Name: Crescimento Pairwise competição ensaio para determinar a replicação de Fitness de Imunodeficiência vírus humanos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Aprenda a realizar ensaios de competição de crescimento pairwise para determinar a aptidão de replicação relativa de cepas de HIV-1. Este método utiliza PCR quantitativo em tempo real e cromatogramas de sequenciamento Sanger para análise precisa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Esses estudos foram financiados por bolsas dos Serviços de Saúde Pública dos EUA P01AI057005, R01AI047734, R01AI111806 e pelo Núcleo de Perfil Funcional e Biologia Computacional do Centro de Pesquisa da AIDS da Universidade de Washington (P30 AI027757).

<ol><li>Domingo, E., Holland, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+virus+mutations+and+fitness+for+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">RNA virus mutations and fitness for survival.</a> Annu Rev Microbiol. 51, 151-178 (1997).</li>
<li>Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+viral+emergence%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+research%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of viral emergence.</a> Veterinary research. 41 (6), 38(2010).</li>
<li>Martinez-Picado, J., Martinez, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+reverse+transcriptase+inhibitor+resistance+mutations+and+fitness%3A+a+view+from+the+clinic+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">HIV-1 reverse transcriptase inhibitor resistance mutations and fitness: a view from the clinic and ex vivo.</a> Virus Res. 134 (1-2), 104-123 (2008).</li>
<li>Troyer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+fitness+impact+of+HIV-1+escape+mutations+to+cytotoxic+T+lymphocyte+%28CTL%29+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Variable fitness impact of HIV-1 escape mutations to cytotoxic T lymphocyte (CTL) response.</a> PLoS Pathog. 5 (4), e1000365(2009).</li>
<li>Rolland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino-acid+co-variation+in+HIV-1+Gag+subtype+C%3A+HLA-mediated+selection+pressure+and+compensatory+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Amino-acid co-variation in HIV-1 Gag subtype C: HLA-mediated selection pressure and compensatory dynamics.</a> PLoS One. 5 (9), e12463(2010).</li>
<li>Abraha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR5-+and+CXCR4-tropic+subtype+C+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates+have+a+lower+level+of+pathogenic+fitness+than+other+dominant+group+M+subtypes%3A+implications+for+the+epidemic%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">CCR5- and CXCR4-tropic subtype C human immunodeficiency virus type 1 isolates have a lower level of pathogenic fitness than other dominant group M subtypes: implications for the epidemic.</a> J Virol. 83 (11), 5592-5605 (2009).</li>
<li>Quinones-Mateu, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+infection%2Fcompetition+assay+shows+a+correlation+between+ex+vivo+human+immunodeficiency+virus+type+1+fitness+and+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A dual infection/competition assay shows a correlation between ex vivo human immunodeficiency virus type 1 fitness and disease progression.</a> J Virol. 74 (19), 9222-9233 (2000).</li>
<li>Ball, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+the+ex+vivo+fitness+of+CCR5-tropic+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates+of+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22B+and+C.+J+Virol%22%5BJournal%5D)">Comparing the ex vivo fitness of CCR5-tropic human immunodeficiency virus type 1 isolates of subtypes.</a> B and C. J Virol. 77 (2), 1021-1038 (2003).</li>
<li>Lanxon-Cookson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+relative+fitness+measurements+in+pairwise+competition+assays+of+human+immunodeficiency+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Factors affecting relative fitness measurements in pairwise competition assays of human immunodeficiency viruses.</a> J Virol Methods. 194 (1-2), 7-13 (2013).</li>
<li>Garcia-Lerma, J. G., MacInnes, H., Bennett, D., Weinstock, H., Heneine, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmitted+human+immunodeficiency+virus+type+1+carrying+the+D67N+or+K219Q%2FE+mutation+evolves+rapidly+to+zidovudine+resistance+in+vitro+and+shows+a+high+replicative+fitness+in+the+presence+of+zidovudine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Transmitted human immunodeficiency virus type 1 carrying the D67N or K219Q/E mutation evolves rapidly to zidovudine resistance in vitro and shows a high replicative fitness in the presence of zidovudine.</a> J Virol. 78 (14), 7545-7552 (2004).</li>
<li>Sharma, P. L., Crumpacker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuated+replication+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+with+a+didanosine-selected+reverse+transcriptase+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Attenuated replication of human immunodeficiency virus type 1 with a didanosine-selected reverse transcriptase mutation.</a> J Virol. 71 (11), 8846-8851 (1997).</li>
<li>Martinez-Picado, J., Savara, A. V., Sutton, L., D'Aquila, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+fitness+of+protease+inhibitor-resistant+mutants+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Replicative fitness of protease inhibitor-resistant mutants of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 73 (5), 3744-3752 (1999).</li>
<li>Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+reverse+transcriptase+mutants+G190S+and+G190A%2C+which+confer+resistance+to+non-nucleoside+reverse+transcriptase+inhibitors%2C+demonstrate+reductions+in+RNase+H+activity+and+DNA+synthesis+from+tRNA%28Lys%2C+3%29+that+correlate+with+reductions+in+replication+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 reverse transcriptase mutants G190S and G190A, which confer resistance to non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors, demonstrate reductions in RNase H activity and DNA synthesis from tRNA(Lys, 3) that correlate with reductions in replication efficiency.</a> Virology. 348 (2), 462-474 (2006).</li>
<li>Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+immune+escape+mutations+on+HIV-1+fitness+in+the+context+of+the+cognate+transmitted%2Ffounder+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Impact of immune escape mutations on HIV-1 fitness in the context of the cognate transmitted/founder genome.</a> Retrovirology. 9 (89), (2012).</li>
<li>Ali, A., Yang, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+small+reporter+gene+and+HIV-1+fitness+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel small reporter gene and HIV-1 fitness assay.</a> Journal of Virological Methods. 133 (1), 41-47 (2006).</li>
<li>Maarseveen, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+real-time+PCR+assay+to+determine+relative+replication+capacity+for+HIV-1+protease+variants+and%2For+reverse+transcriptase+variants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel real-time PCR assay to determine relative replication capacity for HIV-1 protease variants and/or reverse transcriptase variants.</a> J Virol Methods. 133 (2), 185-194 (2006).</li>
<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cytotoxic+T-lymphocyte+epitopes%3A+fitness-balanced+escape%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Evolution of human immunodeficiency virus type 1 cytotoxic T-lymphocyte epitopes: fitness-balanced escape.</a> J Virol. 81 (22), 12179-12188 (2007).</li>
