Name: Long Term Intravital Multiphoton Microscopia de imagem de células imunes no saudáveis e doentes do fígado por meio CXCR6.Gfp Reporter Mice (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Aprenda microscopia intravital multiphoton de longo prazo para imagem de células imunes em fígado saudável e doente usando camundongos CXCR6.Gfp. Este método permite observar migração e interações leucocitárias em alta resolução.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores agradecem à Central Animal do Hospital Universitário de Aachen pelo suporte técnico. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG Ta434 / 2-1, DFG SFB / TRR 57) e pelo Centro Interdisciplinar de Pesquisa Clínica (IZKF) Aachen. Este trabalho foi ainda apoiado pelo Core Facility "Two-Photon Imaging", um Core Facility do Centro Interdisciplinar de Pesquisa Clínica (IZKF) Aachen dentro da Faculdade de Medicina da RWTH Aachen University.

NOTA: Os experimentos foram realizados em conformidade com a legislação alemã que rege os estudos em animais após o &#39;Guia para o cuidado e uso de animais de laboratório &quot;(publicação NIH, 8ª edição, 2011) e da Directiva 2010/63 / UE relativa à protecção dos animais utilizados para fins científicos (Jornal Oficial da União Europeia, 2010). Permissão oficial foi concedida a partir do cuidado com os animais e uso de escritório governamental (LANUV Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Alemanha). Nota: Os passos que podem ser omitidos para a imagem latente de curto prazo (por exemplo, tirar fotos, pilhas 3-D ou também de microscopia de lapso de tempo curta duração) são marcados com asterisco (*) para reduzir o tempo de preparação e simplificar o protocolo cirúrgico. Imagiologia também pode ser realizada sem grande controlo e de circulação, se necessário, no entanto, o tempo de sobrevivência será acentuadamente reduzido. 1. Setup Microscópio e pré-cirurgia Preparação (5-10 min) <ol><li> Sistema Ligue (microscópio, laboratório de energia, laser, almofada de aquecimento, câmara climática, web cam, dispositivo de bomba de seringa, respirador). </li><li> Ligue O 2 de abastecimento para Isoflurane Vapor e definir o nível de isoflurano para 1,5 Vol% (v / v), conectar-se a um pequeno respirador animal. <ol><li> Para imagens de curto prazo, manter a anestesia com isoflurano somente após a indução inicial anestesia ip (veja o passo 2.2). Em seguida, use 2 Vol% (v / v) isoflurano, e manter o tempo de imagem inferior a 2 horas para garantir estável microcirculação hepática. </li></ol></li><li> Definir a respiração 120-140 ciclos respiratórios / min com um volume de 150-200 uL. </li><li> Configure fase rato agarose. Preparar 100 ml de 3% (w / v) de agarose, vertendo-a em um prato (aproximadamente 10 cm x 15 cm base) num ângulo de 40 °. </li><li> Configure área de trabalho cirúrgico coletando a instrumentação necessária. Para prevenir a infecção microbiana, desinfectar instrumentos usando uma solução a 1% de Sekusept Forte S (9,9% w / v), Glutaral 9,8% w / v, formaldeído durante 5 minutos antes da experiência (Figura 1A). </li><li> Obter restantes componentes: desinfectante da pele (por exemplo, solução de povidona iodo de 10%), no fígado (fase de pilhas e ponte), solução de agarose (3% (w v) em PBS /), bomba de seringa com 5% (w / v) de uma solução de glucose (G-5), bomba de seringa com solução anestésica I (cetamina 0,1 mg / ml, xilazina 0,5 mg / ml, 5 ug de fentanil / ml), cotonetes, n-Butil-2-Cyanoacrylat, e 1x PBS. Coloque agarose fase prato em câmara de incubação para o pré-aquecimento. </li></ol> 2. A traqueotomia (10-15 min) <ol><li> Use camundongos C57BL / 6 a partir da casa de reprodutoras de 25-28 g. Casa os ratinhos sob condições específicas isentas de patogénios de acordo com as orientações FELASA, num ambiente de temperatura e humidade controladas com um ciclo luz / escuro de 12 h de 12 horas de luz. Permitir que os animais livre acesso à dieta padrão ratos (Sniff Padrão Rodent Diet) e água ad libitum. </li><li> Anestesiar o mouse pelo initial intraperitoneal (ip) de injecção de 250 ul de solução de anestésico cetamina (II 0,1 mg / ml, xilazina 1 mg / ml, de Buprenorfina 10 ug / ml). <ol><li> * Para manutenção durante imagens intravital, administrar continuamente solução anestésica I por injecção contínua ip (cetamina 0,1 mg / ml, xilazina 0,5 mg / ml, 5 ug de fentanil / ml) usando um dispositivo de bomba de seringa com uma taxa de fluxo de 0,2 ml / h em combinação com inalação de isoflurano 0,5 vol% (v / v). </li><li> Verifique reflexos após 5 min (por exemplo pitada almofada do pé com uma pinça), desinfectar a pele de traqueostomia, preparação começar se o mouse está em estado de anestesia cirúrgica tolerante. </li><li> Aplicar olho creme de protecção (por exemplo, dexpantenol 50 mg / g) para evitar a córnea de secar (Figura 1B). </li></ol></li><li> Fixar do mouse sobre a preparação mesa expondo lado ventral usando fita adesiva para as extremidades; overstretch suavemente pescoço, fixar nessa posição, por exemplo., através da utilização de uma faixa de borracha t enganchadoo incisivos. <ol><li> Desinfectar pele e da pele utilizando uma solução de povidona-iodo, mediante a aplicação de desinfectante com uma cotonete. </li></ol></li><li> Efetuar corte inicial pele (0,5-1 cm de comprimento) diretamente abaixo do queixo (Figura 1C) <ol><li> Dissecar cuidadosamente tecido conjuntivo entre as glândulas salivares (Figura 1D). </li><li> Retire com cuidado aberta muscular tubo circundante traquéia (Figura 1E, F). </li></ol></li><li> Coloque fio cirúrgico debaixo da traquéia para posterior fixação do tubo de ventilação (Figura 1G). <ol><li> Abrir traqueia com micro-tesoura entre anéis cartilaginosos realizando uma incisão em forma de T (Figura 