Captura de Reparo de Tecidos em Zebrafish larvas com a Time-lapse Brightfield lupa estereoscópica

Este vídeo demonstra um método para capturar a dinâmica da reparação tecidual em um microscópio estereoscópico utilizando imagens com lapso de tempo. Isso é realizado primeiramente criando embriões de peixe-zebra até estágios larvais, quando a nadadeira caudal já se desenvolveu suficientemente até um tamanho que permite realizar amputações com facilidade. Isso é tipicamente alcançado após a eclosão.

O segundo passo é amputar a nadadeira caudal utilizando uma agulha de seringa. O terceiro passo é montar as larvas em uma câmara de imagem e capturar um filme com lapso de tempo em um microscópio estereoscópico. O passo final é quantificar a regeneração da nadadeira caudal utilizando um software de análise de imagens, como o Bit Plains S ou o software de código aberto ImageJ. Oi. Meu laboratório estuda reparação de feridas e regeneração tecidual utilizando o peixe-zebra como modelo.

Hoje demonstraremos um método que captura a dinâmica desses processos em tempo real utilizando microscopia estéreo de campo claro. Hoje demonstraremos um método que captura os processos iniciais da regeneração tecidual utilizando a nadadeira caudal de larvas de peixe-zebra. O método de imagem apresentado oferece a oportunidade de observar e analisar comportamentos em escala de tecido inteiro em um equipamento microscópico simples, facilmente adaptável a qualquer microscópio estéreo equipado com capacidade de lapso de tempo.

Então vamos começar. Criação de peixes-zebra até estágios larvais. A reparação de feridas na barbatana caudal pode ser melhor observada após os estágios de eclosão, pois a barbatana caudal já está suficientemente desenvolvida nesse momento, e amputações podem ser facilmente realizadas sem danificar a medula espinhal ou outros tecidos.

Em proximidade imediata, colete os ovos e incube-os durante a noite em uma incubadora a 28 graus Celsius. Na manhã seguinte, remova os embriões mortos e enxágue com meio embrionário contendo solução salina de aquário Instant Ocean a 0,03%. Se necessário, adicione ao recipiente meio embrionário com fenotiroxina a 0,003% para evitar a pigmentação das larvas.

Para esta demonstração, deixamos os embriões se desenvolverem até dois dias após a fertilização na incubadora, quando as larvas eclodem de seus kons, preparando a câmara de imagem. Nesta etapa, apresentamos dois métodos para a construção da câmara de imagem. O método um consiste em uma câmara de imagem feita de tubo de PVC ou teflon de grau para água potável, que pode ser obtido em qualquer loja de ferragens.

Utilize um tubo com diâmetro externo de 25 milímetros e diâmetro interno de 20 milímetros, pois esse tamanho é apropriado para a fixação de lamínulas. Corte o tubo para obter anéis com espessura de 10 milímetros, o mais uniformes possível. Use lixa para suavizar as bordas e enxágue com água e etanol.

Deixe a câmara secar ao ar. O método dois consiste em utilizar uma câmara de imagem com fundo de vidro fosco e tampa de vidro pré-fabricada ou em confeccionar uma câmara de imagem a partir de uma pequena placa de Petri. Para fabricar sua própria câmara de imagem, utilize uma placa de Petri de 35 ou 50 milímetros e faça um furo de 10 milímetros na tampa.

Em seguida, aplique graxa de silicone na parte externa da lamínula e fixe uma lamínula quadrada ou redonda de 25 por 25 milímetros na parte externa com a ponta limpa de uma pipeta para garantir que o agar de montagem permaneça firmemente aderido. Durante o procedimento de imageamento, fixe uma malha plástica fina na parte interna da lamínula. Isso pode ser feito cortando a malha no tamanho do diâmetro interno do anel e, em seguida, recortando um pequeno retângulo no centro da malha, com cerca de três vezes o tamanho das larvas.

Montagem e imagem dos larvas pré-lesão. Esta etapa é adequada para a quantificação posterior da regeneração da nadadeira. Primeiro, prepare uma solução de agarose de baixo ponto de fusão a 0,5% em meio embrionário para imobilização do espécime, transferindo a larva anestesiada para a solução de agarose que foi mantida a 42 graus Celsius.

Em um bloco de aquecimento, transfira as larvas com uma gota de agros para um pequeno recipiente de Petri e posicione as larvas de lado. Usando uma ponteira micro loader com tampa, deixe o agros solidificar e adicione a solução trica. Prossiga para o microscópio estereoscópico que será usado posteriormente.