<li>Anastassopoulou, C. G., Ketas, T. J., Klasse, P. J., Moore, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+CCR5+inhibitors+caused+by+sequence+changes+in+the+fusion+peptide+of+HIV-1+gp41%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Resistance to CCR5 inhibitors caused by sequence changes in the fusion peptide of HIV-1 gp41.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (13), 5318-5323 (2009).</li>
<li>Abraha, A., Troyer, R. M., Quinones-Mateu, M. E., Arts, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+determine+HIV-1+ex+vivo+fitness%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods to determine HIV-1 ex vivo fitness.</a> Methods Mol Biol. 304, 355-368 (2005).</li>
<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+real-time+PCR+based+assay+to+estimate+the+impact+of+amino+acid+substitutions+on+the+competitive+replication+fitness+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive real-time PCR based assay to estimate the impact of amino acid substitutions on the competitive replication fitness of human immunodeficiency virus type 1 in cell culture.</a> J Virol Methods. 189 (1), 157-166 (2013).</li>
<li>Brumme, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+replication+capacity+of+NL4-3+recombinant+viruses+encoding+reverse+transcriptase-integrase+sequences+from+HIV-1+elite+controllers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Acquir+Immune+Defic+Syndr%22%5BJournal%5D)">Reduced replication capacity of NL4-3 recombinant viruses encoding reverse transcriptase-integrase sequences from HIV-1 elite controllers.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 56 (2), 100-108 (2011).</li>
<li>Nomura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significant+reductions+in+Gag-protease-mediated+HIV-1+replication+capacity+during+the+course+of+the+epidemic+in%5BTitle%5D)+AND+%22Japan.+J+Virol%22%5BJournal%5D)">Significant reductions in Gag-protease-mediated HIV-1 replication capacity during the course of the epidemic in.</a> Japan. J Virol. 87 (3), 1465-1476 (2013).</li>
<li>Rolland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+conserved-element+vaccines%3A+relationship+between+sequence+conservation+and+replicative+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 conserved-element vaccines: relationship between sequence conservation and replicative capacity.</a> J Virol. 87 (10), 5461-5467 (2013).</li>
<li>Martinez-Picado, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitness+cost+of+escape+mutations+in+p24+Gag+in+association+with+control+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Fitness cost of escape mutations in p24 Gag in association with control of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 80 (7), 3617-3623 (2006).</li>
<li>Brockman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escape+and+Compensation+from+Early+HLA-B57-Mediated+Cytotoxic+T-Lymphocyte+Pressure+on+Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+Gag+Alter+Capsid+Interactions+with+Cyclophilin+A%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Escape and Compensation from Early HLA-B57-Mediated Cytotoxic T-Lymphocyte Pressure on Human Immunodeficiency Virus Type 1 Gag Alter Capsid Interactions with Cyclophilin A.</a> J Virol. 81 (22), 12608-12618 (2007).</li>
<li>Miura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA-associated+alterations+in+replication+capacity+of+chimeric+NL4-3+viruses+carrying+gag-protease+from+elite+controllers+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">HLA-associated alterations in replication capacity of chimeric NL4-3 viruses carrying gag-protease from elite controllers of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 83 (1), 140-149 (2009).</li>
<li>Basic Methods in Cellular and Molecular Biology, PCR: The Polymerase Chain Reaction. , JoVE. Cambridge, MA. Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5056/pcr-the-polymerase-chain-reaction">http://www.jove.com/science-education/5056/pcr-the-polymerase-chain-reaction</a> (2014).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. 62 (Apr 20), (2012).</li>
<li>Basic Methods in Cellular and Molecular Biology, Restriction Enzyme Digests. , JoVE. Cambridge, MA. Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5070/restriction-enzyme-digests">http://www.jove.com/science-education/5070/restriction-enzyme-digests</a> (2014).</li>
<li>McClure, J., van't Wout, A. B., Tran, T., Mittler, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte-monocyte+colony-stimulating+factor+upregulates+HIV-1+replication+in+monocyte-derived+macrophages+cultured+at+low+density%5BTitle%5D)+AND+%22J+Acquir+Immune+Defic+Syndr%22%5BJournal%5D)">Granulocyte-monocyte colony-stimulating factor upregulates HIV-1 replication in monocyte-derived macrophages cultured at low density.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 44 (3), 254-261 (2007).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimatingfifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hyg%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimatingfifty percent endpoints.</a> Am J Hyg. 27 (3), 493-497 (1938).</li>
<li>Nickle, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+and+ancestral+state+HIV+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Consensus and ancestral state HIV vaccines.</a> Science. 299 (5612), 1515-1518 (2003).</li>
<li>Rolland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+and+function+of+ancestral+center-of-tree+human+immunodeficiency+virus+type+1+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Reconstruction and function of ancestral center-of-tree human immunodeficiency virus type 1 proteins.</a> J Virol. 81 (16), 8507-8514 (2007).</li>
<li>Bryksin, A. V., Matsumura, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlap+extension+PCR+cloning%3A+a+simple+and+reliable+way+to+create+recombinant+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Overlap extension PCR cloning: a simple and reliable way to create recombinant plasmids.</a> Biotechniques. 48 (6), 463-465 (2010).</li>
<li>Spira, A. I., Ho, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+donor+cells+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+replication+and+selection+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Effect of different donor cells on human immunodeficiency virus type 1 replication and selection in vitro.</a> J. Virol. 69 (1), 422-429 (1995).</li>
<li>Manocheewa, S., Swain, J. V., Lanxon-Cookson, E., Rolland, M., Mullins, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitness+costs+of+mutations+at+the+HIV-1+capsid+hexamerization+interface%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fitness costs of mutations at the HIV-1 capsid hexamerization interface.</a> PLoS One. 8 (6), e66065(2013).</li>
<li>Zakeri, H., Amparo, G., Chen, S. M., Spurgeon, S., Kwok, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peak+height+pattern+in+dichloro-rhodamine+and+energy+transfer+dye+terminator+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Peak height pattern in dichloro-rhodamine and energy transfer dye terminator sequencing.</a> Biotechniques. 25 (3), 406-410 (1998).</li>
<li>Lalonde, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+oligonucleotide+ligation+assay+for+low-level+detection+of+nevirapine+resistance+mutations+in+human+immunodeficiency+virus+type+1+quasispecies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sensitive oligonucleotide ligation assay for low-level detection of nevirapine resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 quasispecies.</a> J Clin Microbiol. 45 (8), 2604-2615 (2007).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes. As opiniões aqui expressas são de responsabilidade dos autores e não deve ser interpretado como oficial ou representem os pontos de vista do Departamento de Defesa dos EUA ou o Departamento do Exército.