1H) </li></ol></li><li> Coloque tubo de ventilação na traquéia através da incisão (~ 0,5 centímetros). Para empurrar o tubo para a frente, pegue final caudal com pequenas pinças anatômicas e avançar gentilmente o tubo na traquéia (Figura 1-I) </li><li> Fixar tubo com fio cirúrgico (por exemplo, </em&gt;, 5-0) com a linha colocada no Passo 2.5 dando um nó em torno de tubo no interior da traquéia; executar segunda fixação cranial do tubo na pele para evitar depositioning acidental (Figura 1J, K). </li><li> Corte do selo com cola de tecidos (por exemplo, n-butil-2-Cyanoacrylat) (Figura 1D). </li><li> Fixar tubo na cabeça, usando fita adesiva. </li></ol> 3. laparotomia (15-20 min) <ol><li> Coloque o mouse sobre almofada de aquecimento para evitar a hipotermia. Shave abdômen, retire cuidadosamente o cabelo da pele. Desinfetar pele raspada e pele com a solução de iodopovidona. </li><li> Realize uma pequena pele cortada abaixo do esterno utilizando uma tesoura cirúrgica (Figura 2A). Estender o corte lateralmente abaixo das costelas para ambos os lados, cauterização todos os vasos sanguíneos visíveis para evitar sangramento. </li><li> Executar cuidadosamente um pequeno corte na linha alba abaixo do esterno, a abertura do peritônio (Figura 2B). Estender o corte para ambos os lados usando cauterizção para impedir o sangramento (Figura 2C, D). </li><li> Coloque o mouse em agarose fase prato (Figura 2E). Inserir as pilhas de altura adequada em ambos os lados do rato (geralmente 12-14 lamelas) (Figura 2F). </li><li> Coloque sensor de gatilho respiratório debaixo parte superior das costas para sincronizar o microscópio com a respiração. Ative unidade de gatilho (Figura 2G). </li><li> Coloque fio cirúrgico (5-0) através do esterno para retrair costelas (Figura 2?). </li><li> Cuidadosamente corte ligamento ligar fígado e diafragma (ligamento falciforme), bem como do tracto gastrointestinal e fígado usando tesouras cirúrgicas curvas. Cortar o ligamento falciforme para baixo na aorta (Figura 2J). </li></ol> 4. Configuração da amostra (10-15 min) <ol><li> Coloque o mouse sobre o lado direito, com um ângulo de 45 ° para facilitar o acesso a grande lobo hepático. </li><li> Adicionar ponte encenar abaixo das costelas, que abrange o abdominalcavidade. Fabricação de uma ponte, usando uma lâmina de cobertura padrão com revestimento de fita adesiva para cobrir as bordas cortantes (Figura 2K). </li><li> Coloque grande lobo hepático no palco. Deslizar cuidadosamente sonda stylus dupla bola ou uma espátula acolchoado abaixo do fígado e segure a parte superior do órgão com um cotonete molhado ou tecido molhado. Levante lobo para o slide e aplicar arrastar suave. Lobe pode ser dobrado ou enrolado. Prestar cuidados extra para só manipulação suave do fígado (Figura 2L). </li><li> Coloque estacas laterais de apoio, por exemplo, pilhas de pequenas peças de cobertura (20 mm x 20 mm), com aproximadamente a mesma altura do lóbulo do fígado ao lado dela para suportar a cobertura de deslizamento. </li><li> Coloque grande lamela (24 mm x 50 mm) no lóbulo do fígado. Certifique-se de que lamela é orientada mais horizontal possível (Figura 2 M). NOTA: A cobertura de vidro deve estar em contato com o tecido sem apertar. Verifique se há sinais visíveis de fluxo sanguíneo prejudicado (tecido branco). Se microcircmento é interrompido, adicionar um maior apoio stakes. </li><li> * Coloque dois cateteres intraperitoneal independentes (Figura 2 N) para anestesia longo prazo e G-5 aplicação. Instale cateteres lateralmente na parte inferior do abdômen ao lado dos membros posteriores. NOTA: Os cateteres intraperitoneais podem ser auto-fabricados através da ligação 27 agulhas G com tubagem de silicone flexível (Figura 3). </li><li> * Agulha Fixate com um laço de 5-0 cirúrgica na pele para evitar o deslocamento acidental. </li><li> * Prenda bomba de seringa com solução anestesia I à cateterização 1, defina a taxa de fluxo de 0,2 ml / h; anexar bomba de seringa com G-5 ao cateter 2, definir taxa de fluxo de 0,1 ml / hr. </li></ol> 5. Rato Monitoring <ol><li> * Coloque eletrodos de ECG em frente e as extremidades traseiras (Figura 4A). </li><li> * Conecte a tubulação de expiração para o CO 2 sensor de nível. </li><li> Adicionar sensor de temperatura externo conectado a almofada de calor (Figura 4C). </li></ol> 6. Incorporação e fixação do tecido (5-10 min) <ol><li> Preparar 100 ml de 3% (w / v) de agarose em 1X PBS. Incorporar fígado quando a temperatura é 41 ° C, utilizando uma seringa de 5 ml e uma agulha de 18 G (Figura 5A). </li><li> Pour agarose restante em lamela e em torno do rato (Figura 5B, C). Espere até agarose está totalmente gelatinizado. </li><li> Retire o excesso de agarose usando a espátula Heidemann, preparando uma grande viewfield suficiente para digitalizar o lobo hepático preparado (Figura 5D, E). </li></ol> 7. Criação de Imagens <ol><li> Transferir o mouse na câmara de microscópio climáticas. </li><li> Adicionar 50-100 ml de 1x PBS (pré-aquecido a 37 ° C). </li><li> Cubra amostra prato para evitar a evaporação (Figura 5F). </li><li> * Diminuição isoflurano inalativa de 0,5 Vol% (v / v). </li><li> * Iniciar o monitoramento de software, a gravação de ECG, freqüência cardíaca e expiratória CO 2. </li><li> Comece imagem: abrir lapersianas SER, identificar campos exibição de interesse, definir limites superior e inferior para Z-stacks, e começar a tempo de gravação lapso. Reajustar Z pilhas se necessário, para corrigir-Z deriva (ex., Devido a alterações na pressão sanguínea ou a variação de temperatura, Figura (5G). NOTA: Após a conclusão do período de imagem, ou se a circulação ou anestesia dos animais torna-se instável, sacrificar os ratinhos por deslocamento cervical (sem despertar da anestesia). </li></ol>

