Name: Dois fótons de imagem de cálcio intracelular 2+ Manuseio e produção de óxido nítrico no endotélio e músculo liso células de uma aorta de rato isolada (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Aprenda a medir cálcio e óxido nítrico intracelulares em células endoteliais e musculares lisas de aorta isolada de rato usando microscopia de dois fótons. Este método permite visualizar respostas celulares a estímulos com alta resolução.

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Agradecemos ao Dr. William Cashdollar, ea Northwestern Mutual Foundation Imaging Center do Instituto de Pesquisa Wisconsin sangue para obter ajuda com os estudos de imagem. Agradecemos também o Dr. Daria Ilatovskaya para a leitura crítica deste manuscrito e discussão útil. Este estudo foi financiado pelo National Institutes of Health Grants HL108880 (como) e DP2-OD008396 (a AMG).

Os procedimentos experimentais descritos abaixo foram aprovados pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) da Faculdade de Medicina de Wisconsin e estavam de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. 1. Isolamento da aorta de rato <ol><li> Anestesiar ratos com isoflurano (5% de indução, de 1,5 a 2,5% de manutenção) ou outro método aprovado IACUC. </li><li> Coloque o rato em uma posição supina. A fim de expor os órgãos abdominais, fazer uma pequena incisão na linha média ventral, através da pele e do tecido abdominal subcutâneo. Usando compressas de gaze desviar ligeiramente os intestinos para expor a aorta e veia cava como se mostra na Figura 1. </li><li> Resumidamente, sem corte dissecar a aorta a partir do tecido conjuntivo e da veia cava. Usando fio de sutura, amarrar a aorta tão próximo quanto possível para o rim. Dissecar cerca de 1 - 2 cm de aorta e colocá-lo em um cônico de 15 ml tuser fisiológico normal contendo solução salina (PSS; em mM: 140 de NaCl, 1,2 MgCl2, 2 CaCl2, 4,5 de KCl, 6 de glucose, 10 de HEPES) em gelo. </li><li> Uma vez que a aorta é isolado, sacrificar o animal de acordo com os protocolos aprovados IACUC. Após a conclusão de todos os não-sobrevivência procedimentos sacrificar animais profundamente anestesiados por toracotomia induzir pneumotórax para assegurar o desaparecimento humano do animal. 3 </li><li> Usando um microscópio de dissecação, uma pinça de ponta fina, e microtesoura dissecar a gordura e tecido conjuntivo fora da aorta. Uma vez que a aorta é limpo, cortado longitudinalmente da aorta e colocá-lo em PSS em gelo durante mais tarde. </li></ol> 2. Dye carregar e Incubação <ol><li> Pipetar 7 ul de 1 mM de Fluo-04:00 corante, que é fornecido em solução à base de DMSO, em 500 ul tubos individuais que foram cobertos com folha de alumínio. Armazenar no congelador a -20 ° C para preservar as propriedades de corante ao longo do tempo. Nota: estes aliquotados assimluções deve ser estável durante pelo menos seis meses. </li><li> Antes do uso, permitir que as soluções de tintura-se aquecer até à temperatura ambiente antes da abertura. Preparar as soluções de trabalho imediatamente antes da utilização. Não guarde o reagente diluído para uso posterior. </li><li> Adicionar 7 ul de 1 mM de Fluo-04:00 corante pronta dissolvido em solução de DMSO a 450 ul de PSS contendo nenhum cálcio. Adicionar 40 ul de solução de DMSO não com base 10% de ácido Pluronic ao cocktail de carregamento para ajudar a dispersar os grupos acetoximetilo (AM) e ésteres de melhorar o carregamento do corante de cálcio. </li><li> Coloque as aortas dissecados para os tubos 500 ul contendo o cocktail de carregamento (como descrito em 2.3), durante 1 h. Cobrir todos os tubos com papel alumínio e coloque em um