Os protocolos apresentados consistia de duas partes principais: construção de HIV-1 Os clones moleculares recombinantes e ensaios de competição de crescimento. A fim de distinguir dois vírus numa cultura de células duplamente infectadas, é importante que os clones moleculares concorrentes conter marcadores de sequências, que podem ser detectadas por um ensaio de iniciador-sonda de RT-qPCR ou por sequenciação de Sanger. Este protocolo faz uso das marcas Vifa e VifB, que ocupam a mesma região de HIV-1 NL4-3 e vif codificam a mesma sequência de aminoácido, mas que diferem por seis mutações sinónimas. Estas mutações foram mostrados para não afetar aptidão replicação viral 20. O método de clonagem baseada em PCR utilizada neste protocolo oferece mais flexibilidade na seleção de locais de clonagem, em comparação com a clonagem com base local de restrição. No entanto, a eficiência de clonagem de PCR diminui à medida que aumenta o tamanho do inserto. O limite atual do tamanho da inserção é ~ 5 kb 34. Para a clonagem baseada em PCR e local dirigida mutagenesis, a utilização de uma polimerase de DNA de alta-fidelidade é essencial para reduzir a probabilidade de mutações adicionais. A utilização de um número mínimo de ciclos de PCR necessários para produzir quantidades adequadas de produtos, também é recomendável. Em nossa experiência, nós não detectou quaisquer mutações extra depois que as etapas de clonagem e mutagénese dirigida ao local com base em PCR aqui descritos. No entanto, os produtos de PCR deve ser sequenciado para verificar quaisquer mutações indesejadas. Idealmente, a região de codificação inteira do HIV deve ser resequenced. Pelo menos três pontos de tempo de amostragem devem ser examinados na fase de crescimento exponencial 9. A cinética de crescimento viral deve primeiro ser estabelecida utilizando amostragem diariamente para determinar o período de cultura e tempo de amostragem pontos apropriados para a competição crescimento. Um factor que afecta a cinética do crescimento virai é a multiplicidade de infecção (MOI). Esse protocolo utiliza uma MOI total de 0,005 para ambos monoinfecção e concorrência de crescimento, uma vez que foi mostrado, para se obter mais roresultados busto do que inferior MOIs 9. No entanto, MOIs inferiores podem ser utilizados para se obter uma fase de crescimento exponencial mais longo se necessário, mas à custa de consistência resultado. Este protocolo sugere um rácio de 50:50 a infecção inicial, assumindo que as diferenças de aptidão dos vírus são geralmente desconhecidos de antemão. No entanto, a utilização de proporções desiguais de entrada são apropriadas quando houver dados preliminares que sugerem diferenças significativas na cinética de replicação virais. Nestes casos, uma taxa de infecção de 70:30 é recomendado para permitir a detecção de uma grande diferença de fitness, onde o vírus menos ajuste é colocado em excesso 9. O protocolo para determinar a TCID50, cinética de crescimento viral, e para a execução de ensaios de competição do crescimento foram optimizadas usando o HIV-1 do subtipo B, NL4-3 COTB-p24, e PBMC de um único dador cujos PBMC demonstraram susceptibilidade ao HIV consistente uma infecção in vitro. O período de culturae pontos de tempo de amostragem apresentados neste protocolo são susceptíveis de ser adequado para o estudo do HIV-1 grupo M vírus em PBMC humanos. Utilizando PBMC a partir de uma única fonte é altamente recomendável para obter resultados consistentes como a replicação viral pode variar em diferentes células de dador 35. Embora menos desejável, PBMC de doadores de múltiplos agrupados pode ser utilizado como uma substituição, desde que a mesma piscina é utilizado em todas as experiências. Outra alternativa é a utilização de linhas de células. O protocolo aqui apresentado foi usado com sucesso com a linha de células T CEMx174 23,36. No entanto, é importante que o número de células inoculadas são re-optimizados para conseguir o crescimento celular consistente. Cinética de crescimento virai também tem de ser re-estabelecido, uma vez que é susceptível de variar em diferentes linhas de células, para determinar os pontos de tempo de amostragem apropriados nas etapas de concorrência crescimento. Dois métodos diferentes para determinar a proporção viral para o cálculo de fitness estão incluídos no PROTOCol. O primeiro utiliza RT-qPCR para medir viral número de cópias de ADNc em cada ponto de tempo de amostragem. Aptidão replicação virai foi então calculado a partir da proporção viral, com base no número de cópias do ADNc. Em alternativa, a proporção viral pode ser determinada com base na relação entre a altura do pico cromatograma nos locais tag VifAB. Os dois métodos deram resultados comparáveis ​​(Figura 4). O método da altura de pico cromatográfico pode ser aplicado a outras estirpes de HIV-1 sem um marcador de sequência de engenharia. Para RT-qPCR, o uso de primers ou sondas para distinguir variantes virais deve primeiro ser cuidadosamente avaliados (ver 20). No entanto, a RT-qPCR proporciona uma melhor sensibilidade para as amostras com uma pequena quantidade de ARN virai, tais como aqueles a partir do primeiro ponto de tempo dentro da fase de crescimento exponencial. A medição directa de cDNA viral também permite a detecção de problemas técnicos que possam surgir a partir da extração de RNA e síntese de cDNA. Usando clones moleculares com etiquetas de seqüência fornece uma solução de custo eficaz to Os métodos de RT-qPCR, uma vez que apenas dois pares de iniciadores e sondas são necessários para estudar vários vírus. Esta estratégia também evita o problema da variação de pico-altura em sequência cromatogramas devido às bases vizinhas 37, como a sequenciação é realizada no mesmo local em todos os vírus do estudo. Os produtos de PCR produzidos por RT-qPCR e Sanger de sequenciação pode também ser usado com outros métodos para determinar a proporção viral, tais como grandes quantidades de sequenciação de clones individuais 12,13, HTA 4,7,17,19, ou um ensaio de ligação de oligonucleótidos (OLA) 38 .