<ol><li>Dusseaux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+MAIT+cells+are+xenobiotic-resistant%2C+tissue-targeted%2C+CD161hi+IL-17-secreting+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells.</a> Blood. 117 (4), 1250-1259 (2011).</li>
<li>Reese, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+hypoxia+on+liver+secretion+studied+by+intravital+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">The effect of hypoxia on liver secretion studied by intravital fluorescence microscopy.</a> Br J Exp Pathol. 41, 527-535 (1960).</li>
<li>Bhathal, P. S., Christie, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+fluorescence+microscopy+study+of+bile+ductule+proliferation+in+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Intravital fluorescence microscopy study of bile ductule proliferation in guinea pigs.</a> Gut. 10 (11), 955(1969).</li>
<li>Stefenelli, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminal+vascular+system+and+microcirculation+of+the+rat+liver+in+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Wien+Klin+Wochenschr%22%5BJournal%5D)">Terminal vascular system and microcirculation of the rat liver in intravital microscopy.</a> Wien Klin Wochenschr. 82 (33), 575-578 (1970).</li>
<li>Hori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+sure+methodology+for+massive+hepatectomy+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse.</a> Ann Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).</li>
<li>Tanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+dual-colored+visualization+of+colorectal+liver+metastasis+in+living+mice+using+two+photon+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Intravital dual-colored visualization of colorectal liver metastasis in living mice using two photon laser scanning microscopy.</a> Microsc Res Tech. 75 (3), 307-315 (2011).</li>
<li>Schemmer, P., Bunzendahl, H., Klar, E., Thurman, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reperfusion+injury+is+dramatically+increased+by+gentle+liver+manipulation+during+harvest%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl+Int%22%5BJournal%5D)">Reperfusion injury is dramatically increased by gentle liver manipulation during harvest.</a> Transpl Int. 13, Suppl 1. S525-S527 (2000).</li>
<li>Schemmer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+Kupffer+cells+cause+a+hypermetabolic+state+after+gentle+in+situ+manipulation+of+liver+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Activated Kupffer cells cause a hypermetabolic state after gentle in situ manipulation of liver in rats.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 280 (6), G1076-G1082 (2001).</li>
<li>Toiyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+DSS-induced+cecal+mucosal+damage+in+GFP-transgenic+mice+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of DSS-induced cecal mucosal damage in GFP-transgenic mice using two-photon microscopy.</a> J Gastroenterol. 45 (5), 544-553 (2010).</li>
<li>Zimmon, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hepatic+vasculature+and+its+response+to+hepatic+injury%3A+a+working+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Yale+J+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">The hepatic vasculature and its response to hepatic injury: a working hypothesis.</a> Yale J Biol Med. 50 (5), 497-506 (1977).</li>
<li>Wong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimal+role+for+selectins+in+the+recruitment+of+leukocytes+into+the+inflamed+liver+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature.</a> J Clin Invest. 99 (11), 2782-2790 (1997).</li>
<li>Bonder, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+for+neutrophil+recruitment+to+the+liver+in+concanavalin+A-induced+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Essential role for neutrophil recruitment to the liver in concanavalin A-induced hepatitis.</a> J Immunol. 172 (1), 45-53 (2004).</li>
<li>Xu, C., Zipfel, W., Shear, J. B., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+fluorescence+excitation%3A+new+spectral+windows+for+biological+nonlinear+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Multiphoton fluorescence excitation: new spectral windows for biological nonlinear microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (20), 10763-10768 (1996).</li>
<li>Centonze, V. E., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+excitation+provides+optical+sections+from+deeper+within+scattering+specimens+than+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging.</a> Biophys J. 75 (4), 2015-2024 (1998).</li>
<li>Amore, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multiphoton+imaging+of+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer+disease+reveals+marked+thioflavine-S-associated+alterations+in+neurite+trajectories%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">In vivo multiphoton imaging of a transgenic mouse model of Alzheimer disease reveals marked thioflavine-S-associated alterations in neurite trajectories.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 62 (2), 137-145 (2003).</li>
<li>Hickey, M. J., Westhorpe, C. L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+inflammatory+leukocyte+recruitment+in+kidney%2C+lung+and+liver--challenges+to+the+multi-step+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging inflammatory leukocyte recruitment in kidney, lung and liver--challenges to the multi-step paradigm.</a> Immunol Cell Biol. 91 (4), 281-289 (2013).</li>
<li>McLellan, M. E., Kajdasz, S. T., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+species+specifically+associated+with+thioflavine+S-positive+amyloid+plaques+by+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of reactive oxygen species specifically associated with thioflavine S-positive amyloid plaques by multiphoton microscopy.</a> J Neurosci. 23 (6), 2212-2217 (2003).</li>
<li>Geissmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+Immune+Surveillance+by+CXCR6%2B+NKT+Cells+Patrolling+Liver+Sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravascular Immune Surveillance by CXCR6+ NKT Cells Patrolling Liver Sinusoids.</a> PLoS Biology. 3 (4), (2005).</li>
<li>Velázquez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+activation+by+innate+cytokines+or+microbial+antigens+can+cause+arrest+of+natural+killer+T+cell+patrolling+of+liver+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: activation by innate cytokines or microbial antigens can cause arrest of natural killer T cell patrolling of liver sinusoids.</a> J Immunol. 180 (4), 2024-2028 (2008).</li>
<li>Wehr, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+receptor+CXCR6-dependent+hepatic+NK+T+Cell+accumulation+promotes+inflammation+and+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chemokine receptor CXCR6-dependent hepatic NK T Cell accumulation promotes inflammation and liver fibrosis.</a> J Immunol. 190 (10), 5226-5236 (2013).</li>
