo sanguíneo comprometido, a menos que a aquisição de imagem seja rápida. Agora é necessário inserir dois cateteres intraperitoneais independentes para fornecer anestesia de longa duração e aplicar G cinco. Eles são montados a partir de agulhas de calibre 27 e tubos de silicone flexíveis.

Em seguida, inicie o fluxo utilizando bombas de seringa. Insira os cateteres no abdômen inferior próximo às patas traseiras. Após conectar os monitores vitais ao camundongo, prepare 100 mililitros de 3%aros em um XPBS.

Quando o aros esfriar a 41 graus Celsius, incorpore o fígado utilizando uma seringa de cinco mililitros com agulha de 18 gauge. Após o aros ter esfriado, use uma espátula Heideman para remover o excesso e expor um campo de visão suficientemente grande para escanear o fígado. Em seguida, prossiga com a varredura.

Após o preparo do campo de visão, mova o camundongo sob o microscópio para selecionar áreas apropriadas para a aquisição de imagens em lapso de tempo. O tecido hepático é examinado visualmente utilizando uma fonte externa de luz branca, identificando campos representativos com fluxo sanguíneo suficiente e mínima perturbação da amostra. Camundongos heterozigotos CXCR6 GFP foram submetidos à imagem intravital T-P-L-S-M como experimento. Alguns receberam injeção intraperitoneal de tetracloro para induzir dano hepático agudo.

Células modais que expressavam GFP foram rastreadas por vídeo e suas trajetórias foram sobrepostas para obter um instantâneo da mobilidade celular. Em seguida, as trajetórias foram normalizadas. Fígados normais apresentavam células com padrões de migração aleatórios.

Fígados injetados com CCI quatro apresentaram um comprometimento na migração celular. Ao medir o deslocamento total a partir de sua origem, ficou evidente que houve aprisionamento celular 36 horas após o tratamento com CCI quatro no local da lesão hepatocelular. O comprometimento da migração devido ao dano hepático também pôde ser demonstrado ao traçar a velocidade de migração de células individuais ao longo do tempo, mostrando uma parada parcial após 18 horas e uma parada migratória completa após 36 horas.

A redução na velocidade das células migratórias também pode ser demonstrada como estatisticamente significativa quando as células são comparadas como populações. Assim, esta abordagem é adequada para acompanhar alterações na migração e posicionamento celular em doenças hepáticas em desenvolvimento. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar o fígado de um camundongo para microscopia multifotônica intravital.

O método que fornecemos aqui permite estabilizar o animal para sobrevivência a longo prazo, bem como minimizar artefatos de movimento devido ao método de fixação suave que oferecemos. Uma vez mascarado, esta técnica pode ser realizada em cerca de uma hora, se executada corretamente. Durante este procedimento, é importante controlar os parâmetros vitais dos animais, estabilizando temperatura, frequência cardíaca, níveis de oxigênio e de CO2. Isso pode ser alcançado adaptando a profundidade da necrose e da respiração seguindo esta técnica.

Outros procedimentos, como análise por citometria de fluxo ou microdissecção a laser, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como o fenótipo das células imunes infiltrantes ou os mediadores secretados por células do tecido ou infiltrantes após seu desenvolvimento. Essas técnicas permitiram aos pesquisadores obter insights sobre a dinâmica do tráfego de leucócitos e as interações celulares no fígado, possibilitando a análise da sequência de eventos que levam a doenças hepáticas inflamatórias. Siga as diretrizes de segurança a laser ao realizar imagens com um laser infravermelho de pulso de alta energia utilizado na microscopia multifotônica.

Garanta que nenhum reflexo da radiação laser possa causar risco aos seus olhos e pele durante a realização deste experimento.