Aptidão replicação viral é definida como a capacidade de um vírus para produzir progenitura infecciosa num dado ambiente 1 e é um factor importante na determinação da prevalência de uma variante do vírus a nível da população ao longo do tempo 2. Como estudos in vivo aptidão não era possível com os vírus humanos patogénicos, tais como VIH-1, vários in vitro e ex vivo, os ensaios de aptidão de replicação foram desenvolvidos para estudar os efeitos sobre a aptidão resultantes da resistência à droga e mutações de escape imune, epistasia e a evolução de populações virais 3-6. Entre os diferentes ensaios de aptidão, ensaios de competição de crescimento são reconhecidos para produzir medidas mais sensíveis e válidas de diferenças de fitness, como duas ou mais variantes virais competir para a mesma população de células justamente sob as mesmas condições ambientais, como ocorre in vivo 1,7,8. Antes de iniciar o crescimento experiências de competição, vários variables necessita de ser determinado, incluindo a utilização de diferentes multiplicidades de infecção (MOI), relação de entrada viral, e tempo de amostragem para análise. Estudamos os efeitos desses parâmetros na cinética de crescimento viral e sobre o resultado de experimentos de competição, e identificaram fatores-chave necessários para as medições robustas de HIV-1 em cultura de células de fitness 9. Além das variáveis ​​de ensaio, há uma variedade de métodos para a quantificação variantes virais em experiências de competição de crescimento. Massa de 10,11 ou 12,13 clonal sequenciação foi usado para determinar o rácio dos vírus que competem com base nas frequências de nucleótidos no sítio (s) de interesse. Aptidão Relativa é derivada de mudanças nesta relação ao longo do tempo. Este método é conveniente como serviços de sequenciação de DNA estão amplamente disponíveis. O alelo-específico sequenciamento paralelo método (PASS) permite sequenciamento em múltiplos locais ea detecção de recombinantes 14 </sup&gt;, Mas também requer especificamente desenvolvidos reagentes e sistemas de detecção. Essencialmente, estes métodos foram desenvolvidos para estudar estirpes virais com um pequeno número de diferenças de nucleótidos de uma região de interesse. Outros métodos utilizam um gene repórter pequeno 15 ou mutações sinônimas 4,16-18 como marcas para distinguir os vírus concorrentes por seqüenciamento, os ensaios de rastreamento de heteroduplexes (HTA) 4,7,17,19 ou reverter em tempo real reação em cadeia da polimerase transcrição-quantitativa (RT-qPCR) 15,16,18,20, todos os quais podem ser aplicados para estudar estirpes competindo independentemente de similaridade de sequência. É necessário um passo adicional para introduzir marcas em genomas virais e o ensaio de RT-qPCR também requer reagentes e instrumentos específicos. Descobrimos que a granel Sanger rendimentos seqüenciamento resultados comparáveis ​​9. Seguindo competição crescimento, aptidão replicação virai é apresentada como a aptidão relativa, ou uma relação entre t aptidãoWO variantes virais. A aptidão relativa de um vírus pode ser definido como a proporção final de uma variante virai normalizado pela sua proporção no inoculo inicial ou como a diferença da taxa de crescimento líquido entre os dois vírus concorrentes. Descobrimos que este último método, utilizando pontos de dados longitudinais apenas dentro da fase de crescimento exponencial, produziu os resultados mais robustos 9,20. Os ensaios in vitro de fitness são utilizados principalmente para estudar biológicos clones 6-8 e clones moleculares infecciosos do HIV-1. Este último, sendo passíveis de manipulação genética, são muitas vezes utilizados para estudar o efeito sobre a aptidão de mutações particulares ou sequências específicas de interesse 3-5,21,22. Os seguintes protocolos de descrever um fluxo de trabalho a partir do ponto de construção de novo de comprimento total de HIV-1 utilizando os clones moleculares infecciosos de HIV-1 vectores contendo uma sequência de etiqueta, a introdução de mutações de interesse, fazendo reservas virais e estabelecer uma cinética de crescimento viral, Para a realização do ensaio de competição e o cálculo do crescimento aptidão relativa (Figura 1). Usando nossos procedimentos otimizados, criamos três recombinantes de HIV-1 mutantes e determinou a sua aptidão de replicação. O clone molecular recombinante foi construído substituindo a região do gene de HIV-1 gag-p24 de pNL4-3, um plasmídeo contendo um genoma de comprimento total infeccioso do HIV-1 estirpe NL4-3 de laboratório, com um COTB sintético (Centro-OF- Árvore, subtipo B) sequência gag-p24 23 para criar a estirpe protótipo. Mudanças aminoácidos individuais (T186M, T242N, e I256V) foram então introduzidas para criar três clones mutantes. Cada mutante foi competiu contra o vírus protótipo de observar o impacto da aptidão de cada mutação na dada fundo genético. Os três mutantes demonstrado diferentes níveis de fsitness replicação de leve a significativamente menor do que o vírus protótipo. A mutação T242N foi previamente relatado para ter quen moderadass custar 24-26, semelhante ao resultado mostrado neste estudo. O custo da aptidão das outras duas mutações não tinha sido previamente relatado.