<li>Khandoga, A., Hanschen, M., Kessler, J. S., Krombach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+cells+contribute+to+postischemic+liver+injury+in+mice+by+interacting+with+sinusoidal+endothelium+and+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">CD4+ T cells contribute to postischemic liver injury in mice by interacting with sinusoidal endothelium and platelets.</a> Hepatology. 43 (2), 306-315 (2006).</li>
<li>Egen, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+and+T+cell+dynamics+during+the+development+and+disintegration+of+mycobacterial+granulomas%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas.</a> Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).</li>
<li>Beattie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+donovani-induced+expression+of+signal+regulatory+protein+alpha+on+Kupffer+cells+enhances+hepatic+invariant+NKT-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Leishmania donovani-induced expression of signal regulatory protein alpha on Kupffer cells enhances hepatic invariant NKT-cell activation.</a> Eur J Immunol. 40 (1), 117-123 (2010).</li>
<li>Beattie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+experimental+Leishmania+donovani-induced+hepatic+granulomas+detects+Kupffer+cell-restricted+antigen+presentation+to+antigen-specific+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells.</a> PLoS Pathog. 6 (3), e1000805(2010).</li>
<li>McDonald, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+danger+signals+guide+neutrophils+to+sites+of+sterile+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation.</a> Science. 330 (6002), 362-366 (2010).</li>
<li>Vanheule, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intravital+microscopic+study+of+the+hepatic+microcirculation+in+cirrhotic+mice+models%3A+relationship+between+fibrosis+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">An intravital microscopic study of the hepatic microcirculation in cirrhotic mice models: relationship between fibrosis and angiogenesis.</a> Int J Exp Pathol. 89 (6), 419-432 (2008).</li>
<li>Jenne, C. N., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+surveillance+by+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune surveillance by the liver.</a> Nat Immunol. 14 (10), 996-1006 (2013).</li>
<li>Zimmermann, H. W., Tacke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+chemokine+pathways+and+immune+cell+infiltration+as+a+novel+therapeutic+approach+in+liver+inflammation+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Allergy+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Modification of chemokine pathways and immune cell infiltration as a novel therapeutic approach in liver inflammation and fibrosis.</a> Inflamm Allergy Drug Targets. 10 (6), 509-536 (2011).</li>
<li>Kim, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+microscopy+imaging+of+intact+spinal+cord+and+cerebral+cortex+reveals+requirement+for+CXCR6+and+neuroinflammation+in+immune+cell+infiltration+of+cortical+injury+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites.</a> J Immunol Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).</li>
<li>Karlmark, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+recruitment+of+the+inflammatory+Gr1%2B+monocyte+subset+upon+liver+injury+promotes+hepatic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic recruitment of the inflammatory Gr1+ monocyte subset upon liver injury promotes hepatic fibrosis.</a> Hepatology. 50 (1), 261-274 (2009).</li>
<li>Heymann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+macrophage+migration+and+differentiation+critical+for+liver+fibrosis+is+mediated+by+the+chemokine+receptor+C-C+motif+chemokine+receptor+8+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic macrophage migration and differentiation critical for liver fibrosis is mediated by the chemokine receptor C-C motif chemokine receptor 8 in mice.</a> Hepatology. 55 (3), 898-909 (2012).</li>
<li>Ramachandran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Ly-6C+expression+identifies+the+recruited+macrophage+phenotype%2C+which+orchestrates+the+regression+of+murine+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Differential Ly-6C expression identifies the recruited macrophage phenotype, which orchestrates the regression of murine liver fibrosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), E3186-E3195 (2012).</li>
<li>Moles, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TLR2%2FS100A9%2FCXCL-2+signaling+network+is+necessary+for+neutrophil+recruitment+in+acute+and+chronic+liver+injury+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">A TLR2/S100A9/CXCL-2 signaling network is necessary for neutrophil recruitment in acute and chronic liver injury in the mouse.</a> J Hepatol. 60 (4), 782-791 (2014).</li>
<li>Hammerich, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+receptor+CCR6-dependent+accumulation+of+%CE%B3%CE%B4+T+cells+in+injured+liver+restricts+hepatic+inflammation+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Chemokine receptor CCR6-dependent accumulation of γδ T cells in injured liver restricts hepatic inflammation and fibrosis.</a> Hepatology. 59 (2), 630-642 (2014).</li>
<li>Syn, W. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKT-associated+hedgehog+and+osteopontin+drive+fibrogenesis+in+non-alcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">NKT-associated hedgehog and osteopontin drive fibrogenesis in non-alcoholic fatty liver disease.</a> Gut. 61 (9), 1323-1329 (2012).</li>
<li>McDonald, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+CD44+and+hyaluronan+is+the+dominant+mechanism+for+neutrophil+sequestration+in+inflamed+liver+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Interaction of CD44 and hyaluronan is the dominant mechanism for neutrophil sequestration in inflamed liver sinusoids.</a> J Exp Med. 205 (4), 915-927 (2008).</li>
<li>Egen, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+reveals+limited+antigen+presentation+and+T+cell+effector+function+in+mycobacterial+granulomas%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas.</a> Immunity. 34 (5), 807-819 (2011).</li>
<li>Singer, G., Stokes, K. Y., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+microcirculation+in+murine+sepsis%3A+role+of+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Surg+Int%22%5BJournal%5D)">Hepatic microcirculation in murine sepsis: role of lymphocytes.</a> Pediatr Surg Int. 24 (1), 13-20 (2008).</li>
<li>Phillipson, M., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neutrophil+in+vascular+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The neutrophil in vascular inflammation.</a> Nat Med. 17 (11), 1381-1390 (2011).</li>
<li>Khandoga, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+and+quantitative+analysis+of+leukocyte+directional+migration+and+polarization+in+inflamed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue.</a> PLoS One. 4 (3), e4693(2009).</li>
</ol>