agitador rotativo a RT. </li><li> Para monitorizar a produção de NO na vasculatura, usar corante diacetato DAF-FM. Incubar a aorta em uma solução contendo 450 uL PSS, 40 ul de ácido plurónico e 5 ul de 10 mM de FAD FM-diacetato. Semelhante ao protocolo de incubação de cálcio (descrito em 2.3), colocar a aortanum tubo de 500 ul contendo a solução sem corante coberta na folha e lugar num agitador rotativo durante 30 minutos a 4 C seguindo-se próximo de 30 min à TA. </li><li> Quando a produção de NO é medido, utilizar a NO-sintase endotelial bloqueador, L-NAME, para bloquear a produção de NO como um controlo, como mostrado na Figura 4B. Para esse procedimento, adicione a cocktail (como descrito em 2.5) 100 nM L-NAME para os últimos 30 minutos de incubação (em RT). </li></ol> 3. Laser Scanning Dois Protocolo photon Microscopia <ol><li> Após a 1 h de incubação, lava-se a aorta de 2 - 3 vezes em PSS limpo para remover o corante extracelular. </li><li> Transferir a aorta para uma placa revestida com silicone contendo ou PSS normal ou tampão livre de Ca 2+ (depende do protocolo experimental). Pin da aorta para baixo para o revestimento de silicone com a adventícia em contacto com o silicone (ou seja, lúmen endoteliais expostas à abertura prato) utilizando pinos em forma de μ. Como alternativa, use uma fatia Anchorgrade ou cola para fixar o tecido. Nota: Para reduzir o estresse e possíveis artefatos mecânicos, transferência e corrigir aorta em Ca 2 + livre solução e esperar 5 - 10 min antes do início do experimento. </li><li> Conectar uma bomba peristáltica ou uma seringa para a placa revestida com silicone para aplicação automática ou manual de drogas ou para modificar a solução extracelular. </li><li> Coloque o prato sob a parte do nariz dos retos microscópio de dois fótons, e instalar e posicione a 25 × (NA 1,05 e trabalhando distância 2 mm) de imersão em água lente objetiva acima do espécime. Nota: Se esta lente específica não está disponível, use um objectivo fabricados especificamente para dois fótons de imagem, porque pode aumentar a resolução do sinal dramaticamente em comparação com um objectivo regular. </li><li> Ative o laser de dois fótons usando o software (o laser começa a bomba e ligue). Sintonizar o laser de excitação a 820 nm. </li><li> Usando epifluorescência, localize a aorta e focar o objetivo ema superfície endotelial usando ajuste primário. </li><li> Alterne o microscópio de varredura a laser em modo de dois fótons, garantindo que o laser de excitação é modo bloqueado, os detectores não descanned estão envolvidos e os filtros de emissão adequadas para os espectros de emissão esperada estão instalados. Nota: Aqui, foram utilizados o FV10-MRL / R (495-540 nM). </li><li> Iniciar a digitalização vivo utilizando aproximadamente 5% da potência do laser e finamente concentrar o objectivo, a fim de visualizar as células endoteliais. Nota: As células endoteliais exibirão um sinal fluorescente forte quando incubadas em PSS normal. Este será visivelmente mais fraco quando os vasos são incubadas em tampão isento de cálcio. As células endoteliais estará presente na parte superior da aorta aberta e as células do músculo liso pode ser visto abaixo das células endoteliais (ver Figura 2). Porque os vasos sanguíneos não são nem lisa nem mesmo, haverá locais onde ambas as células de músculo liso e células endoteliais estão presentes. &lt;/ Li&gt; <li> Uma vez que as células estão em foco, o programa de software microscópio para coletar imagens sequenciais no modo de varredura rápida (varredura raster, 512 x 512 pixels de janela com uma frequência coleção de quadros de 1,1 s). Em paralelo com Fluo-04:00 