<table><tbody><tr><td>Construção de clones</td><td></td><td></td><td></td>recombinantes</tr><tr><td>Primer quimérico/Primers mutagênicos/sequenciamento</td><td>IDT</td><td></td><td>Oligos de DNA personalizados</td></tr><tr><td>plasmídeo pNL4-3VifA e pNL4-3VifB</td><td>Entre em contato com o Dr. James I Mullins (jmullins@uw.edu)</td>Polimerase de DNA de alta fidelidade Thermo Scientific F-549S Tampão de alta fidelidade <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Termociclador Thermo Scientific</td><td>F-549S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Bioline</td><td>Bio-39026</td><td></td></tr><tr><td>Life</td><td></td><td></td><td>Technologies Applied Biosystems&reg; GeneAmp&reg; Sistema de PCR 9700</td></tr><tr><td>Corante de carregamento de DNA</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0631</td><td></td></tr><tr><td>1 kb Plus escada de DNA</td><td>Invitrogen</td><td>10787-018</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit de purificação de PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extração de gel QIAquick Qiagen</td><td></td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>DpnI enzima</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>TOP10 quimicamente competente Escherichia coli</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-10</td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth base em pó</td><td>Invitrogen</td><td>12795-084</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Research Products International</td><td>C46000-25.0</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Transfecção</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9 DNA transfecção reagente</td><td>Roche</td><td>6365787001</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T-17</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td>http://www.atcc.org/</td></tr> <tr><td>0.22 &#956; tubo superior do filtro m</td><td>VWR International</td><td>89220-716&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cultura de</td><td></td><td></td><td></td>células</tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>Iscove&prime; s Dulbecco modificado&prime; s Medium (IMDM)</td><td>Life Technologies</td><td>31980-030</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 media</td><td>Life Technologies</td><td>61870-036</td><td></td></tr><tr><td>Fitohemaglutinina (PHA)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R30852801</td><td></td></tr><tr><td>Interleucina-2 Humana</td><td>Roche</td><td>11147528001</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>JR Scientific</td><td>43640</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina e estreptomicina</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 poços</td><td>VWR Scientific</td><td>73520-906</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 48 poços</td><td>VWR Scientific</td><td>62407-338</td><td></td></tr><tr><td>Placa de fundo plano de 96 poços</td><td>ISC Bioexpress</td><td>T-3015-4</td><td></td></tr><tr><td>Placa de fundo redondo de 96 poços</td><td>BD Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 1,5 ml</td><td>Mt. Baker Bio</td><td>MBD-1500</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 1,5 ml com O-ring</td><td>VWR Scientific</td><td>89004-290</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico de 50 ml</td><td>ISC Bioexpress</td><td>C-3317-6</td><td></td></tr><tr><td>ELISA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Tampão fosfato salino (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0392</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Coelho anti-HIV-1 SF2 p24 anti-soro</td><td>NIH AIDS Reagent Program</td><td>4250</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-coelho HRP</td><td>KPL</td><td>474-1516</td><td></td></tr><tr><td>Substrato de peroxidase de micropoço TMB</td><td>KPL</td><td>52-00-01</td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>A300-500</td><td>Causa queimaduras graves por todas as vias de exposição. Use equipamento de proteção individual. Use apenas sob uma coifa química. Lave imediatamente com água em abundância por pelo menos 15 min.</td></tr><tr><td>Programa padrão de HIV p24</td><td>para AIDS e vírus do câncer (NCI-Frederick)</td><td></td><td>Para obter detalhes do pedido, entre em contato com Julian Bess, Jr. (bessjw@mail.nih.gov); http://ncifrederick.cancer.gov/Programs/Science/Acvp/bio/Bess.aspx</td></tr><tr><td>Leitor de microplacas</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>VMax Kinetic ELISA Leitor de microplacas</td></tr><tr><td>Isolamento de RNA síntese</td><td></td><td></td><td></td>de cDNA</tr><tr><td>QIAxtractor</td><td>Qiagen</td><td></td><td>http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/sample-prep/qiaxtractor</td></tr><tr><td>QIAamp Kit Mini de RNA Viral</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Bioline</td><td>Bio-39026</td><td></td></tr><tr><td>SuperscriptIII</td><td>Invitrogen</td><td>18080-085</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de primeira fita&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18080-085</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Invitrogen</td><td>18080-085</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de Rnase</td><td>Roche</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>RnaseH</td><td>Invitrogen</td><td>18021-071</td><td></td></tr><tr><td>qPCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Máquina de qPCR em tempo real</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Applied Biosystems 7300 PCR em tempo real&nbsp;</td></tr><tr><td>TaqMan&reg; Expressão Gênica Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr>Primer <td>IDT</td><td></td><td>para frente, reverso</td><td>Ordem personalizada</td></tr><tr><td>Sonda</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de reação óptica de 96 poços</td> de ordem personalizada <td>Life Technologies</td><td>I19N3Q216</td><td></td></tr><tr><td>PCR+sequenciamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polimerase (Biolase)</td><td>Bioline</td><td>Bio-21043</td><td></td></tr><tr><td>Tampão NH4</td><td>Bioline</td><td>Bio-21043</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Bioline</td><td>Bio-21043</td><td></td></tr><tr><td>Primer de sequenciamento</td><td>IDT</td><td></td><td>Pedido personalizado</td></tr><tr><td>QIAxcel</td><td>Qiagen</td><td></td><td>http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/detection-and-analysis/qiaxcel-advanced-system</td></tr><tr><td>Provedor de serviços de sequenciamento de DNA</td><td>http://www.htseq.org/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ferramenta web GRC</td><td>http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ferramenta web ChromatQuan</td><td>http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

crescimento pairwise competição ensaio para determinar a replicação de fitness de imunodeficiência vírus humanos

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Os ensaios de aptidão in vitro são ferramentas essenciais para determinar a aptidão da replicação viral para vírus como o HIV-1. Várias medições foram usadas para extrapolar a aptidão da replicação viral, variando do número de partículas virais por unidade infecciosa, taxa de crescimento em cultura de células e aptidão relativa derivada de ensaios de competição de crescimento de múltiplos ciclos. Os ensaios de competição de crescimento fornecem uma medida particularmente sensível da aptidão, uma vez que os vírus estão competindo por alvos celulares sob condições de crescimento idênticas. Existem vários fatores experimentais a serem considerados ao realizar ensaios de competição de crescimento, incluindo a multiplicidade de infecção (MOI), tempos de amostragem e métodos de detecção viral e cálculo de aptidão. Cada fator pode afetar o resultado final e, portanto, deve ser considerado cuidadosamente durante o projeto experimental. O protocolo aqui apresentado inclui etapas desde a construção de um novo clone recombinante do HIV-1 até a realização de ensaios de competição de crescimento e análise dos resultados experimentais. Este protocolo utiliza valores de parâmetros experimentais previamente mostrados para produzir resultados consistentes e robustos. Alternativas são discutidas, pois alguns parâmetros precisam ser ajustados de acordo com o tipo de célula e vírus em estudo. O protocolo contém dois métodos alternativos de detecção viral para fornecer flexibilidade, pois a disponibilidade de instrumentos, reagentes e experiência varia entre os laboratórios.