Os autores não divulgam conflito de interesses.

O objetivo do nosso estudo foi desenvolver um método altamente padronizada, estável e reprodutível para a imagem latente TPLSM intravital do fígado. Imaging Intravital em geral deu informações valiosas sobre o comportamento celular sob condições reais seguintes homing e interação de diferentes populações de leucócitos em desenvolvimento, a homeostase e da doença. No entanto, a posição anatómica um pouco difícil de fígado, devido a que movimento respiratório e intestinal peristáltica são transmitidos directamente para o ...

A visualização de células e as funções celulares em órgãos inteiros ou até mesmo de organismos inteiros tem sido de grande interesse para mais de 50 anos, incluindo praticamente todas as partes do corpo 2. Por isso, alguns estudos iniciais já empregaram imagens intravital do fígado 3,4. No entanto, existem várias limitações atualizado sobre estável imagens de alta resolução a longo prazo do tecido do fígado. Devido à posição anatómica do fígado em estreito contacto com o diafragma e o tracto gastrointestinal 5, o problema mais comum para imagiologia intravital microscópica é o movimento devido à respiração e, em menor grau, peristáltica do tracto intestinal 6. Em comparação com outros órgãos sólidos, cirurgia do fígado é particularmente desafiador. Devido à estrutura microvascular densa, manipulação cirúrgica pode conduzir a lesões hemorrágicas maciças, microcirculação comprometida 7 e também a activação de residente immune células, tais como células de Kupffer 8. Portanto, a fixação mecânica do tecido como publicado anteriormente 6,9 é susceptível de interferir com a imagem de microscopia intravital. Em um fígado saudável, 10-15% do volume total de sangue reside dentro da vasculatura hepática, e o órgão recebe cerca de 25% do débito cardíaco geral 10, tornando o órgão altamente susceptíveis a mudanças na circulação (por exemplo, flutuações de pressão arterial ). Portanto, as interrupções no fluxo sanguíneo hepático devido, por exemplo, tensão de cisalhamento, deslocamento, lesão por manuseio excessivo dos tecidos ou circulação centralizada vai levar a alterações artificiais no comportamento migratório de leucócitos, deficiente oxigenação fígado e, portanto, mais danos ao fígado, afetando as respostas imunes do fígado, bem como preservação de órgãos e tempo de vida total do animal. Os primeiros estudos microscópicos foram baseados em mi epifluorescência intravitalcroscopy, mas várias restrições técnicas, tais como o branqueamento foto e baixa profundidade de penetração limitar o uso desta técnica para imagiologia do fígado a longo prazo 4,11,12. Com o desenvolvimento da microscopia multiphoton na década de 1990, as limitações de branqueamento foto ou profundidade de penetração foram principalmente resolvido, já que este novo método era tecnicamente capaz de realizar estudos de imagem em praticamente todos os órgãos em situações da vida real 13-15. No entanto, os principais desafios que subsistem no que diz respeito à geração de imagens de fígado foram: movimentos de respiração, autofluorescência do tecido do fígado, protegendo o fluxo sanguíneo inalterado nos sinusóides hepáticos, e de imagem especialmente estáveis ​​por longos períodos de várias horas 16. Apesar de vários estudos abordaram a função e migração de vários leucócitos no fígado 17, por exemplo, a NKT células-18-20, células T 21,22, os macrófagos do fígado 23,24 ou neutrófilos 25, a longo prazo multiphoton mimaging icroscopy ainda não tinha sido estabelecida com sucesso, uma tarefa ainda mais difícil em animais com doença hepática aguda ou crônica devido ao dano existente e, portanto, maior susceptibilidade a danos maiores 26. No entanto, monitorando o comportamento migratório e função celular de leucócitos no fígado em tempo real, permite que novas idéias em seu papel especial na homeostase do fígado e doença 27. O receptor de quimiocina CXCR6 é expresso em vários subconjuntos de linfócitos, incluindo células assassinas naturais (NK), as células NKT e algumas populações de células T 18,28. Estudos anteriores em ratos indicaram que CXCR6 e sua CXCL16 ligando cognato pode controlar o patrulhamento de células NKT em sinusóides hepáticos durante a homeostase. Por conseguinte, a utilização de ratinhos CXCR6.gfp (transportando um knock-in de proteína fluorescente verde [GFP] no locus CXCR6) tem sido descrita para investigar a migração de linfócitos em vários órgãos tais como o cérebro 29e também fígado 18,20, mostrando aumento da infiltração de células CXCR6.gfp sobre a inflamação. Com o método proporcionado no presente estudo foi possível seguir estes processos durante um longo período de tempo sob condições estabilizadas. O procedimento baseado multiphoton intravital permitido de imagem que foi altamente reprodutível com perturbação mínima do animal e do órgão; otimizado para a sobrevivência dos animais a longo prazo através de monitoramento extensa, seguida de perto o controle da respiração e circulação; e altamente flexível e fácil de adoptar igualmente para outros órgãos parenquimatosos, tais como de rim ou baço.

<table><tbody><tr><td>Anestésicos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Essex Pharma</td><td>997.00.00</td><td>Analgeticum, 0,1 mg/kg</td></tr><tr><td>Fentanil</td><td>Rotex</td><td>Medica carga: 30819</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de anestesia Fluovac</td><td>Harvard Apparatus</td><td>34-1030</td><td></td></tr><tr><td>Glicose 5%</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISOFLO (Vapor de Isoflurano) vaporizador</td><td>Eickemeyer</td><td>4802885</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Forene Abbott</td><td>B 506</td><td></td></tr><tr><td>Solução isotônica (0,9%) NaCl</td><td>DeltaSelect GmbH</td><td>PZN 00765145</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin 10%</td><td>ceva</td><td>Carga: 36217/09</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin 2%</td><td>medistar</td><td>Carga: 04-03-9338/23</td><td></td></tr><tr><td>Consumíveis 20</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ml Seringa</td><td>BD Plastipak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml Balão Erlenmeyer</td><td>Schott Duran</td><td>21 226 36</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Béquer 2x</td><td>Schott Duran</td><td>50-1150</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 2 ml</td><td>BD Plastipak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-0 Vicryl sutura</td><td>Ethicon</td><td>V7980</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>disponível</td><td></td><td></td>comercialmente</tr><tr><td>Bepanthen Eye e Pomada para o nariz</td><td>Bayer Vital GmbH</td><td>6029009.00.00</td><td></td></tr><tr><td>Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>18010-00</td><td></td></tr><tr><td>Cotonetes de gaze de algodão</td><td>Fuhrmann GmbH</td><td>32014</td><td></td></tr><tr><td>Lamínula 24x50 mm</td><td>ROTH</td><td>1871</td><td></td></tr><tr><td>Fita de seda Durapore</td><td>3M</td><td>1538-1</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi descartável Feather</td><td>02.001.30.011</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno de furo fino 0,58 mm ID</td><td>Smiths medical</td><td>800/100/200</td><td></td></tr><tr><td>Histoacryl</td><td>Braun</td><td>1050052</td><td>5x 0,5 ml</td></tr><tr><td>Leukoplast</td><td>BSN Medical Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de Microscópio</td><td>ROTH</td><td>1879</td><td></td></tr><tr><td>Poli-Álcool Haut&hellip; farblos Antisepticum</td><td>Antiseptica GmbH</td><td>72PAH200</td><td></td></tr><tr><td>Agulha Sterican 18 G x 1</td><td>B. Braun</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>Agulha Sterican 27 3/4 G x 1</td><td>B. Braun</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>Papel de seda</td><td>disponível comercialmente Instrumentos</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>cirúrgicos</td></tr><tr><td>Polidor de amálgama 3PL</td><td>Gatz</td><td>0110?</td><td></td></tr><tr><td>Afastadores de Blair (4 pinos (rombos)) x2</td><td>Storz& Klein</td><td>S-01134</td><td></td></tr><tr><td>Dumont No.7 fórceps</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Graefe curvada x1</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>11151-10</td><td></td></tr><tr><td>pinça Graefe reta x2</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Espátula Heidemann HD2</td><td>Estoma</td><td>2030.00</td><td></td></tr><tr><td>Porta-agulhas Mathieu</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>12010-14</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>14074-11</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Semken</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>11008-13</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica pequena curvada</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>14029-10</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica pequena reta</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps padrão padrão</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Tesouras de mola Vannas</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de Gatilho de ECG</td> de <td></td><td></td> Equipamento <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> 3000003686 Biomédica <tr><td>Rápida MICROCAPSTAR Analisador de Dióxido de Carbono Expirado</td><td>AD Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minivent Typ 845</td><td>Harvard Apparatus</td><td>73-0043</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio multifotônico Trimscope I</td><td>LaVision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfusor Compact</td><td>B. Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 8/30 Gravador de 8 canais</td><td>AD Instruments</td><td>PL3508</td><td></td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento com temperatura controlada</td><td>Sygonix</td><td>26857617</td><td></td></tr><tr><td>Sensor de temperatura</td><td>disponível comercialmente Sistema</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de temperatura controlada para microscópios -Cube& Serviços</td><td></td><td></td> <td>de imagem de vida útil</td> da caixa</tr></tbody></table>

long term intravital multiphoton microscopia de imagem de células imunes no saudáveis ​​e doentes do fígado por meio cxcr6.gfp reporter mice