fluorescência, recolher transmitido imagens de luz, a fim de detectar alterações na contração dos vasos e visualizar melhor as condições experimentais. </li><li> Após a coleta de imagens de sinal de linha de base, altere a concentração de íons de Ca2 + na solução externa ou lentamente aplicar agentes farmacológicos de estímulo usando a bomba peristáltica, enquanto imagem. Observar o aumento de sinal fluorescente dentro das células carregadas. Nota: As células endoteliais responder às mudanças no fluxo, portanto, recomenda-se usar aplicações de baixa laminares e ensaio do veículo antes da aplicação de activadores farmacológicos de Ca 2+ ou NO sinalização. Para recalcular cálcio intracelular para valores de concentração nm de embarcações carregadas com Fluo-4 (constante de dissociação para Fluo-4 is 345 nM), a intensidade de fluorescência pode ser gravada no início e após adição de ionomicina e MnCl2 4. </li></ol> 4. Processamento de Imagem e Cálculos <ol><li> Baixe e instale Fiji pacote de processamento de imagem. </li><li> Abra o arquivo de imagem em Fiji. Após importar o arquivo, dividir os canais (luz transmitida e de sinal fluorescente) quando solicitado. Utilize apenas o sinal fluorescente para a análise de dados. </li><li> Dentro do programa de Fiji, clique na guia analisar e desça até a opção ferramentas. Sob a opção de ferramentas, encontrar a aba que diz o gerente de ROI e clique sobre ele; uma nova janela aparecerá. </li><li> Após isso, clique em medições definido na guia analisar. Selecione as medições específicas de interesse. Para as medidas transitórias de cálcio, use a opção valor médio cinza. </li><li> Com a ferramenta de rastreio circular, começam a traçar as regiões de interesse (ROI) e clique em &quot;adicionar&quot; na tela do gerenciador de ROI para cada ROI. Uma vez que todas as células de interesse foram rastreados, na janela do gerenciador de ROI, selecione multi Medida sob o &quot;mais&quot; guia. Lembre-se de salvar os medições diretamente ou copiar e colar todas essas medidas em uma planilha. </li><li> Abrir arquivo * .txt ou planilha do Excel de Fiji e transferir os números para uma nova planilha de Origem. Nota: Como alternativa, use um programa como o Sigma Plot ou Prism para análise posterior. </li><li> Dentro do programa de Origem, use Plot → menu de Linha + Símbolo de observar uma visão geral de todas as respostas transientes. Desmarque as células não respondem. </li><li> Recalcular o número de rastreamento para escala de tempo (eixo X), use Coluna → Definir valores de coluna e multiplicar a coluna de número de rastreamento para a freqüência de coleta de imagem (no nosso caso 1.1s). </li><li> Use Analysis → Estatísticas sobre linhas para todas as gravações selecionadas para calcular Média (eixo Y) e rastreamento de erro padrão. Traçar a curva final para grupo atual de células Traçar → Linha + Symbol. </li><li> O mean cálcio transiente cálculo é descrito como se segue. <ol><li> Para total liberação de cálcio dentro do programa de Origem, clique no gráfico, em seguida, usar o menu Análise → Cálculo → Integrar. Integrante total de área sob a curva aparece no registro de resultado. </li><li> Para cinética transitórios, clique no gráfico, em seguida, use o menu: Curva Análise → não-linear Fit → Selecionar Conjunto de Dados (escolher eixo X variam de máximo até o final da resposta transitória). Comece Fitting → Select → Função Exponencial Decay 1 → Concluído. Nota: encaixe exponencial aparece na janela Graph e Resultado Log. Os dados obtidos (valores) representam quantidade total de cálcio liberado, e cinética dos canais mediada a resposta transitória. </li></ol></li></ol>