Para estudar o impacto das mudanças de fitness de um único aminoácido em HIV-1 Gag-p24, utilizou-se mutagénese dirigida oligonucleotídeo para introduzir mutações num plasmídeo pNL4-3 contendo o gene 23,32,33 HIV-1 COTB-p24. Stocks virais foram produzidos por transfecção de células 293T e depois colhidas 48 horas. Estimou-se a cultura de tecidos de dose de 50% infecciosas (TCID 50) de cada ação viral pelo método de Reed-Muench 31. O TCID 50 do protótipo e vírus mutantes variou de abril 10 - maio 10 UI / ml (Figura 3A). A cinética de crescimento dos vírus recombinantes foram estabelecidos em PBMC a partir de um único dador, a uma MOI de 0,005. RT-qPCR foi utilizado para medir o número da cópia de ADNc viral por dia durante seis dias. Todos os mutantes e vírus protótipo cresceram exponencialmente entre o dia 2 e no dia 4, após o que retardou o crescimento viral, tal como indicado por uma diminuição da inclinação do aumento do número cópia de RNA viral (&lt;forte&gt; Figura 3B). A diminuição do número de cópias de cDNA entre o dia 0 (o que corresponde ao do inóculo) e dia 2 é devido à absorção do vírus às células e a remoção de viriões não ligados por lavagem no dia 1 (passo 5.1.6). Na fase de crescimento exponencial, todos os três mutantes tinham uma taxa de crescimento mais lenta (g) do que o vírus protótipo (Figura 3C). Todos os três mutantes foram competiu contra o vírus protótipo em ensaios de competição de crescimento a uma MOI total de 0,005. Cinética de crescimento virai em culturas infectadas duplamente foi semelhante ao do mono-infecção; a fase exponencial de crescimento virai foi entre os dias 2 e 4, e o crescimento viral atingido um patamar por volta do dia 5 (Figura 4A). Viral diferenças de taxas de crescimento foram obtidos a partir da alteração na proporção da virai ao longo do tempo. A proporção viral foi calculada com base no número de cópias de cDNA do vírus de referência e os mutantes, utilizando RT-qPCR, e por comparando alturas de picoem sequência cromatogramas em locais de nucleótidos que distinguem os dois vírus (Figura 4B). As diferenças nas taxas de crescimento determinado utilizando a pico-altura e cópia de RNA virais Número métodos obtiveram resultados semelhantes (Figura 4C). Todos os três mutantes tiveram aptidão replicação mais baixa do que os vírus protótipo com o I256V mutante tendo o menor aptidão (Figura 4C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig1.jpg" /> Figura 1: Diagrama de fluxo dos protocolos apresentados neste trabalho o vírus protocolos de preparação preocupação construção de HIV-1 clones recombinantes e geração de stocks virais.. Os protocolos para exercício ensaios são para estabelecer uma cinética de crescimento viral e a determinação da replicação viral relativo. As linhas tracejadas representam os fluxos alternativos para os protocolos. Por exemplo, uma mutação pode ser introduzida directamente no HIV-1 NL4-3clone molecular sem gerar um clone recombinante. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig2.jpg" /> Figura 2:. Construção de HIV-1 NL4-3 COTB Gag p24 clones moleculares recombinantes utilizando extensão de sobreposição PCR (A) Concepção dos iniciadores quiméricos. A 5 &#39;metades dos iniciadores contêm a sequência do vector NL4-3 e a 3&#39; metades conter as extremidades da sequência de inserção. (B) os iniciadores quiméricos são utilizados para amplificar o fragmento de inserção, COTB Gag p24. (C) Os fragmentos de inserção são utilizados como iniciadores para uma segunda PCR para gerar um novo plasmídeo recombinante. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig3.jpg" /> Figura 3:. Características de crescimento viral em PBMC (A) Log10 TCID50 </sub&gt; de stocks virais. (B) uma cinética de crescimento viral em monoinfections começado a uma MOI = 0,005. (C) as taxas virais mais de seis dias de crescimento, incluindo a fase exponencial de crescimento (dias 2-4) derivada a partir do painel (B). Os valores apresentados representam a média de três repetições de uma experiência. As barras de erro representam intervalos de confiança de 95%. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig4.jpg" /> Figura 4: o crescimento viral e fitness relativa determinações (A) o crescimento viral em culturas de PBMC duplamente infectados.. (B) Rácios de vírus T242N e protótipos determinada utilizando RT-qPCR ou o método de sequenciação de pico-altura. (C) diferenças líquidas virais taxa de crescimento (D) entre o mutante e os vírus protótipo em culturas duplamente infectadas, como mostrado em (A). d valores foram calculados from a relação dos dados mostrados na virais (B). Os valores apresentados representam a média de três repetições de uma experiência. As barras de erro representam intervalos de confiança de 95%.

A competição de crescimento entre vírus quase isogênicos fornece uma medida sensível para determinar a aptidão relativa da replicação. Os protocolos descritos aqui incluem a construção de clones recombinantes do HIV-1, propagação do vírus e competição de crescimento e métodos de análise otimizados para produzir resultados sensíveis e consistentes.

Crescimento Pairwise competição ensaio para determinar a replicação de Fitness de Imunodeficiência vírus humanos