Para a imagem de lapso de tempo, utilizamos um microscópio estereoscópico ZES Discovery V12 e o software Axio Vision para demonstração. Primeiro, ajuste as configurações do microscópio selecionando a objetiva e a ampliação apropriadas para a aquisição de imagens. Em seguida, selecione o modo de detecção da câmera no microscópio no software Alvis.

Selecione o modo ao vivo para visualizar a larva na tela. Abra a janela de propriedades para detectar automaticamente o brilho e ajuste manualmente o contraste na base de transiluminação do microscópio. Remova as larvas do campo de visão e selecione o recurso de correção de sombreamento.

Para minimizar o ruído de fundo, posicione novamente as larvas no campo de visão e capture uma imagem. Salve a imagem para se preparar para a lesão. Remova as larvas dos aros raspando primeiro os aros da cabeça.

Isso permite que as larvas consigam sair dos ágaros ao puxar suavemente a cabeça para longe do ágaro remanescente no ensaio de amputação. Prepare uma placa de ágar de 1,5% utilizando solução salina de ocean instantâneo. Sob um microscópio estereoscópico, posicione as larvas de lado sobre o ágar solidificado e ampute a parte distal da nadadeira caudal com uma agulha de seringa de calibre 23.

Montagem das larvas para aquisição de imagens em lapso de tempo. Apresentaremos dois métodos de aquisição de imagens em lapso de tempo. No primeiro método, mostraremos como obter imagens das larvas no anel de câmara após a montagem das larvas.

Remova cuidadosamente o agarose solidificado ao redor da nadadeira caudal distal com a ponteira de uma pipeta micro loader tampada. Isso permite uma cicatrização adequada da ferida ou regeneração do tecido. Sem restringir o tecido, evite lesar a nadadeira repetidamente. Durante este procedimento, remova os detritos indesejados que interfiram no processo de imagem da câmara substituindo a solução antiga.

Com solução fresca de Trica, aplique graxa de silicone na parte superior da câmara e preencha o anel da câmara com solução fresca de trica. Aplique uma lâmina de vidro na parte superior para selar a câmara — método dois. Neste método, mostraremos como obter imagens das larvas em uma placa de Petri com tampa de vidro.

Monte as larvas na tampa, cubra com lamínula e preencha a tampa. Com solução de trica. Remova os agros da nadadeira caudal.

Em seguida, aplique graxa de silicone na borda superior da câmara inferior e encha a câmara com solução de trica. Despeje cuidadosamente a solução de trica da tampa e vire a tampa para imergir a larva na solução de trica da câmara inferior, o que pode ser feito em um ângulo ligeiramente inclinado. Para evitar bolsas de ar, a câmara será selada com graxa de silicone para a aquisição de imagens com lapso de tempo, garantindo que uma temperatura adequada de 28 graus Celsius seja mantida.

Monte uma câmara de incubação aquecida feita de papelão com espuma plástica para isolamento térmico e uma cúpula com fiação elétrica, como as usadas para incubação de ovos de galinha, como fonte de calor. Posicione a câmara de incubação ao redor do microscópio e ajuste a temperatura para 28 graus Celsius. Por cerca de 10 a 20 minutos ou até que a temperatura se estabilize, mantenha a frente da câmara de incubação aquecida aberta e coloque a câmara de imageamento sobre o microscópio.

Posicione-se com a lamínula voltada para cima, em direção ao objetivo. Posicione a nadadeira larval de forma que dois terços do campo de visão permaneçam desocupados, garantindo a captura do crescimento e regeneração da nadadeira ao longo do procedimento de imageamento. Sem necessidade de reposicionar as larvas na janela de aquisição multidimensional de 60, selecione a opção de pilha Z e lapso de tempo na guia Zack e no modo de corte.

Selecione a espessura da fatia e, em seguida, escolha o modo de início e parada. Defina as posições superior e inferior da pilha na tabela de microcinematografia. Selecione o intervalo e a duração do vídeo e, então, pressione o botão de início para começar a gravação.

Durante a primeira hora, verifique as bordas dos larvas de and Zack. Se necessário, reposicione os larvas ao longo do tempo, pois eles podem ter se deslocado devido ao crescimento ou a diferenças na composição do agros. Salve o arquivo ao final da gravação em lapso de tempo e prossiga com a etapa de análise de dados de pós-processamento e quantificação.