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<li>Flister, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXM+-+a+new+tool+for+mapping+breast+cancer+risk+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CXM - a new tool for mapping breast cancer risk in the tumor microenvironment.</a> Cancer Res. 74, 6419-6429 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Visão geral Experimental. Para melhor compreender a contribuição de cálcio e NÃO a fisiologia vascular, um novo método foi desenvolvido para medir [Ca2 +] i e NÃO dentro do músculo liso e células endoteliais de aortas intactas isoladas. Juntos, este protocolo é composto por estes passos críticos: 1) o isolamento mecânico e preparação (digestão enzimática não) da embarcação. É importante manter o tecido saudável e intacta, tanto quanto possível obter gravações fisiológicas óptimas. 2) A inc...

O cálcio é um segundo mensageiro fundamental dentro da células vasculares tais como células endoteliais e do músculo liso. É o estímulo primário para a contracção vascular e desempenha um papel importante na dilatação vascular, incluindo os seus efeitos através de nenhuma geração dentro do endotélio. Devido às limitações da tecnologia de imagem, tem sido praticamente impossível observar manuseamento de cálcio no interior do vaso intacto. O desenvolvimento de dois sistemas de imagem de fótons e da criação de novos cálcio ou sem corantes de rotulagem, torna possível a imagem a uma profundidade e resolução suficiente para começar a entender a dinâmica de cálcio e produção de NO na vasculatura. Dois microscopia de fotões foi recentemente aplicada em tecidos, órgãos e estudos em animais inteiros, mesmo devido à sua superior capacidade para penetrar profundamente tecidos com baixa fluorescência de fundo e a sensibilidade do sinal de alta 1,2. O espectro estreito de dois fotões de excitação no Illuminatião ponto focal e a utilização de detectores não-descanned são as razões pelas quais microscopia dois fotões é superior a microscopia confocal tradicional. A microscopia confocal não pode produzir imagens de alta qualidade a uma profundidade de tecido necessária devido à auto-fluorescência e dispersão de luz fora de foco no pinhole confocal. Por conseguinte, temos desenvolvido um método usando um microscópio de dois fotões para medir a [Ca2 +] i de sinalização e a produção de NO em células dos vasos sanguíneos individuais intactas com alta resolução e baixa relação de sinal-para-ruído.

<table><tbody><tr><td>DAF-FM</td><td>Life Technologies</td><td>D-23842</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F14217</td><td>500 &micro; l em solução DMSO</td></tr><tr><td>Pluronic F-68</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5556</td><td></td></tr><tr><td>L-NAME</td><td>Tocris</td><td>0665</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio vertical</td><td>Olympus</td><td>Olympus Fluoview FV1000</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai HP DeepSee-OL&nbsp;</td><td>Spectra Physics</td><td></td><td>Ti:laser de safira 690nm &mdash; 1040nm</td></tr><tr><td>Filtros</td><td>Olympus</td><td>FV10-MRL/R&nbsp;</td><td>495 a 540 nm&nbsp;</td></tr><tr><td>Lente objetiva de imersão em água 25&vezes</td><td>Olympus</td><td>XLPL25XWMP</td><td>N.A. 1.05 e distância de trabalho 2 mm</td></tr><tr><td>Grade de ancoragem Slice</td><td>Warner Instrument&nbsp;</td><td>SHD-27LH</td><td></td></tr><tr><td>Outros reagentes básicos&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dois fótons de imagem de cálcio intracelular<sup&gt; 2+</sup&gt; manuseio e produção de óxido nítrico no endotélio e músculo liso células de uma aorta de rato isolada

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

O cálcio é um regulador muito importante de diversos processos fisiológicos em tecidos vasculares. A maioria das funções endoteliais e do músculo liso dependem muito alterações de cálcio intracelular ([Ca 2+] i) e óxido nítrico (NO). A fim de entender como [Ca2 +] i, NO e moléculas jusante são manipulados por um vaso sanguíneo em resposta a vasoconstritores e vasodilatadores, desenvolvemos uma nova técnica que se aplica a rotulagem de cálcio (ou NO-rotulagem) tinge com microscopia de dois fótons para medir a manipulação de cálcio (ou nenhuma produção) nos vasos sanguíneos isolados. Aqui descrito é um procedimento passo-a-passo que demonstra como isolar uma aorta de um rato, etiqueta de cálcio ou NO nas células endoteliais ou de músculo liso, e imagem transientes de cálcio (ou a produção de NO), usando um microscópio de dois fotões seguinte fisiológico ou estímulos farmacológicos. As vantagens da utilização do método são multi-dobra: 1) é possível simultânealy medir transientes de cálcio em ambas as células endoteliais e células musculares lisas em resposta a diferentes estímulos; 2) que permite que uma imagem de células endoteliais e células do músculo liso na sua configuração nativa; 3) este método é muito sensível ao cálcio intracelular ou nenhumas mudanças e gera imagens de alta resolução para medições precisas; e 4) abordagem descrita pode ser aplicada para a medição de outras moléculas, tais como espécies de oxigénio reactivas. Em resumo, a aplicação de microscopia de emissão de laser de dois fotões para monitorar transientes de cálcio e a produção de NO nas células endoteliais e do músculo liso de um vaso sanguíneo isolado forneceu dados quantitativos de alta qualidade e promoveu a nossa compreensão dos mecanismos que regulam a função vascular.