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

O objetivo geral deste procedimento é determinar a aptidão relativa de replicação de cepas de HIV-um de interesse. Isso é realizado primeiramente pela construção de clones moleculares virais ou plasmídeos de DNA contendo sequências completas de HIV-um de interesse. O segundo passo é gerar estoques virais para cada clone molecular por meio de transfeção de DNA.Em seguida, a cinética de crescimento e a fase de crescimento exponencial de cada cepa de HIV-1 são estabelecidas por meio de amostragens longitudinais de culturas celulares mono-infectadas. O passo final consiste em realizar competição de crescimento em pares ou infecção dupla em culturas celulares. Por fim, a transcrição reversa, a PCR quantitativa em tempo real e as alturas dos picos dos cromatogramas de sequenciamento de DNA obtidos por meio do sequenciamento de DNA de Sanger são utilizadas para determinar as proporções virais, as quais são então usadas para calcular a aptidão relativa de replicação viral.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como infecção para-mono ou infecção dupla em dois pontos temporais, é que ela fornece medições mais sensíveis e robustas da diferença de aptidão replicativa entre duas cepas virais. Os protocolos apresentados neste artigo abrangem a construção de clones recombinantes de HIV-1, a introdução de mutações de interesse por mutagênese direcionada a sítios específicos, a produção de estoques virais e a realização de ensaios de aptidão para estabelecer a cinética de crescimento viral e determinar a aptidão viral relativa. Este vídeo demonstrará a competição de crescimento e dois métodos diferentes.Para determinar a proporção viral para o cálculo da aptidão, consulte o texto do protocolo para todos os demais procedimentos. Para preparar o ensaio de competição de crescimento, semeie três vezes 10 à quinta potência de células mononucleares do sangue periférico estimuladas com PHA, ou PBMCs, em um volume total de 500 microlitros por poço em uma placa de fundo plano de 48 poços. Mantenha a placa a 37 graus Celsius em uma atmosfera com 5% de dióxido de carbono até a inoculação. Em seguida, prepare três mililitros de inóculo contendo 6.000 UI para cada vírus.Em um experimento típico, múltiplos mutantes são testados, mas para fins desta demonstração, apenas um mutante será testado contra o vírus protótipo. A preparação adequada do inóculo viral é uma etapa crítica neste procedimento, pois pode ser necessária uma diluição seriada do estoque viral com título infeccioso muito alto. Transfira 1,5 mililitro de cada inóculo viral para um tubo estéril para criar o inóculo de infecção dupla.Adicione 500 microlitros do inóculo duplo aos PBMCs estimulados com PHA em cada poço da placa de 48 poços. O volume final de cultura é de um mililitro por poço. Aliquote 200 microlitros por poço do inóculo duplo para duas placas de 96 poços para isolamento de RNA. Guarde uma placa como reserva. Incube as células inoculadas a 37 graus Celsius em atmosfera com 5% de dióxido de carbono por 16 a 24 horas. De 16 a 24 horas após a inoculação, lave as culturas, remova e descarte 750 microlitros do sobrenadante da cultura e adicione 750 microlitros de meio completo Iscove′s Modificado de Dulbecco′s ou cIMDM fresco.Envolva a placa com filme plástico e centrifugue por 10 minutos. A 300 ×g, remova e descarte 750 microlitros do sobrenadante. Adicione 750 microlitros de cIMDM fresco. Incube as placas a 37 graus Celsius em atmosfera com 5% de dióxido de carbono. Os momentos de coleta devem ser escolhidos de modo a incluir pelo menos três pontos temporais dentro da fase exponencial de crescimento viral.Para coletar uma amostra, transfira 500 microlitros do sobrenadante da cultura para um tubo de centrífuga de 1,8 mililitro e centrifugue por um minuto a 3000 g. Transfira 200 microlitros do sobrenadante livre de células para duas placas de amostras de 96 poços para o isolamento de RNA. Novamente, guarde uma placa como reserva. Armazene os sobrenadantes a menos 80 graus Celsius até o isolamento de RNA.Adicione 500 microlitros de cIMDM fresco a cada cultura e retorne a placa ao incubador até o próximo momento de coleta. Posteriormente, o RNA é isolado das amostras, seguido da síntese de cDNA. Dois métodos para determinação das proporções virais serão demonstrados.O primeiro utilizando transcrição reversa, PCR quantitativo em tempo real ou RT qPCR, e o segundo utilizando as alturas dos picos do cromatograma. Para qPCR, prepare uma série de diluições padronizadas em triplicata do plasmídeo pNL4-3VifA, diluindo dez vezes em cada etapa, de três vezes 10 à sexta cópias por microlitro até 30 cópias por microlitro. Monte uma placa de reação qPCR de 96 poços.Cada placa deve conter pelo menos um controle negativo, a série de diluição padrão em triplicata e duplicatas de cada amostra de cDNA. Utilize um par de iniciador e sonda vFIA para detectar sinais nos controles negativos, na série de diluição padrão e em uma duplicata da amostra de cDNA. Utilize o par de iniciador e sonda vIFB com a outra duplicata da amostra de cDNA. Para cada reação de qPCR, utilize 12,5 microlitros da mistura mestra de qPCR, 0,2 micromolar da sonda de qPCR, 0,8 micromolar de cada um dos iniciadores direto e reverso e um microlitro de cDNA. Para a série de diluição padrão, adicione a diluição em série de pNL4-3VifA em vez de cDNA; para os controles negativos, utilize água ou tampão em vez de cDNA. Configure os parâmetros de ciclagem de PCR conforme as instruções do fabricante para operar a máquina de qPCR. Calcule a curva padrão utilizando os dados de amplificação da série de diluição padrão.Compare os dados de amplificação das amostras de cDNA com a curva padrão para determinar o número de cópias. Utilize o cálculo da taxa de crescimento viral ou a ferramenta web GRC para calcular a aptidão viral relativa. Insira o número de cópias de cDNA obtido na etapa de RT-qPCR no formato especificado indicado. Selecionar calcular exibirá a diferença de taxa de crescimento líquida entre dois vírus em competição. Para determinar as proporções virais utilizando as alturas dos picos do cromatograma, amplifique por PCR fragmentos do HIV-1 VIF contendo a marcação da sequência VIFAB usando os primers VIF sentido e VIF antissentido. Para cada reação de PCR, utilize um microlitro de cDNA, tampão 1X NH4, 1,5 milimolar de MgCl2, 0,2 milimolar de dNTPs, 2,5 U de polimerase Taq e 0,45 micromolar de cada primer.Adicione água até um volume final de 50 microlitros. Defina os parâmetros de ciclagem da PCR como três ciclos a 94 graus Celsius por um minuto, 55 graus Celsius por um minuto e 70 graus Celsius por um minuto, seguidos por 34 ciclos a 94 graus Celsius por 15 segundos, 58 graus Celsius por 30 segundos e 70 graus Celsius por um minuto. E, finalmente, uma etapa de espera a 4 graus Celsius. Posteriormente, purifique os produtos da PCR utilizando um kit comercialmente disponível e envie os produtos da PCR purificados a um prestador de serviço de sequenciamento de DNA para sequenciamento de Sanger.Verifique a pontuação média da qualidade da leitura fornecida pelo serviço de sequenciamento. Se a precisão média da chamada de base for inferior a 85%, repita a purificação da amplificação por PCR, dos produtos de PCR e o sequenciamento de Sanger. Utilize a ferramenta web Chromat Quantitative para calcular a proporção viral em cada ponto temporal.As entradas necessárias são a sequência líder e o arquivo do cromatograma de sequência no formato .ab1. A ferramenta mede a intensidade do pico no sítio especificado.A razão entre as intensidades dos picos corresponde à razão entre os dois vírus. Utilize a ferramenta web GRC para calcular a aptidão viral relativa. A entrada consiste na altura dos picos do cromatograma de sequência obtida usando a ferramenta web Chromat quantitative no formato especificado indicado. A ferramenta web GRC calculará a diferença na taxa de crescimento líquido entre as duas cepas virais em competição. Um vírus protótipo e três vírus mutantes do HIV foram construídos e seu crescimento em PBMCs foi caracterizado. O TCID50 variou de 104 a 105 UI por mililitro. Todos os vírus cresceram exponencialmente entre o segundo e o quarto dia.Na fase de crescimento exponencial, os três mutantes apresentaram uma taxa de crescimento mais lenta do que o vírus protótipo. Cada mutante foi colocado em competição com o vírus protótipo em ensaios de competição de crescimento com uma MOI total de 0,005; a cinética de crescimento viral em culturas duplamente infectadas foi semelhante à da infecção monocultura. A fase de crescimento exponencial viral ocorreu entre os dias dois e quatro, e o crescimento viral atingiu um platô por volta do dia cinco.As diferenças na taxa de crescimento viral foram derivadas da alteração na proporção viral ao longo do tempo. A proporção viral foi calculada com base no número de cópias de cDNA dos vírus de referência e mutante, utilizando RT-qPCR, e pela comparação das alturas dos picos em cromatogramas de sequência em sítios de nucleotídeos que distinguem os dois vírus, sendo o mutante T242-N comparado ao protótipo. Neste exemplo, as diferenças na taxa de crescimento determinadas pelos dois métodos geraram resultados semelhantes.Os três mutantes apresentaram menor aptidão replicativa do que o vírus protótipo, sendo que o mutante I256-V exibiu a menor aptidão. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar ensaios de competição de crescimento aos pares para determinar a aptidão replicativa relativa do HIV-1.