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

<html> Inflamação do fígado como uma resposta à lesão é um processo altamente dinâmico envolvendo a infiltração de subtipos distintos de leucócitos incluindo monócitos, neutrófilos, subconjuntos de células T, células B, células assassinas naturais (NK) e as células NKT. Microscopia intravital do fígado para monitorar a migração de células imunes é particularmente desafiador devido às altas exigências em matéria de preparação de amostras e fixação, resolução óptica e sobrevivência dos animais no longo prazo. No entanto, a dinâmica dos processos inflamatórios, assim como estudos de interacção celular poderia fornecer informações importantes para compreender melhor o início, a progressão e regressão da doença inflamatória do fígado. Portanto, um método altamente sensível e confiável foi criada para estudar a migração e célula-célula-interações de células imunes diferentes em fígado de rato durante longos períodos (cerca de 6 h) por dois fótons de microscopia de varredura a laser intravital (TPLSM) em combinação com tratamento intensivo monitorização. ent &quot;&gt; O método fornecido inclui uma preparação suave e fixação estável do fígado com perturbação mínima do órgão; imagiologia intravital longo prazo usando microscopia multiphoton multicolor com praticamente nenhuma fotodegradação ou efeitos fototóxicos, durante um período de até 6 horas, permitindo rastreamento de subconjuntos de leucócitos específicos; e condições de imagem estável devido à ampla fiscalização do rato parâmetros vitais e estabilização da circulação, temperatura e troca gasosa. Para investigar a migração de linfócitos após a inflamação do fígado CXCR6.gfp ratinhos knock-in foram submetidos a imagiologia do fígado intravital em condições basais e após os danos do fígado aguda e crónica induzida por injecção intraperitoneal (s) de tetracloreto de carbono (CCl 4). CXCR6 é um receptor de quimiocina expressa em linfócitos, principalmente em Natural T assassinas (NKT) -, Natural Killer (NK) - e subconjuntos de linfócitos T, tais como células T CD4 +, mas também asso mucosasated invariante células (MAIT) T 1. Seguindo o padrão migratório e posicionamento de CXCR6.gfp + células imunes permitiu uma visão detalhada sobre o seu comportamento alterado após a lesão hepática e, portanto, o seu potencial envolvimento na progressão da doença.

Para validar nossa abordagem TPLSM intravital, nós submetido GFP / + camundongos CXCR6 a imagem TPLSM intravital. Os ratos foram quer deixados sem tratamento como controlos de linha de base ou submetido a uma única injecção intraperitoneal de tetracloreto de carbono (CCl 4) para induzir danos no fígado aguda 20. As sequências de vídeo foram tomadas ao longo de um período de tempo de 2-5 horas, e as células foram traçadas ao longo do tempo, devido à sua fluore...

A imagem intravital estável de alta resolução de células imunes no fígado é um desafio. Aqui, fornecemos um método altamente sensível e confiável para estudar a migração e as interações célula-célula de células imunes no fígado de camundongo por longos períodos (cerca de 6 horas) por microscopia de varredura a laser multifotônica intravital em combinação com monitoramento de terapia intensiva.

Long Term Intravital Multiphoton Microscopia de imagem de células imunes no saudáveis ​​e doentes do fígado por meio CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