A fim de avaliar com precisão a contribuição de cálcio a fisiologia vascular (vasodilatação e vasoconstrição), um protocolo foi concebido para carregar corantes de cálcio em ambas as células endoteliais e células do músculo liso na aorta isolada intacta. A experimental geral definido em cima representada na Figura 1, mostra a estratégia básica para o isolamento e preparação do vaso antes de imagem. Resumidamente, após o isolamento da aorta do rato, ele deve ser limpo de gordura e tecido conjuntivo e cor...

A função das células vasculares depende da atividade dos mensageiros intracelulares. Descrito aqui é um método de imagem ex vivo de dois fótons que permite a medição dos níveis intracelulares de cálcio e óxido nítrico em resposta a estímulos fisiológicos e farmacológicos em células endoteliais e musculares lisas individuais de uma aorta isolada.

Dois fótons de imagem de cálcio intracelular<sup&gt; 2+</sup&gt; Manuseio e produção de óxido nítrico no endotélio e músculo liso células de uma aorta de rato isolada

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

O objetivo geral deste procedimento é medir o cálcio ou o óxido nítrico em um vaso recém-isolado utilizando microscopia de dois fótons. Isso é realizado primeiramente por meio do isolamento mecânico e preparação do vaso. Em seguida, o vaso é incubado no corante de marcação de cálcio ou em um corante de marcação de O com ácido ônico.Em seguida, o vaso é fixado a uma placa revestida com silicone contendo uma grade e pinos para fornecer uma visão estável durante a imagem de dois fótons. Por fim, realiza-se a aquisição de imagens de dois fótons e os resultados são quantificados. Este vídeo mostra a elevação da sinalização de cálcio intracelular em células endoteliais de vasos sanguíneos isolados em resposta a alterações na concentração extracelular de cálcio.Em última análise, este método permitirá que pesquisadores monitorem alterações de cálcio ou óxido nítrico em células endoteliais ou células musculares lisas de um vaso sanguíneo recém-isolado. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que ela pode proporcionar melhor resolução de sinal e medições precisas dos processos intracelulares em tecidos vasculares. Aqui, esta tecnologia foi aplicada em combinação com dados clássicos, não geométricos, para medir o transiente de cálcio e a produção de óxido nítrico em células individuais de uma orca oca isolada.Acreditamos que esta técnica ajudará a avançar nosso conhecimento sobre o mecanismo regulador dos níveis intracelulares de cálcio e espécies reativas de oxigênio nos diferentes tipos de células vasculares. A microscopia de excitação por dois fótons em células vivas, especialmente em tecidos intactos como vasos sanguíneos, oferece as vantagens de sinal com alta resolução e baixa fluorescência de fundo fora do foco. A localização restrita da excitação por dois fótons ilumina um único volume focal no tecido, reduz grandemente a absorção fora do foco e diminui a dispersão da luz, permitindo-nos imagens da dinâmica de fluoro quatro em tecidos altamente autofluorescentes que contêm fibras de colágeno e elastina.Após isolar uma aorta de rato, de acordo com o protocolo descrito no texto, sob um microscópio estereoscópico, utilize pinças de ponta fina e tesouras microcirúrgicas para dissecar a gordura e o tecido conjuntivo da aorta. Uma vez limpa, corte o órgão longitudinalmente e transfira-o para solução salina fisiológica para uso posterior. Para preparar o coquetel de marcação, adicione sete microlitros de uma solução pronta de corante flu oh 4:00 AM a um milimolar em DMSO a 450 microlitros de PSS contendo sem cálcio.Em seguida, adicione 40 microlitros de uma solução de ácido 10% não baseada em DMSO ao coquetel de carregamento para ajudar a dispersar os acetil metil ésteres e melhorar o carregamento do corante de cálcio. Coloque as aortas dissecadas em tubos de 500 microlitros contendo o coquetel de carregamento. Cubra os tubos com papel alumínio e coloque-os em um agitador rotativo à temperatura ambiente por uma hora.Após seguir o protocolo descrito para fixar o tecido aórtico à superfície de uma placa revestida com silicone, posicione a placa sob a objetiva de um microscópio de dois fótons ereto e instale e posicione uma objetiva de imersão em água de 25 x acima do