pairwise-growth-competition-assay-for-determining-replication-fitness

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

A região da coroa de seqüências diferentes V3 loop do envelope glicoproteína de superfície (gp120) do HIV-1 pode ser caracterizada estruturalmente em muitos casos por in silico dobrar de posições 10-22 do loop usando um...

Avaliação da dinâmica imunologicamente relevantes Terciário características estruturais do HIV 1-V3 loop Sequence R2 Crown por Ab initio Folding

Nós descrevemos um protocolo para identificar papéis fundamentais de moléculas de sinalização de acolhimento na replicação lítica de um herpesvírus modelo, gama herpesvírus 68 (γHV68). Utilizando linhagens de camundongos geneticamente modificados e fibroblastos embrionárias para γHV68 replicação lítica, o protocolo permite tanto caracterização fenotípica e molecular de interrogatório vírus-hospedeiro interações em replicação lítica viral.

Dissecando interação hospedeiro-vírus em replicação lítica de um herpesvírus modelo

Source: Manocheewa, S., et al. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the procedure for a growth competition assay to measure the relative replication fitness of two viral strains by comparing their replication in human immune cells.

An Assay for Measuring the Relative Replication Fitness of Viral Strains

Aqui, descrevemos a citotoxicidade celular e ensaios de infecciosidade redondas únicas que permitem a triagem rápida e exacta de compostos para determinar a sua citotoxicidade celular (CC 50) e os valores de IC50 contra a WT e resistentes de HIV-1 da droga.

Triagem rápida de HIV transcriptase reversa e integrase Inibidores

A patogênese do HIV-1 é definida tanto pelas características virais quanto pelos fatores genéticos do hospedeiro. Aqui descrevemos um método robusto que permite medições reprodutíveis para avaliar o impacto da variação da sequência do gene gag na capacidade de replicação in vitro do vírus.

A Enzima de Restrição método baseado Clonagem para avaliar a<em&gt; In vitro</em&gt; Replicação Capacidade de HIV-1 do subtipo C gag-MJ4 quiméricos Vírus

Métodos para avaliar a eficácia e toxicidade de moléculas de RNA visando etapas pós-integração do ciclo de replicação do HIV-1 são descritos. Esses métodos são úteis para rastrear novas moléculas e otimizar o formato das existentes.

Avaliação da eficácia e toxicidade de RNAs Segmentação HIV-1 Produção para uso em Gene ou Quimioterapia

Infecção de tecidos humanos com vírus de imunodeficiência humana (HIV) ex vivo fornece um valioso modelo 3D da patogênese do vírus. Aqui, descrevemos um protocolo para processar e infectar amostras de tecido da amígdalas humanas e mucosa genital feminina com HIV-1 e mantê-las em cultura em uma interface líquido-ar.

Ex Vivo Infecção da Mucosa Genital humano tecido linfoide e fêmea com vírus de imunodeficiência humana 1 e Histoculture

Descrevemos um ensaio baseados em células para relatório sobre HIV-1 fusão através da expressão da proteína verde fluorescente detectável por microscopia de fluxo cytometry ou fluorescência. Ele pode ser usado para testar a inibidores de entrada viral (especificamente na etapa de fusão) em sistemas de infecção sem célula e célula a célula.

Um elevado-throughput Cre-Lox ativado ensaio de fusão da membrana Viral para identificar inibidores de fusão da membrana Viral do HIV-1

Este protocolo fornece um método para estabelecer ratos humanizados (hu-NSG) através da injeção de colestase de células estaminais hematopoiéticas em camundongos NSG neonatais condicionada por radiação. O mouse hu-NSG é suscetível à infecção pelo HIV e terapia anti-retroviral combinatória (carrinho) e serve como um modelo fisiopatológico apropriado para investigações de latência e a replicação do HIV.

Humanizado NOD/SCID/IL2rγnula (hu-NSG) Mouse modelo para estudos de latência e a replicação do HIV

Aqui, descrevemos alguns métodos estabelecidos para determinar o estresse do retículo endoplasmático (ER) e a ativação da resposta proteica desdobrada (UPR), com ênfase particular na infecção pelo HIV-1. Este artigo também descreve um conjunto de protocolos para investigar o efeito do estresse do RE/UPR na replicação do HIV-1 e na infectividade do vírion.

Medindo o estresse do retículo endoplasmático e a resposta da proteína desdobrada em células T infectadas pelo HIV-1 e analisando seu papel na replicação do HIV-1

Aprenda a realizar ensaios de competição de crescimento pairwise para determinar a aptidão de replicação relativa de cepas de HIV-1. Este método utiliza PCR quantitativo em tempo real e cromatogramas de sequenciamento Sanger para análise precisa.

Crescimento Pairwise competição ensaio para determinar a replicação de Fitness de Imunodeficiência vírus humanos

Explorar mais vídeos