Estudar o cancro do pâncreas Stem características celulares para desenvolver estratégias Novo tratamento

O objetivo geral do procedimento a seguir é expandir as células-tronco cancerígenas in vitro usando uma técnica de cultura independente de Anchorage e, em seguida, testar os efeitos metabólicos de novas terapias direcionadas a células-tronco cancerígenas. Isso é feito primeiro dissociando uma amostra de tecido de adenocarcinoma pancreático humano em uma única suspensão celular. Na segunda etapa, o tecido tumoral é posteriormente digerido com enzimas e, em seguida, semeado em uma placa de gelatina Para remover a população de células de fibroblastos, as células cancerígenas isoladas são então semeadas em uma placa de vários poços de fixação ultrabaixa e tratadas com a droga de interesse para avaliar a atividade metabólica e a formação das esferas tumorais.

Em última análise, a droga de interesse pode ser usada em camundongos imunocomprometidos portadores de xenoenxertos derivados de pacientes para validar os efeitos da droga in vivo. Este método é uma ferramenta poderosa para estudar a biologia das células-tronco cancerígenas e serve como um primeiro passo para o desenvolvimento de novas terapias direcionadas às células-tronco cancerígenas. Demonstrando o procedimento estarei eu, um investigador júnior do Centro de Células-Tronco em Câncer e Envelhecimento do Instituto do Câncer de Mama e Tini Cruz, uma estudante de doutorado do meu laboratório Para isolar células-tronco cancerígenas de um adenocarcinoma ductal pancreático em um gabinete de biossegurança estéril.

Use um bisturi estéril e uma pinça para picar o tumor humano em uma placa de cultura de 60 por 15 milímetros contendo um mililitro de PBS estéril, adicionando outros três a quatro mililitros de PBS conforme necessário até que o tecido esteja completamente dissociado. Transfira a suspensão de tecido para um tubo cônico estéril e adicione PBS a um volume final de cinco mililitros. Em seguida, homogeneizar mecanicamente a amostra com uma centrífuga de dissociação e digerir o tecido homogeneizado com colagenase a 37 graus Celsius.

Após uma hora de centrifugação, as células se recuperam, suspendendo o pellet em 10 mililitros de meio completo. Filtre a suspensão celular através de um filtro de 40 micrômetros e gire as células novamente. Desta vez, ressus, suspendendo o pellet em cinco mililitros de um CK Após cinco minutos em temperatura ambiente, remova o tampão de lise de glóbulos vermelhos por centrifugação e ressuspenda o pellet em meio de células-tronco cancerígenas.

Em seguida, incube as células em um prato revestido de gelatina a 37 graus Celsius para remover a maioria das células de fibroblastos que se fixam rapidamente. Após uma hora, recupere o sobrenadante e quantifique o número de células cancerígenas pancreáticas viáveis para facilitar a formação da esfera tumoral para o câncer. O enriquecimento de células-tronco dilui as células no volume apropriado de meio de células-tronco cancerígenas até uma concentração final de duas vezes 10 elevado a três células por mililitro e as resfria no gelo por alguns minutos.

Em seguida, depois de adicionar 500 microlitros de PBS à primeira e à última fileiras de uma placa de célula de fixação ultrabaixa de 24, suspenda novamente as células por pipeta e semeie um mililitro de células por poço nos poços vazios da placa. Trate quatro poços de células com a droga de interesse e pelo menos quatro poços de controle negativo com veículo. Em seguida, incube as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por uma semana.

A cada dois dias, adicione um novo tratamento ao nosso veículo para cada um dos poços. No quinto ou sétimo dia, avalie o número de esferas tumorais formadas com um contador de células automatizado que permite a identificação de estruturas maiores para empacotamento serial das esferas tumorais. No sétimo dia, use um filtro de células de 40 micrômetros para colher as esferas.

Em seguida, gire as esferas e incuba-as em um mililitro de tripsina por 20 minutos a 37 graus Celsius para dissociar o pellet em uma única suspensão celular. Em seguida, expanda as células por mais sete dias, conforme demonstrado, para preparar as esferas para medição de suas espécies reativas de oxigênio ou produção de ROS após a dissociação, conforme demonstrado, gire as esferas e ressuspenda o pellet em HBSS contendo a sonda apropriada. Após uma incubação de 20 minutos no escuro a 37 graus Celsius, colocar as células no gelo até à análise por citometria de fluxo para preparar as esferas para a medição do seu consumo de oxigénio.

Primeiro cubra uma placa de cultura de células de 96 poços com adesivo para células e tecidos por pelo menos 20 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, dissocie as esferas e a tripsina conforme demonstrado. Em seguida, lave a placa duas a três vezes com água para remover o excesso de placa adesiva, as células singulares em três vezes 10 elevado à quinta células por poço.

Em 150 microlitros de consumo de oxigênio, o meio de ensaio contendo glicose e piruvato de sódio adere as células ao fundo dos poços por centrifugação até atingir 100 vezes G. Deixar a centrífuga parar com a interrupção. Em seguida, inverta a orientação da placa e repita a centrifugação.

Agora incube as células por 30 minutos a 37 graus Celsius sem dióxido de carbono. Enquanto isso, carregue as importações do cartucho de ensaio. A, B e C. Injetar 25 microlitros de uma concentração de três, seis e nove milimolares da droga de interesse, respectivamente, e importar D a 25 microlitros de uma concentração micromolar do inibidor mitocondrial rone.

Quando as células estiverem prontas, calibre o cartucho e carregue a placa de cultura de células. Finalmente, execute o ensaio com o protocolo padrão de mistura e medição Nesses experimentos representativos, o tratamento de células-tronco do câncer de pâncreas com metformina diminuiu fortemente o tamanho e o número das esferas tumorais. Além disso, essas reduções foram exibidas por culturas de esferas secundárias e terciárias.

Mesmo quando apenas a cultura da esfera primária foi tratada com metformina, a metformina atua como um inibidor mitocondrial. De fato, neste experimento, observou-se que a droga induz uma diminuição rápida e dependente da dose no consumo de oxigênio nas células tumorais que se correlaciona com sua capacidade de induzir a produção de ROS. É importante ressaltar que os camundongos tratados com metformina exibem uma redução de curto prazo, mas significativa, na progressão do adenocarcinoma pancreático em comparação com os animais controle.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como dissociar tumores humanos recentes. Isole as células cancerígenas primárias, configuradas como cultura de formação de esferas, e avalie a atividade metabólica das células-tronco do câncer de pâncreas.