espécime. Instale um filtro de emissão correspondente na porta do microscópio. Utilizando o software, ative o laser infravermelho de dois fótons e ajuste a excitação do laser para 820 nanômetros sob luz transmitida. Usando o ajuste grosseiro da objetiva, localize a aorta e foque a objetiva na superfície endotelial.Altere o microscópio para o modo de varredura a laser de dois fótons, garantindo que o laser de excitação esteja com o modo bloqueado. Os detectores não varridos por DS são ativados com cerca de cinco a 10% da potência do laser. Inicie a varredura em tempo real.E, finalmente, ajuste o objetivo para colocar as células endoteliais ou musculares lisas em foco. Colete imagens sequenciais de acordo com o protocolo experimental descrito no texto. Salve as imagens em um formato que inclua os metadados para realizar o processamento de imagem e o cálculo; baixe e instale o pacote de processamento de imagens Fiji, que é distribuído sob a licença pública geral.Usando o software, abra um arquivo de imagem. Em seguida, quando solicitado, separe os canais de luz transmitida e fluorescente para utilizar apenas os canais fluorescentes na análise de dados dentro do programa Fiji. Clique na guia analisar e role até a opção ferramentas.Em seguida, clique na guia do gerenciador de ROI e uma nova janela aparecerá. Depois, na guia analisar, clique em definir medições e selecione as medições específicas de interesse. Para as medições do transiente de cálcio.Utilize a opção de valor médio de cinza. Em seguida, com a ferramenta de rastreamento circular, comece a delimitar as regiões de interesse e, no gerenciador de ROI, clique em "adicionar" para cada ROI selecionada. Após rastrear todas as células de interesse, no menu "mais" do gerenciador de ROI, selecione a opção "medir várias".Por fim, salve as medições diretamente ou copie e cole-as em uma planilha e realize os cálculos conforme o protocolo descrito no texto. Utilizando o protocolo descrito neste vídeo, as células endoteliais da aorta são fáceis de localizar devido à sua forma e ao sinal fluorescente intenso. As células musculares lisas também serão visíveis no mesmo campo junto com as células endoteliais, o que permitirá uma melhor compreensão de como os dois tipos celulares respondem conjuntamente, mas de forma independente, a diferentes agonistas e estímulos, demonstrando a utilidade deste método.Medições da resposta à acetilcolina ou a um vasodilatador potente dependente de cálcio do endotélio, como o CHA, foram determinadas conforme mostrado aqui após a adição de CH, com aumento da fluorescência em células endoteliais comparado às células em PSS isolado, indicando um aumento rápido no teor intracelular de cálcio que lentamente retorna ao valor basal. Este protocolo também é adequado para a detecção da produção de óxido nítrico endotelial. Neste experimento, células endoteliais aórticas foram carregadas com DAF FM D acetato.A produção de ENO corante aumentou de maneira dependente de cálcio em resposta a uma estimulação de CH, e essa resposta foi bloqueada com o inibidor da óxido nítrico sintase endotelial de nome L. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da fisiologia cardiovascular. O uso do procedimento experimental descrito aqui, juntamente com múltiplos modelos animais geneticamente modificados disponíveis, oferece novas perspectivas para a aplicação de microscopia de duas fotonas em pesquisa básica e translacional.O uso dessa abordagem pode proporcionar uma compreensão aprofundada e uma percepção mecanicista das vias de sinalização intracelular específicas nas células dos vasos sanguíneos. Após assistir a este vídeo, você aprenderá como aplicar esta técnica para o monitoramento em tempo real dos níveis de cálcio e óxido nítrico nas células individuais de vasos sanguíneos recém-isolados.

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Biology

Biologia

Focal Ca 2 + Detecção de transitórios no músculo liso

Aqui um romance região do protocolo de análise de juros com base na classificação elipses melhor ajuste atribuídos a regiões de sinal positivo dentro de sequências de imagens de lapso de tempo bidimensional é demonstrada. Este algoritmo pode permitir que os investigadores a analisar exaustivamente sinais fisiológicos Ca + 2 com entrada mínima do usuário e preconceito.