Nesta seção, discutimos várias maneiras de analisar os dados gerados pelo método um imas. Primeiro, discutiremos como determinar o crescimento da nadadeira com o software imas. Abra o filme em lapso de tempo no software Amaris e salve os arquivos no formato de arquivo MRS.

Para melhorar o desempenho do Software, selecione a vista ortogonal para exibir o filme como uma projeção. Para medir o comprimento da nadadeira, selecione a opção adicionar novos pontos de medição na barra de ferramentas superior esquerda. Em configurar lista de valores estatísticos visíveis, selecione os valores estatísticos a serem exibidos no modo de linha.

Na guia configurações, selecione pares nas propriedades dos rótulos, escolha nome e distância para exibir a distância entre os pontos A e B ao lado da linha de medição, alterne para o modo de edição e mantenha pressionada a tecla shift para selecionar o primeiro ponto na nadadeira distal. Em seguida, use a mesma configuração para selecionar o segundo ponto na extremidade distal do não acorde. A distância será exibida na imagem e poderá ser exportada na guia estatísticas.

Ao selecionar o botão de disco exportar tudo na parte inferior direita. Alternativamente à opção de pontos de medição, o visualizador de cortes pode ser utilizado para medir distâncias no modo de exibição de corte. Role até a posição desejada e clique com o botão esquerdo do mouse na primeira e na segunda posição; a distância será exibida.

Essa opção, no entanto, não permite a exportação de dados. Agora discutiremos brevemente como determinar a área da nadadeira utilizando o software de código aberto ImageJ. Abra o filme de lapso de tempo no ImageJ usando um plugin que reconheça o formato de arquivo Zeiss Axio Vision.

Como alternativa, carregue uma sequência TIFF não compactada. Isso garantirá que as informações do arquivo sejam salvas; em analisar, selecione definir escala para definir a distância em pixels e a distância conhecida, caso não tenham sido preservadas no arquivo. Além disso, defina a unidade de comprimento em micrômetros.

No painel de ferramentas. Selecione a ferramenta de seleção à mão livre e contorne a ferida mantendo o botão esquerdo do mouse pressionado. Enquanto desenha ao longo das bordas da ferida.

Clique na opção medir em analisar para exibir a área dos resultados representativos da ferida. A amputação da barbatana leva a uma regeneração parcial ao longo de 36 horas após a amputação. As medidas de área da barbatana mostram que a amputação da barbatana provoca uma diminuição do tecido da barbatana até cerca de 14 horas após a amputação, presumivelmente devido à morte celular, seguida por um fino crescimento de regeneração.

A comparação entre a nadadeira amputada e a regenerada mostra um aumento de 2,48 vezes no comprimento da nadadeira em 36 horas. A amputação inicialmente desencadeia um efeito de cordão, caracterizado por contrações por meio de cabos de actina e miosina que estão presentes nas células da dobra da nadadeira, que se extrudem da ferida da amputação e são subsequentemente eliminadas. O comprimento do corpo aumenta inicialmente, mas a nadadeira não regenera.

Nas fases iniciais. Cerca de 14 horas após a amputação, a nadadeira começa a crescer de posições proximais para distais. Em resumo, nossos resultados demonstram que a amputação desencadeia a contração da ferida, o que pode ser essencial para promover a extrusão celular.

Uma vez que o processo é concluído, a nadadeira começa a se regenerar. O crescimento desenvolvimental da nadadeira parece ocorrer. Independentemente desse processo, apresentamos um método que permite a observação dos processos dinâmicos de reparo tecidual utilizando larvas vivas de peixe-zebra.

Este procedimento exige certos aspectos que testamos para otimizar o resultado. Uma vantagem clara do método de imagem apresentado é que ele é facilmente adaptável a qualquer microscópio estereoscópico equipado com uma câmera CCD e software TimeLapse. Ele também oferece uma alternativa de baixo custo ao sistema de imagem confocal, que é mais caro.

Embora este método não utilize fluorescência ou detecção celular, ele pode ser expandido para tais aplicações mediante o uso de um sistema automatizado para controle de fragmentação e software de desconvolução pós-imagem, permitindo observar ainda mais os processos de reparo e regeneração de feridas com resolução subcelular. Este método pode proporcionar aos estudantes uma compreensão mais profunda dos processos biológicos básicos subjacentes à reparação e regeneração tecidual. A transparência óptica e a facilidade com que zebrafish embrionários e larvais podem ser utilizados, juntamente com a adaptabilidade do sistema a qualquer microscópio estereoscópico, tornam-no adequado para o ensino de biologia básica de vertebrados em um ambiente de sala de aula.