Long Term Intravital Multiphoton Microscopia de imagem de células imunes no saudáveis ​​e doentes do fígado por meio CXCR6.Gfp Reporter Mice

O objetivo geral do experimento a seguir é acompanhar a migração e a interação dos leucócitos na progressão da doença inflamatória hepática. Compreender melhor a sequência de eventos subjacentes à forma como estas células são recrutadas para o tecido hepático e o seu potencial envolvimento na imunopatologia. Isso é conseguido realizando primeiro uma traqueotomia para obter controle sobre a respiração do camundongo, uma etapa crucial para garantir a sobrevivência do animal a longo prazo.

Como segundo passo, o camundongo faz laparotomias para expor cirurgicamente o fígado, dando acesso ao órgão com o microscópio multifóton. Em seguida, o fígado é fixado e posicionado incorporando-o em surgiu para minimizar os artefatos de movimento. A imagem pode ser realizada ao longo de várias horas, levando a sequências de lapso de tempo de alta resolução que seguem as mudanças no recrutamento, posicionamento e interação de leucócitos individuais.

No processo de desenvolvimento da inflamação hepática, Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da inflamação hepática aguda e crônica, como recrutamento de leucócitos, interações celulares ou mecanismos de imunopatologia. A principal vantagem desta técnica em comparação com a microscopia convencional é que a microscopia multifocal permite imagens de longo prazo praticamente sem perturbação da amostra com baixo branqueamento ou fototoxicidade, bem como fatias ópticas de até 100 micrômetros de profundidade no tecido, e isso se deve à física única do laser da luz laser vermelha distante. Bem, este método pode fornecer informações sobre doenças hepáticas.

Pode ser facilmente adotado para outros sistemas. Desde o método de estabilização e fixação, o tecido pode ser aplicado a praticamente todas as questões de microscopia intravital, para que possa facilmente obter imagens de órgãos como baço, rim ou até mesmo tumores subcutâneos usando células relacionadas fluentes. Também é possível visualizar todos os subconjuntos de leucócitos e enviar suas interações e inflamação hepática.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades devido à extrema complexidade da cirurgia de pequenos animais. No entanto, devido à nossa própria experiência, este é apenas um fator limitante por algumas semanas e só precisa de algumas mãos na rotina Devido à fragilidade do tecido hepático, as etapas de preparação são difíceis de aprender e a demonstração visual do método é essencial. Depois de configurar os anestésicos, preencha o estágio de aro do camundongo com 3% de aros, despejando-o em um ângulo de 40 graus.

Em seguida, certifique-se de que a área de trabalho cirúrgico esteja totalmente desinfetada, assim como todos os instrumentos necessários e assim por diante. Em seguida, anestesie o camundongo com uma injeção intraperitoneal de um coquetel anestésico. Cinco minutos depois, verifique os reflexos do animal e, em seguida, desinfete a pele e aplique pomada oftálmica nos olhos.

Agora, prenda o mouse na mesa de preparação. Usando fita adesiva, posicione-a para expor o lado ventral alongando suavemente o pescoço. Um elástico preso aos incisivos pode fazer isso.

Agora, faça a incisão inicial abaixo do queixo com cerca de 0,5 a um centímetro de comprimento. Em seguida, disseque cuidadosamente o tecido conjuntivo entre as glândulas salivares e encontre o tubo muscular ao redor da traqueia. Rasgue suavemente o músculo para expor a traqueia.

Puxe um fio sob a traqueia e, em seguida, abra a traqueia com uma microtesoura usando uma incisão em forma de T na incisão. Insira o tubo de ventilação cerca de meio centímetro. Avance o tubo usando uma pequena pinça anatômica.

Em seguida, prenda o tubo com suturas. Em seguida, para maior segurança, suture o tubo na pele, sele a incisão na pele usando cianoacrilato e prenda o tubo na cabeça do animal. Usando fita adesiva, mantenha a anestesia usando um fluxo contínuo de flúor 2% iso.

Depois de preparar o camundongo para a cirurgia, faça uma pequena incisão na pele abaixo do esterno e estenda o corte lateralmente abaixo das costelas de ambos os lados. Cauterize todos os vasos sanguíneos expostos neste processo. Para minimizar o sangramento, faça um pequeno corte inicial no cotovelo linear para obter acesso à cavidade abdominal.

Estenda o corte horizontalmente, selando todos os vasos sanguíneos e dando acesso ao fígado. Agora, transfira o mouse para o estágio agro e empilhe slides em ambos os lados do animal para ajudar a mantê-lo no lugar. Essas pilhas devem corresponder à altura do camundongo para que o estágio do fígado, que será colocado posteriormente, não aplique pressão excessiva no abdômen.

Agora, usando suturas no esterno, retraia as costelas. Quatro suturas zero serão suficientes Depois de retrair as costelas, corte os ligamentos que conectam o fígado e o diafragma até a aorta, mas trabalhe com cuidado extra para não romper ou cortar o vaso. Corte também o ligamento que conecta o fígado e o trato gastrointestinal.

