De alto rendimento quantitativo em tempo real de RT-PCR Ensaio para Determinar Perfis de Expressão do tipo I e III do interferão subtipos

O objetivo geral deste procedimento é preparar e executar 384 placas de ensaio de poço para análise de alto rendimento de um grupo altamente homólogo de genes, como os subtipos de interferon tipo um e três. Isso é feito preparando primeiro a diluição serial padrão usada para executar as placas de ensaio. Em seguida, a sonda de primer e as misturas de material de trabalho sem controle de modelo usadas para fazer as placas são preparadas.

Em seguida, as 384 placas de ensaio de poço são preparadas usando um pipetador multicanal automatizado e são secas para armazenamento. Finalmente, as 384 placas de ensaio de poço são executadas e analisadas. Em última análise, o ensaio RT PCR R quantitativo de alto rendimento em tempo real é usado para definir assinaturas de expressão de interferon em modelos de cultura de tecidos, estudando patógenos ou em amostras clínicas no contexto de doenças infecciosas ou autoinflamatórias.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como R quantitativo dois PCR, usando sondas lineares padrão ou cyberg green, é que o farol molecular e as sondas fluorescentes de ácido nucleico de bloqueio podem ser usadas para discriminar diferenças de par de bases únicas entre sequências altamente semelhantes Após o descongelamento, vórtice e centrifugação breve de um esperma padrão e salmão ou SSDNA. Prepare a mistura de água SSD NA para os 17 conjuntos de diluição padrão misturando 51 microlitros de SSNA com 20,3 mililitros de água. Dispense 190 microlitros da mistura de água SS DNA para o primeiro tubo de uma tira de PCR de oito tubos e 180 microlitros para os próximos cinco tubos.

Realize uma diluição de um a 20 transferindo 10 microlitros do estoque padrão de 50 Picomolar para o tubo com 190 microlitros de vórtice de mistura de água SSDNA e centrifugue rapidamente. A tira de PCR realiza uma diluição de um a 10 transferindo 20 microlitros do tubo diluído mais recentemente para o próximo tubo no vórtice da série e centrifuga rapidamente a tira de PCR. Repetir a diluição de um a 10 até que o último tubo da série tenha recebido o padrão.

Depois de rotular até 17 tubos de dois mililitros, use uma pipeta eletrônica multicanal de 12,5 microlitros para adicionar dois microlitros de SSDNA a cada tubo usando primers e sondas preparadas de acordo com o protocolo de texto. Adicione o primer direto apropriado, o primer reverso e a sonda a cada primer. Tubo de estoque de trabalho do conjunto de sonda para preparar o controle sem modelo ou misturas de estoque de trabalho NTC.

Transfira 14,3 microlitros de cada conjunto de sonda de primer para o tubo de mistura de material de trabalho NTC apropriado de acordo com esta tabela. Após a remoção de um Eloqua dos conjuntos de sondas de primer necessários para as misturas de material de trabalho NTC a 1,5 mililitros de água para trazer o volume final de cada tubo de estoque de trabalho do conjunto de sonda de primer para 1,7 mililitros. Para preparar uma placa de fonte de 96 poços dos conjuntos de sondas de primer e misturas NTC.

Coloque uma nova placa de 96 poços em um bloco de resfriamento de 96 poços resfriado e designe os poços com o conjunto correto de sonda de primer ou mistura NTC usando uma pipeta eletrônica multicanal de 250 microlitros. Adicione 66 microlitros de água a cada conjunto de sonda de primer. Poço dispensar 82,5 microlitros de água para os quatro poços alvo 17

Dispense 27,5 microlitros de água em cada mistura anti-C. Bem, em seguida, adicione 54 microlitros das sondas de primer corretas no estoque de trabalho às sondas de primer designadas na distribuição de poços. 67,5 microlitros do conjunto de trabalho da sonda de primer alvo 17 para as sondas de primer alvo 17 designadas nos poços.

Adicione 22,5 microlitros da mistura correta de material de trabalho NTC aos poços designados. Em seguida, use uma vedação de placa adesiva para selar a placa de 96 poços e centrifugue por um minuto a 700 Gs para garantir que o conteúdo esteja no fundo dos poços com o adaptador de 96 poços. Coloque a placa no misturador de vórtice e misture a 1000 RP por um minuto.