Automated Análise de Ca dinâmico<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sinais em seqüências de imagens

Neste artigo descrevemos um método relativamente fácil adaptados usando o corante de fluorescência diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) e dihydroethidium (DHE) para en face detecção simultânea e visualização de óxido nítrico intracelular (NO) e ânion superóxido (O 2 .- ), respectivamente, em aortas isoladas de fresco intactas de um modelo de rato de obesidade.

Face Detection En de óxido nítrico e superóxido na camada endotelial das artérias intactas

Atualmente, a maioria dos indicadores de cálcio disponíveis são usados para quantificar transientes citoplasmáticos de cálcio como medidas indiretas de cálcio liberado do retículo sarcoplasmático em células musculares lisas cultivadas. Este protocolo descreve o uso de um indicador específico baseado em FRET que permite a medição direta de sinais de cálcio dentro do lúmen do retículo sarcoplasmático.

Medição das flutuações cálcio dentro do Sarcoplasmic retículo de células musculares lisas cultivadas utilizando FRET baseado em imagem confocal

As células endoteliais primárias da veia umbilical humana (HUVECs) foram cultivadas até a confluência dentro de um dispositivo de rede microfluídica. A junção celular endotelial e as distribuições de F-actina foram ilustradas e as mudanças na concentração de cálcio intracelular e na produção de óxido nítrico em resposta ao trifosfato de adenosina (ATP) foram quantificadas em tempo real em níveis celulares individuais.

Desenvolvimento e Caracterização de<em&gt; In Vitro</em&gt; Rede de microvasos e medições quantitativas de endotelial [ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; E óxido nítrico Produção

A calcificação vascular é um importante preditor e contribuinte para doenças cardiovasculares humanas. Este protocolo descreve métodos para induzir calcificação de células musculares lisas vasculares primárias cultivadas e para quantificar a calcificação e a carga de macrófagos em aortas de animais usando imagens de fluorescência no infravermelho próximo.

Calcificação das células do músculo vascular liso e de imagem da aorta calcificação e inflamação

Este manuscrito descreve em vitro protocolos de vídeo microscopia para avaliar a função vascular nas artérias de resistência cerebral de rato. O manuscrito também descreve técnicas para avaliar a densidade de microvessel com perfusão de lectina e tecido fluorescente etiquetada usando Laser Doppler Flowmetry.

Avaliação dos mecanismos de controlo Vascular utilizando a microscopia das artérias de resistência isolada de ratos

Este manuscrito descreve um protocolo simples para o isolamento de arteríolas da retina rato que podem ser usados em, cálcio imaging e pressão miografia Estudos eletrofisiológicos.

Isolamento de arteríolas retina para estudos de fisiologia celular Ex Vivo

Demonstrado aqui são protocolos para isolar (1) recém endoteliais cerebrais intactos "tubos" e medições (2) simultâneas de cálcio endotelial e potencial durante o endotélio-derivado hiperpolarização de membrana. Além disso, esses métodos permitem a otimização farmacológica de cálcio da célula endotelial e sinalização eléctrica como variáveis experimentais individuais ou interativas.

Medições simultâneas de cálcio intracelular e potencial de membrana no endotélio Cerebral rato recém isoladas e intacta

Apresentado aqui é um protocolo para estudar a microcirculação coronária no tecido cardíaco murino vivo por ex vivo monitoramento da pressão e fluxo de perfusão arterial que mantém a pressão, bem como componentes de árvores vasculares, incluindo os leitos capilares e pericitos, já que a artéria septal é canulada e pressurizada.

Medição dinâmica e imagem de capilares, arterioles e pericias em coração de rato

Aprenda a medir cálcio e óxido nítrico intracelulares em células endoteliais e musculares lisas de aorta isolada de rato usando microscopia de dois fótons. Este método permite visualizar respostas celulares a estímulos com alta resolução.

Dois fótons de imagem de cálcio intracelular 2+ Manuseio e produção de óxido nítrico no endotélio e músculo liso células de uma aorta de rato isolada (Vídeo) | JoVE Journal

Dois fótons de imagem de cálcio intracelular

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