Captura de Reparo de Tecidos em Zebrafish larvas com a Time-lapse Brightfield lupa estereoscópica

Este vídeo demonstra um método para capturar a dinâmica de reparo tecidual em um microscópio estéreo usando imagens de lapso de tempo. Isso é feito primeiro elevando os embriões de peixe-zebra aos estágios larvais quando a barbatana caudal se desenvolveu suficientemente para um tamanho em que as amputações possam ser facilmente realizadas. Isso normalmente é alcançado após a eclosão.

O segundo passo é amputar a barbatana caudal usando uma agulha de seringa. O terceiro passo é montar as larvas em uma câmara de imagem e capturar um filme de lapso de tempo em um microscópio estéreo. A etapa final é quantificar a regeneração da barbatana caudal utilizando software de análise de imagem, como o Bit Plains S ou o software de código aberto de J.Hi.My de imagem, estudos de laboratório, reparo de feridas e regeneração de tecidos, usando o peixe-zebra como modelo.

Hoje vamos demonstrar um método que captura a dinâmica desses processos em tempo real usando microscopia estéreo de campo claro. Hoje vamos demonstrar um método que captura os primeiros processos de regeneração de tecidos usando a barbatana caudal da larva do peixe-zebra. O método de imagem apresentado oferece uma oportunidade para observar e analisar comportamentos em escala de tecido inteiro em uma configuração de microscópio simples, que é facilmente adaptável a qualquer microscópio estéreo equipado com recursos de lapso de tempo.

Então vamos começar. Criação de peixe-zebra Para estágios larvais. O reparo da ferida na barbatana caudal pode ser melhor observado após os estágios de eclosão, pois a barbatana caudal já se desenvolveu suficientemente nessa época, e as amputações podem ser facilmente realizadas sem danificar a medula espinhal ou outros tecidos.

Nas proximidades, colete os ovos e incuba-os em uma incubadora de 28 graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, remova os embriões mortos e enxágue com meio embrionário contendo 0,03% de solução instantânea de sal de aquário oceânico. Se necessário, adicione meio embrionário com 0,003% de fenotireoide ao prato para evitar a pigmentação das larvas.

Para esta demonstração, deixamos os embriões se desenvolverem até dois dias após a fertilização na incubadora, quando as larvas eclodiram de sua preparação kons da câmara de imagem. Nesta etapa, fornecemos dois métodos para construir a câmara de imagem. O método um consiste em uma câmara de imagem feita de tubos de PVC ou Teflon de grau de água potável, que pode ser obtida em qualquer loja de ferragens.

Utilize tubos com diâmetro externo de 25 milímetros e diâmetro interno de 20 milímetros, pois isso tem o tamanho apropriado para fixação de lamínula. Corte o tubo para fazer anéis de 10 milímetros de espessura o mais uniforme possível. Use uma lixa para alisar as bordas e enxágue com água e etanol.

Deixe a câmara secar ao ar. O método dois consiste em utilizar um fundo de vidro de tecnologia fosca pré-fabricado, uma câmara de imagem superior de vidro ou fazer uma câmara de imagem a partir de uma pequena placa de Petri. Para fazer sua própria câmara de imagem, utilize uma placa de Petri de 35 ou 50 milímetros e faça um furo de 10 milímetros na tampa.

Em seguida, aplique graxa de silicone na parte externa da lamínula e prenda uma lamínula quadrada ou redonda de 25 por 25 milímetros na parte externa com uma ponta de pipeta limpa para garantir que os agros de montagem permaneçam firmemente presos. Durante o procedimento de imagem, prenda uma malha plástica fina no interior da lamínula. Isso pode ser feito cortando a malha no tamanho do diâmetro do anel interno e, em seguida, cortando um pequeno retângulo com cerca de três vezes o tamanho das larvas no meio da malha.

Montagem e imagem das larvas pré-lesão. Esta etapa é adequada para quantificação posterior da regeneração da barbatana. Primeiro, prepare uma solução agro de baixo derretimento a 0,5% em meio embrionário para imobilização da amostra transferindo a larva anestesiada para a solução aro que foi mantida a 42 graus Celsius.

Em um bloco de aquecimento, transfira as larvas com uma gota de agros para uma pequena placa de Petri e posicione as larvas de lado. Usando uma ponta de micro carregadeira tampada, deixe o aros solidificar e adicione a solução trica. Prossiga para o microscópio estéreo que será usado posteriormente.