O objetivo geral do experimento a seguir é acompanhar a migração e a interação dos leucócitos em uma doença inflamatória hepática em progresso. Para compreender melhor a sequência de eventos subjacentes ao recrutamento dessas células para o tecido hepático e seu possível envolvimento na imunopatologia. Isso é conseguido primeiramente realizando uma traqueotomia para obter controle sobre a respiração do camundongo, um passo crucial para garantir a sobrevivência prolongada do animal.Como segundo passo, realiza-se uma laparotomia no camundongo para expor cirurgicamente o fígado, permitindo o acesso ao órgão com o microscópio de múltiplos fótons. Em seguida, o fígado é fixado e posicionado mediante sua imersão em agarose, a fim de minimizar artefatos de movimento. A aquisição de imagens pode ser realizada durante várias horas, gerando sequências de alta resolução com lapso de tempo que acompanham as alterações no recrutamento, posicionamento e interação de leucócitos individuais.No processo de desenvolvimento da inflamação hepática, este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da inflamação hepática aguda e crônica, como o recrutamento de leucócitos, interações entre células ou mecanismos de imunopatologia. A principal vantagem desta técnica em comparação com a microscopia convencional é que a microscopia multifocal permite a obtenção de imagens de longa duração com praticamente nenhuma perturbação da amostra, baixo branqueamento do corante ou fototoxicidade, além de cortes ópticos com profundidade de até 100 micrômetros no tecido, o que se deve à física única do laser de luz no espectro vermelho distante. Este método pode, portanto, fornecer informações sobre doenças hepáticas.Pode ser facilmente adaptado a outros sistemas. Uma vez que o método de estabilização e fixação do tecido pode ser aplicado a praticamente todas as questões de microscopia intravital, é possível obter imagens facilmente de órgãos como baço, rim ou até tumores subcutâneos usando células relacionadas fluentes. Também é possível visualizar todos os subconjuntos de leucócitos e observar suas interações e a inflamação hepática.Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades devido à extrema complexidade da cirurgia em pequenos animais. No entanto, devido à nossa própria experiência, esse é apenas um fator limitante por algumas semanas e exige apenas alguma prática prática. Devido à fragilidade do tecido hepático, os passos de preparação são difíceis de aprender, e a demonstração visual do método é essencial. Após preparar os anestésicos, encha o estágio de aro do camundongo com 3%aros, despejando-o em um ângulo de 40 graus.Em seguida, certifique-se de que a área cirúrgica esteja completamente desinfetada, assim como todos os instrumentos necessários e demais itens. Então, anestesie o camundongo por meio de uma injeção intraperitoneal de um coquetel anestésico. Cinco minutos depois, verifique os reflexos do animal, desinfete a pele e aplique pomada oftálmica nos olhos.Agora, fixe o camundongo à mesa de preparação. Usando fita adesiva, posicione-o de modo a expor suavemente a face ventral, esticando levemente o pescoço. Uma faixa de borracha presa aos incisivos pode conseguir isso.Agora, realize uma incisão inicial abaixo do queixo, com cerca de 0,5 a um centímetro de comprimento. Em seguida, dissecar cuidadosamente o tecido conjuntivo entre as glândulas salivares e localize o tubo muscular que envolve a traqueia. Rasgue suavemente o músculo para expor a traqueia.Puxe um fio sob a traqueia, em seguida abra a traqueia com tesoura microcirúrgica usando uma incisão em forma de T. Insira o tubo de ventilação cerca de meio centímetro. Avance o tubo utilizando pinça anatômica pequena.Em seguida, fixe o tubo com pontos de sutura. Depois, para maior segurança, suture o tubo à pele, feche a incisão na pele usando cianoacrilato e fixe o tubo à cabeça do animal. Usando fita adesiva, mantenha a anestesia com um fluxo contínuo de 2% iso fluorina.Após preparar o camundongo para cirurgia, faça uma pequena incisão na pele abaixo do esterno e prolongue o corte lateralmente abaixo das costelas em ambos os lados. Cauterize todos os vasos sanguíneos expostos nesse processo. Para minimizar o sangramento, realize um pequeno corte inicial na linha do cotovelo para obter acesso à cavidade abdominal.Estenda o corte horizontalmente, selando todos os vasos sanguíneos e obtendo acesso ao fígado. Agora, transfira o camundongo para a plataforma de trabalho e empilhe lâminas em ambos os lados do animal para ajudar a mantê-lo no lugar. Essas pilhas devem ter a mesma altura do camundongo, de modo que a plataforma para o fígado, que será colocada posteriormente, não exerça pressão excessiva sobre o abdômen.Agora, utilizando pontos na esterno, afaste as costelas. Um fio 4-0 será suficiente. Após afastar as costelas, corte os ligamentos que conectam o fígado e o diafragma, cortando até a aorta, mas trabalhe com extrema cautela para não romper ou cortar o vaso. Corte também o ligamento que conecta o fígado ao trato gastrointestinal.Gire o rato 45 graus para melhorar o acesso ao lobo hepático maior. Pegue um lamínula padrão e fixe fita ao longo de suas bordas para que não fiquem afiadas. Coloque-a sobre a cavidade abdominal.Isso servirá como uma plataforma para posicionar o fígado sobre a platina. Deslize cuidadosamente uma sonda com ponta dupla esférica ou uma espátula acolchoada sob o fígado e segure a parte superior do órgão. O uso de pressão com um tecido úmido lesará imediatamente o tecido hepático, portanto é essencial manipular o órgão com cuidado.Em seguida, levante o lobo sobre a lâmina e puxe-o suavemente para a posição desejada. O lobo geralmente terminará dobrado ou encurvado; tente desdobrar as bordas levantando o tecido com uma espátula fina ou um pedaço de tecido úmido. A seguir, adicione suportes laterais na forma de lamínulas ou lâminas.Empilhe as lamínulas para que tenham a mesma altura do lobo hepático. O posicionamento e fixação do fígado são as etapas mais cruciais do protocolo. Qualquer estresse mecânico, torção ou pressão provocará dano tecidual imediato ou, pelo menos, fluxo sanguíneo prejudicado nos vasos sinusoidais.Agora, coloque uma lamínula grande com as bordas coladas sobre o lobo hepático apoiado pelos suportes laterais. Posicione esta lamínula da forma mais nivelada possível. Ela não deve comprimir o fígado.O tecido branco indica fluxo sanguíneo comprometido, a menos que a aquisição de imagem seja rápida. Agora é necessário inserir dois cateteres intraperitoneais independentes para fornecer anestesia de longa duração e aplicar G cinco. Eles são montados a partir de agulhas de calibre 27 e tubos de silicone flexíveis.Em seguida, inicie o fluxo utilizando bombas de seringa. Insira os cateteres no abdômen inferior próximo às patas traseiras. Após conectar os monitores vitais ao camundongo, prepare 100 mililitros de 3%aros em um XPBS.Quando o aros esfriar a 41 graus Celsius, incorpore o fígado utilizando uma seringa de cinco mililitros com agulha de 18 gauge. Após o aros ter esfriado, use uma espátula Heideman para remover o excesso e expor um campo de visão suficientemente grande para escanear o fígado. Em seguida, prossiga com a varredura.Após o preparo do campo de visão, mova o camundongo sob o microscópio para selecionar áreas apropriadas para a aquisição de imagens em lapso de tempo. O tecido hepático é examinado visualmente utilizando uma fonte externa de luz branca, identificando campos representativos com fluxo sanguíneo suficiente e mínima perturbação da amostra. Camundongos heterozigotos CXCR6 GFP foram submetidos à imagem intravital T-P-L-S-M como experimento. Alguns receberam injeção intraperitoneal de tetracloro para induzir dano hepático agudo.Células modais que expressavam GFP foram rastreadas por vídeo e suas trajetórias foram sobrepostas para obter um instantâneo da mobilidade celular. Em seguida, as trajetórias foram normalizadas. Fígados normais apresentavam células com padrões de migração aleatórios.Fígados injetados com CCI quatro apresentaram um comprometimento na migração celular. Ao medir o deslocamento total a partir de sua origem, ficou evidente que houve aprisionamento celular 36 horas após o tratamento com CCI quatro no local da lesão hepatocelular. O comprometimento da migração devido ao dano hepático também pôde ser demonstrado ao traçar a velocidade de migração de células individuais ao longo do tempo, mostrando uma parada parcial após 18 horas e uma parada migratória completa após 36 horas.A redução na velocidade das células migratórias também pode ser demonstrada como estatisticamente significativa quando as células são comparadas como populações. Assim, esta abordagem é adequada para acompanhar alterações na migração e posicionamento celular em doenças hepáticas em desenvolvimento. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar o fígado de um camundongo para microscopia multifotônica intravital.O método que fornecemos aqui permite estabilizar o animal para sobrevivência a longo prazo, bem como minimizar artefatos de movimento devido ao método de fixação suave que oferecemos. Uma vez mascarado, esta técnica pode ser realizada em cerca de uma hora, se executada corretamente. Durante este procedimento, é importante controlar os parâmetros vitais dos animais, estabilizando temperatura, frequência cardíaca, níveis de oxigênio e de CO2. Isso pode ser alcançado adaptando a profundidade da necrose e da respiração seguindo esta técnica.Outros procedimentos, como análise por citometria de fluxo ou microdissecção a laser, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como o fenótipo das células imunes infiltrantes ou os mediadores secretados por células do tecido ou infiltrantes após seu desenvolvimento. Essas técnicas permitiram aos pesquisadores obter insights sobre a dinâmica do tráfego de leucócitos e as interações celulares no fígado, possibilitando a análise da sequência de eventos que levam a doenças hepáticas inflamatórias. Siga as diretrizes de segurança a laser ao realizar imagens com um laser infravermelho de pulso de alta energia utilizado na microscopia multifotônica.Garanta que nenhum reflexo da radiação laser possa causar risco aos seus olhos e pele durante a realização deste experimento.