Gire o mouse 45 graus para melhorar o acesso ao lobo maior do fígado. Pegue uma lamínula padrão e cole-a ao longo das bordas para que não fique afiada. Coloque-o sobre a cavidade abdominal.

Isso servirá como um palco para o fígado posicionar o fígado no palco. Deslize cuidadosamente uma sonda de caneta de esfera dupla ou uma espátula acolchoada abaixo do fígado e segure a parte superior do órgão. Usar uma pressão mecânica de tecido úmido irá lesar instantaneamente o tecido hepático, por isso é essencial manusear o órgão com cuidado.

Em seguida, levante o lóbulo na corrediça e puxe-o suavemente para a posição. O lóbulo geralmente acaba dobrado ou dobrado suavemente, tente desdobrar as bordas levantando o tecido com uma espátula fina ou um tecido úmido. Em seguida, adicione suportes laterais na forma de lamínulas ou slides.

Empilhe as lamínulas para ter a mesma altura do lóbulo do fígado. O estadiamento e a fixação do fígado são a etapa mais crucial do protocolo. Qualquer estresse mecânico, torção ou pressão levará a danos instantâneos nos tecidos ou, pelo menos, ao fluxo sanguíneo prejudicado nos vasos sinusoidais.

Agora, coloque uma lamínula grande com bordas coladas sobre o lóbulo do fígado sustentado pelos suportes laterais. Posicione esta lamínula o mais nivelada possível. Não deve espremer o fígado.

O tecido branco indica fluxo sanguíneo prejudicado, a menos que a imagem seja rápida. Agora é necessário inserir dois cateteres intraperitoneais independentes para fornecer anestesia de longo prazo e aplicar G cinco. Estes são montados a partir de agulhas de calibre 27 e tubos de silicone flexíveis.

Em seguida, inicie o fluxo usando bombas de seringa. Insira os cateteres na parte inferior do abdômen, perto dos membros posteriores. Depois de conectar monitores vitais ao mouse, prepare 100 mililitros de 3%aros em um XPBS.

Quando o aros esfriar a 41 graus Celsius, incorpore o fígado nele usando uma seringa de cinco mililitros com uma agulha de calibre 18. Depois que o aeros esfriar, use uma espátula heideman para remover o excesso e expor um campo de visão grande o suficiente para escanear o fígado. Em seguida, prossiga com a digitalização.

Depois que o campo de visão estiver preparado, mova o mouse sob o microscópio para selecionar as áreas de varredura apropriadas para a imagem de lapso de tempo. O tecido hepático é escaneado a olho nu usando uma fonte externa de luz branca identificando campos representativos com fluxo sanguíneo suficiente e perturbação mínima da amostra CXCR seis camundongos heterozigotos GFP foram submetidos a imagens intravitais de T-P-L-S-M como um experimento. Alguns receberam uma injeção intraperitoneal de tetracloreto para induzir danos agudos ao fígado.

As células modais que expressam GFP foram rastreadas por vídeo e seus rastros foram sobrepostos para obter um instantâneo da mobilidade celular. As faixas foram então normalizadas. Fígados normais tinham células com padrões de migração aleatórios.

Os fígados injetados com CCI quatro mostraram um comprometimento na migração celular. Medindo o deslocamento total desde sua origem, ficou claro que houve aprisionamento celular 36 horas após o tratamento com CCI quatro no local do dano hepatocelular. A migração prejudicada pelo dano hepático também pode ser demonstrada traçando a velocidade de migração de células individuais ao longo do tempo, mostrando uma parada parcial após 18 horas e uma parada migratória completa após 36 horas.

A redução na velocidade das células migratórias também pode ser estatisticamente significativa quando as células foram comparadas como populações. Assim, essa abordagem é adequada para rastrear mudanças na migração e posicionamento celular no desenvolvimento de doenças hepáticas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar o fígado de um camundongo para microscopia multifoto intravital.

O método que fornecemos aqui nos permite estabilizar o animal para sobrevivência a longo prazo, bem como minimizar artefatos de movimento devido ao método de fixação suave que fornecemos. Uma vez mascarada, esta técnica pode ser feita em cerca de uma hora se for realizada corretamente Durante este procedimento, é importante controlar os parâmetros vitais dos animais estabilizando a temperatura, frequência cardíaca, oxigênio e níveis de CO2. Isso pode ser alcançado adaptando a profundidade da necrose e da respiração Seguindo esta técnica.

Outros procedimentos, como análise de citometria de fluxo ou microdissecção de captura a laser, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como o fenótipo das células imunes infiltrantes ou mediadores secretados pelo tecido ou células infiltrantes após seu desenvolvimento. Essas técnicas permitiram que os pesquisadores obtivessem informações sobre a dinâmica do tráfego leucocitário e as interações celulares no fígado, permitindo dissecar a sequência de eventos que levam a doenças inflamatórias hepáticas. Siga as diretrizes de segurança do laser para fazer imagens com um laser infravermelho de pulso de alta energia usado para microscopia multifoto.

Certifique-se de que nenhum reflexo da radiação laser possa causar riscos aos seus olhos e pele durante a realização deste experimento.