Para imagens de lapso de tempo, usamos um microscópio estéreo zes discovery V 12 e o software de visão Axio para demonstração. Primeiro, ajuste as configurações do microscópio selecionando a objetiva e a ampliação apropriadas para a imagem. Em seguida, selecione o modo de detecção da câmera no microscópio no software alvis.

Selecione o modo ao vivo para visualizar a larva na tela. Abra a janela de propriedades para detectar automaticamente o brilho, ajuste manualmente o contraste na base de transiluminação do microscópio. Mova as larvas para fora do campo de visão e selecione o recurso de correção de sombreamento.

Para minimizar o ruído de fundo, posicione as larvas de volta no campo de visão e tire uma foto. Salve a imagem para se preparar para ferimentos. Remova as larvas do aros raspando primeiro os aeros da cabeça.

Isso permite que as larvas possam escorregar para fora dos aeros, puxando suavemente a cabeça para longe do ensaio de amputação dos aeros restantes. Prepare uma placa de 1,5% aeros usando solução instantânea de sal oceânico. Sob um microscópio estéreo, coloque as larvas lateralmente sobre o aros solidificado e ampute a parte distal da barbatana caudal com uma agulha de seringa de calibre 23.

Montando as larvas para imagens de lapso de tempo. Apresentaremos dois métodos de imagem com lapso de tempo. No primeiro método, mostraremos como obter imagens das larvas no anel da câmara após a montagem das larvas.

Raspe cuidadosamente os agros solidificados ao redor da barbatana caudal distal com uma ponta de pipeta micro carregadeira tampada. Isso permite a cicatrização adequada de feridas ou regeneração de tecidos Sem restringir o tecido, tente não ferir a barbatana repetidamente. Durante este procedimento, remova detritos indesejados que interferem no procedimento de imagem da câmara, substituindo a solução antiga.

Com a solução Trica fresca, aplique graxa de silicone na parte superior da câmara e encha o anel da câmara com solução trica fresca. Aplique uma lâmina de vidro na parte superior para selar o método da câmara dois. Neste método, mostraremos como criar imagens das larvas em uma placa de Petri com tampo de vidro.

Monte as larvas na tampa, cubra a lamínula e encha a tampa. Com solução trica. Raspe os agros da barbatana caudal.

Em seguida, aplique graxa de silicone na borda superior da câmara inferior e encha a câmara com solução trica. Transvase cuidadosamente a solução trica da tampa e vire a tampa para imergir a larva na solução trica da câmara inferior, o que pode ser feito em um pequeno ângulo. Para evitar bolsas de ar, a câmara será selada com a imagem de lapso de tempo de graxa de silicone para garantir que uma temperatura adequada de 28 graus Celsius seja mantida.

Monte uma câmara de incubação aquecida feita de plástico bolha de papelão para isolamento e uma cúpula com fio usada para incubação de ovos de galinha como fonte de calor. Coloque a câmara de incubação ao redor do microscópio e ajuste a temperatura para 28 graus Celsius. Por cerca de 10 a 20 minutos ou até que a temperatura se estabilize, abra a frente da câmara de incubação aquecida e coloque a câmara de imagem no microscópio.

Fique em pé com a lamínula voltada para cima em direção ao objetivo. Posicione a barbatana larval de forma que dois terços do campo de visão permaneçam desocupados para garantir a captura do crescimento e regeneração da barbatana ao longo do procedimento de imagem. Sem ter que reposicionar as larvas na janela de aquisição multidimensional 60 do software, selecione a pilha Z e a opção de lapso de tempo na guia Zack e no modo de fatia.

Selecione a espessura da fatia e, em seguida, selecione o modo de parada inicial. Defina as posições superior e inferior da pilha na tabela de lapso de tempo. Selecione o intervalo e a duração do filme e, em seguida, pressione o botão Iniciar para iniciar a gravação.

Na primeira hora, verifique os limites e Zack das larvas. Se necessário, reposicione as larvas ao longo do tempo, pois podem ter mudado devido ao crescimento ou diferenças na composição agros. Salve o arquivo no final da gravação de lapso de tempo e prossiga com a análise dos dados da etapa de pós-processamento e quantificação.