long-term-intravital-multiphoton-microscopy-imaging-immune-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Nós descrevemos um método para visualizar repetidamente microglia murino e monócitos...

A Técnica de Janela crânio-fino para Crônica de dois fótons In vivo Imaging da Microglia murino em Modelos de Neuroinflammation

Este artigo relata um método detalhado para a medição dinâmica e quantificação da velocidade do fluxo sanguíneo dentro dos vasos sanguíneos individuais da vasculatura hepática de camundongo usando imagens de microscopia intravital em combinação com uma metodologia específica para aquisição e análise de imagens.

Microscopia intravital Imagem do Fígado seguinte<em&gt; Leishmania</em&gt; Infecção: Uma Avaliação de hepáticas Hemodinâmica

Ativação da micróglia e microgliose são respostas fundamentais para a neurodegeneração crónica. Aqui, apresentamos métodos para in vivo, visualização de longo prazo de CX3CR1-GFP + células microgliais da retina por oftalmoscopia confocal, e para limiar e análises morfométricas para identificar e quantificar a sua activação. Monitoramos alterações microgliais durante estágios iniciais de glaucoma relacionada com a idade.

In Vivo Dinâmica da Retinal microglia Ativação Durante Neurodegeneration: confocal oftalmoscópico Imagem e morfometria celular no mouse Glaucoma

Detalhamos um protocolo para monitorar o comportamento de neutrófilos e monócitos em veias mesentéricas em estado estacionário e condições inflamatórias usando microscopia confocal intravital em camundongos anestesiados.

Imagiologia neutrófilos e monócitos em Mesenteric Veins por Microscopia intravital em ratos anestesiados em Tempo Real

Estabelecemos um protocolo cirúrgico romance para a imagem latente de dois fotões de fígado de ratos ao vivo com invasão mínima. Com esta técnica, identificamos a estrutura detalhada do fígado durante endotoxemia induzidas pelo lipopolissacarídeo. Nós antecipamos que este método pode ser utilizado para determinar a eficácia de vários tratamentos de reagentes para migração de leucócitos hepática.

Imagem de Intravital dois fotões de leucócitos durante a resposta imune em fígado de rato lipopolissacarídeo-tratados

Neste experimento, um rato é injetado em sua veia traseira com isotocianato Rhodamine B-dextran que pode manchar vasos sanguíneos. Depois que o fígado é exposto e fixo, uma parte específica do fígado pode ser selecionada para observar o tecido profundo no corpo vivo usando microscopia multifotícula.

Observação microscópica multifotípica de vasos em tecido hepático de rato

Este protocolo descreve uma técnica crônica de implantação de janelas cranianas que pode ser usada para imagens longitudinais de estruturas neuro-glio-vasculares, interações e função em condições saudáveis e doentes. Serve como uma alternativa complementar à abordagem de imagem transcranária que, embora muitas vezes preferida, possui algumas limitações críticas.

Mapeamento cerebral preciso para realizar imagens repetitivas in vivo da dinâmica neuro-imune em camundongos

Uma abordagem é aqui apresentada para imagens intravitais de longo prazo usando janelas de silicone opticamente claras que podem ser coladas diretamente ao tecido/órgão de interesse e à pele. Essas janelas são mais baratas e mais versáteis do que outras atualmente utilizadas no campo, e a inserção cirúrgica causa inflamação e angústia limitadas aos animais.

Imagem intravital longitudinal através de janelas de silicone claras

Aqui, descrevemos uma plataforma que permite imagens in vivo não invasivas de esferoides hepáticos enxertados na câmara anterior do olho do camundongo. O fluxo de trabalho abrange desde a geração de esferoides de células hepáticas primárias até o transplante para o olho do camundongo e imagens in vivo em resolução celular por microscopia confocal.

Imagens in vivo de esferoides hepáticos enxertados na câmara anterior do olho do camundongo

Aqui, apresentamos um protocolo para obter imagens intravitais do pulmão esquerdo de camundongo transplantado usando microscopia de dois fótons. Isso representa uma ferramenta valiosa para estudar a dinâmica e as interações celulares em tempo real após o transplante de pulmão murino.

Microscopia intravital de dois fótons do pulmão de camundongo transplantado

Este protocolo apresenta um pipeline abrangente de imagem para visualizar e modelar a morfologia das células estreladas hepáticas em tecido hepático intacto. Essa abordagem combina marcação fluorescente de fibroblastos usando genética de camundongos, preparação de tecidos baseada em perfusão hepática in situ e um método modificado de limpeza de tecidos iDISCO para alcançar transparência óptica.

Mapeamento da morfologia das células estreladas hepáticas em modelos camundongos de fibrose hepática

Aprenda microscopia intravital multiphoton de longo prazo para imagem de células imunes em fígado saudável e doente usando camundongos CXCR6.Gfp. Este método permite observar migração e interações leucocitárias em alta resolução.

Long Term Intravital Multiphoton Microscopia de imagem de células imunes no saudáveis ​​e doentes do fígado por meio CXCR6.Gfp Reporter Mice (Vídeo) | JoVE Journal

Long Term Intravital Multiphoton Microscopia de imagem de células imunes no saudáveis ​​e doentes do fígado por meio CXCR6.Gfp Reporter Mice

Explorar mais vídeos

Long Term Intravital Multiphoton Microscopia de imagem de células imunes no saudáveis e doentes do fígado por meio CXCR6.Gfp Reporter Mice