Em seguida, centrifugue a placa a 700 Gs durante cinco minutos. Para preparar as placas de ensaio de poço 384, ligue o pipetador multicanal automatizado e clique duas vezes no ícone do software para abrir o protocolo de fabricação de placas de ensaio de interferon para configurar a plataforma. Coloque uma caixa de ponteira de pipeta completamente cheia na posição um da plataforma, a placa de fonte de 96 poços na posição quatro e uma nova placa de 384 poços na posição seis.

Comece a corrida pressionando o botão play quando a execução estiver concluída. Bata suavemente a placa de ensaio do poço 384 em uma superfície plana para garantir que os fluidos estejam no fundo dos poços e aplique uma vedação adesiva da placa depois de girar a placa a 700 Gs por um minuto. Remova a vedação da placa adesiva.

Coloque a placa de ensaio de 384 poços no secador de placas e posicione o coletor de 384 poços diretamente acima dos poços. Uma vez que o conteúdo das placas de ensaio de 384 poços esteja seco. Aplique um novo selo de placa adesiva, etiqueta de folha rápida e armazene no escuro a quatro graus Celsius até usar para carregar e executar a placa de ensaio.

Prepare duas misturas de genes de limpeza ou poços HKG diluindo dois microlitros de SSDNA em 84,9 microlitros de água. Em seguida, adicione dois microlitros do SSD NA diluído 11.8 microlitros de água, 23 microlitros de master mix e 9.2 microlitros do conjunto correto de sonda de primer 20 XHKG para cada tubo HKG rotulado, vórtice e centrifugue brevemente após preparar as amostras e CDNA de controle positivo a 78.8 microlitros de master mix e 54.8 microlitros de água para cada amostra de 24 microlitros e tubo de controle positivo. Para preparar os padrões e as misturas de poços NTC a serem adicionadas a uma placa de ensaio de poço 384 seco, adicione 165 microlitros de água a 275 microlitros de master mix em um tubo de 1,5 mililitro para o poço NTC misture a 52,5 microlitros de água para 52,5 microlitros de master mix em um tubo de 1,5 mililitro.

Remova uma placa de ensaio de poço 384 seco previamente preparada de quatro graus Celsius e centrifugue a 700 GS por um minuto. Com a pipeta eletrônica multicanal de 30 microlitros, dispense 7,5 microlitros de NTC. Bem, misture a cada NTC.

Dispense seis microlitros da mistura de poços padrão e 1,5 microlitros do padrão para cada padrão. Em seguida, dispense 7,5 microlitros da amostra para os poços designados com uma pipeta eletrônica multicanal de 12,5 microlitros. Dispense 2,5 microlitros das misturas da sonda de primer HKG nos poços designados após usar filme adesivo óptico para selar a placa e a centrifusão a 700 Gs por um minuto vórtice a placa selada de 384 poços no misturador de vórtice a 2.600 RPM por dois minutos e centrifugue a 700 queijo por cinco minutos.

Finalmente, coloque a placa de ensaio selada na máquina Q-R-T-P-C-R. Abra o modelo para o layout do ensaio e usando as seguintes condições de reação. Comece a execução, exporte e analise os dados de acordo com o protocolo de texto Como visto nesta figura, as assinaturas de expressão de interferon do tipo humano um e três foram analisadas em células mononucleares do sangue periférico ou p BMCs de seis doadores estimulados com ligantes de receptores toll-like.

Os dados são apresentados como gráficos de radar em uma escala logarítmica usando dois métodos de análise, incluindo o valor absoluto de CQ normalizado para o gene de manutenção e o número de cópias do molde por micrograma de RNA total. Os dados mostram que as assinaturas de expressão de interferon humano eliciadas por agonistas de TLR são assinaturas de expressão específica de ligante dos tipos um e três de interferon em Resus Maccas. Também foram específicos para o ligante TLR neste experimento, PBMC de três doadores foram estimulados com três ligantes por três horas.

A expressão do subtipo de interferon em células não estimuladas no início do estudo foi baixa, como mostrado aqui. Um número limitado de subtipos de interferon alfa foi expresso em resposta a LPS e poli ic. Em contraste, a expressão de interferão em resposta ao imiquimod foi elevada e a expressão do subtipo foi a expressão ampla de interferão beta e interferão.

Lambda um foi aprimorado por todos os três agonistas TLR Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar, executar e analyze. 3D quatro placas de ensaio para análise de alto rendimento de um grupo altamente semelhante de genes, como os subtipos de interferon tipo um e três.