Nesta seção, discutimos várias maneiras de analisar os dados gerados pelo método um imas. Primeiro, discutiremos como determinar o crescimento das barbatanas com o software imas. Abra o filme time-lapse no software Amaris e guarde os ficheiros no formato de ficheiro MRS.

Para melhorar o desempenho do software, selecione a vista ortogonal para exibir o filme como uma projeção. Para medir o comprimento da aleta, selecione a opção adicionar novos pontos de medição na barra de ferramentas superior esquerda. Em configurar lista de valor de estatísticas visíveis, selecione os valores de estatísticas a serem exibidos no modo de linha.

Na guia de configurações, selecione pares nas propriedades dos rótulos, selecione o nome e a distância para exibir a distância entre os pontos A e B ao lado da linha de medição, alterne para o modo de edição e mantenha pressionado o botão shift para selecionar o primeiro ponto na aleta distal. Em seguida, use a mesma configuração para selecionar o segundo ponto na extremidade distal do não acordo. A distância será exibida na imagem e pode ser exportada na guia de estatísticas.

Ao selecionar o botão do disco, exportar tudo no canto inferior direito. Alternativamente à opção de pontos de medição, o visualizador de fatias pode ser utilizado para medir distâncias no modo de visualização de fatias. Role até a posição desejada e clique na primeira e segunda posições com o botão esquerdo do mouse, a distância será exibida.

Essa opção, no entanto, não permite a exportação de dados. Agora vamos discutir brevemente como determinar a área da barbatana usando o software de código aberto. Imagem J.Abra o filme TimeLapse na imagem J usando um plug-in que reconhece o formato de arquivo de visão Zeiss Axio.

Como alternativa, carregue em uma sequência TIFF não compactada. Isso garantirá que as informações do arquivo sejam salvas em analisar selecionar definir escala para definir a distância e os pixels e a distância conhecida, se não forem preservadas no arquivo. Além disso, defina o comprimento da unidade para micrômetros.

Na barra de ferramentas. Selecione a ferramenta de seleção de mão livre e contorne a ferida mantendo o botão esquerdo do mouse pressionado. Enquanto desenha ao longo das bordas da ferida.

Clique na opção de medida em analisar para exibir os resultados representativos da área da ferida. A amputação da barbatana leva a uma regeneração parcial ao longo de 36 horas após a amputação. As medições da área da barbatana mostram que a amputação da barbatana desencadeia uma diminuição no tecido da barbatana até cerca de 14 horas após a amputação, presumivelmente devido à morte celular, que é seguida por um comprimento de regeneração fino.

A comparação da barbatana amputada e regenerada mostra um aumento de 2,48 vezes no comprimento da barbatana em 36 horas. A amputação inicialmente desencadeia um efeito de corda em bolsa caracterizado por contrações por meio de cabos de actina e miosina que estão presentes nas células da dobra da barbatana, expulsam da ferida da amputação e são posteriormente eliminadas. O comprimento do corpo aumenta inicialmente, mas a barbatana não se regenera.

Durante as fases iniciais. Cerca de 14 horas após a amputação, a barbatana começa a crescer da posição proximal para a distal. Em resumo, nossos resultados demonstram que a amputação desencadeia a contração da ferida, o que pode ser essencial para promover a extrusão celular.

Uma vez concluído o processo, a barbatana começa a se regenerar. O crescimento da barbatana de desenvolvimento parece ocorrer. Independente desse processo, apresentamos um método que permite a observação dos processos dinâmicos de reparo tecidual usando larvas vivas de peixe-zebra.

Este procedimento requer certos aspectos que testamos para otimizar o resultado. Uma clara vantagem do método de imagem apresentado é que ele é facilmente adaptável a qualquer microscópio estéreo equipado com uma câmera CCD e software TimeLapse. Ele também oferece uma alternativa de baixo custo ao sistema de imagem confocal mais caro.

Embora esse método não use fluorescência ou detecção de células, ele pode ser expandido para tais aplicações utilizando um sistema automatizado para controle de quebra e software de deconvolução pós-imagem para observar ainda mais os processos de reparo e regeneração de feridas com resolução subcelular. Este método pode fornecer aos alunos uma melhor compreensão dos processos biológicos básicos, reparo e regeneração de tecidos subjacentes. A clareza óptica e a facilidade com que o peixe-zebra embrionário e larval podem ser usados e a adaptabilidade do sistema a qualquer microscópio estéreo o tornam adequado para o ensino de biologia básica de vértebras em sala de aula.