Dois fótons de imagem de cálcio intracelular

O objetivo geral deste procedimento é medir o cálcio ou o óxido nítrico em um vaso recém-isolado utilizando microscopia de dois fótons. Isso é realizado primeiramente por meio do isolamento mecânico e preparação do vaso. Em seguida, o vaso é incubado no corante de marcação de cálcio ou em um corante de marcação de O com ácido ônico.

Em seguida, o vaso é fixado a uma placa revestida com silicone contendo uma grade e pinos para fornecer uma visão estável durante a imagem de dois fótons. Por fim, realiza-se a aquisição de imagens de dois fótons e os resultados são quantificados. Este vídeo mostra a elevação da sinalização de cálcio intracelular em células endoteliais de vasos sanguíneos isolados em resposta a alterações na concentração extracelular de cálcio.

Em última análise, este método permitirá que pesquisadores monitorem alterações de cálcio ou óxido nítrico em células endoteliais ou células musculares lisas de um vaso sanguíneo recém-isolado. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que ela pode proporcionar melhor resolução de sinal e medições precisas dos processos intracelulares em tecidos vasculares. Aqui, esta tecnologia foi aplicada em combinação com dados clássicos, não geométricos, para medir o transiente de cálcio e a produção de óxido nítrico em células individuais de uma orca oca isolada.

Acreditamos que esta técnica ajudará a avançar nosso conhecimento sobre o mecanismo regulador dos níveis intracelulares de cálcio e espécies reativas de oxigênio nos diferentes tipos de células vasculares. A microscopia de excitação por dois fótons em células vivas, especialmente em tecidos intactos como vasos sanguíneos, oferece as vantagens de sinal com alta resolução e baixa fluorescência de fundo fora do foco. A localização restrita da excitação por dois fótons ilumina um único volume focal no tecido, reduz grandemente a absorção fora do foco e diminui a dispersão da luz, permitindo-nos imagens da dinâmica de fluoro quatro em tecidos altamente autofluorescentes que contêm fibras de colágeno e elastina.

Após isolar uma aorta de rato, de acordo com o protocolo descrito no texto, sob um microscópio estereoscópico, utilize pinças de ponta fina e tesouras microcirúrgicas para dissecar a gordura e o tecido conjuntivo da aorta. Uma vez limpa, corte o órgão longitudinalmente e transfira-o para solução salina fisiológica para uso posterior. Para preparar o coquetel de marcação, adicione sete microlitros de uma solução pronta de corante flu oh 4:00 AM a um milimolar em DMSO a 450 microlitros de PSS contendo sem cálcio.

Em seguida, adicione 40 microlitros de uma solução de ácido 10% não baseada em DMSO ao coquetel de carregamento para ajudar a dispersar os acetil metil ésteres e melhorar o carregamento do corante de cálcio. Coloque as aortas dissecadas em tubos de 500 microlitros contendo o coquetel de carregamento. Cubra os tubos com papel alumínio e coloque-os em um agitador rotativo à temperatura ambiente por uma hora.

Após seguir o protocolo descrito para fixar o tecido aórtico à superfície de uma placa revestida com silicone, posicione a placa sob a objetiva de um microscópio de dois fótons ereto e instale e posicione uma objetiva de imersão em água de 25 x acima do espécime. Instale um filtro de emissão correspondente na porta do microscópio. Utilizando o software, ative o laser infravermelho de dois fótons e ajuste a excitação do laser para 820 nanômetros sob luz transmitida. Usando o ajuste grosseiro da objetiva, localize a aorta e foque a objetiva na superfície endotelial.

Altere o microscópio para o modo de varredura a laser de dois fótons, garantindo que o laser de excitação esteja com o modo bloqueado. Os detectores não varridos por DS são ativados com cerca de cinco a 10% da potência do laser. Inicie a varredura em tempo real.

E, finalmente, ajuste o objetivo para colocar as células endoteliais ou musculares lisas em foco. Colete imagens sequenciais de acordo com o protocolo experimental descrito no texto. Salve as imagens em um formato que inclua os metadados para realizar o processamento de imagem e o cálculo; baixe e instale o pacote de processamento de imagens Fiji, que é distribuído sob a licença pública geral.

Usando o software, abra um arquivo de imagem. Em seguida, quando solicitado, separe os canais de luz transmitida e fluorescente para utilizar apenas os canais fluorescentes na análise de dados dentro do programa Fiji. Clique na guia analisar e role até a opção ferramentas.

Em seguida, clique na guia do gerenciador de ROI e uma nova janela aparecerá. Depois, na guia analisar, clique em definir medições e selecione as medições específicas de interesse. Para as medições do transiente de cálcio.

Utilize a opção de valor médio de cinza. Em seguida, com a ferramenta de rastreamento circular, comece a delimitar as regiões de interesse e, no gerenciador de ROI, clique em "adicionar" para cada ROI selecionada. Após rastrear todas as células de interesse, no menu "mais" do gerenciador de ROI, selecione a opção "medir várias".

Por fim, salve as medições diretamente ou copie e cole-as em uma planilha e realize os cálculos conforme o protocolo descrito no texto. Utilizando o protocolo descrito neste vídeo, as células endoteliais da aorta são fáceis de localizar devido à sua forma e ao sinal fluorescente intenso. As células musculares lisas também serão visíveis no mesmo campo junto com as células endoteliais, o que permitirá uma melhor compreensão de como os dois tipos celulares respondem conjuntamente, mas de forma independente, a diferentes agonistas e estímulos, demonstrando a utilidade deste método.

Medições da resposta à acetilcolina ou a um vasodilatador potente dependente de cálcio do endotélio, como o CHA, foram determinadas conforme mostrado aqui após a adição de CH, com aumento da fluorescência em células endoteliais comparado às células em PSS isolado, indicando um aumento rápido no teor intracelular de cálcio que lentamente retorna ao valor basal. Este protocolo também é adequado para a detecção da produção de óxido nítrico endotelial. Neste experimento, células endoteliais aórticas foram carregadas com DAF FM D acetato.

A produção de ENO corante aumentou de maneira dependente de cálcio em resposta a uma estimulação de CH, e essa resposta foi bloqueada com o inibidor da óxido nítrico sintase endotelial de nome L. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da fisiologia cardiovascular. O uso do procedimento experimental descrito aqui, juntamente com múltiplos modelos animais geneticamente modificados disponíveis, oferece novas perspectivas para a aplicação de microscopia de duas fotonas em pesquisa básica e translacional.

O uso dessa abordagem pode proporcionar uma compreensão aprofundada e uma percepção mecanicista das vias de sinalização intracelular específicas nas células dos vasos sanguíneos. Após assistir a este vídeo, você aprenderá como aplicar esta técnica para o monitoramento em tempo real dos níveis de cálcio e óxido nítrico nas células individuais de vasos sanguíneos recém-isolados.