Encapsulation termogênico pré-adipócitos para transplante em adiposo Depots Tissue

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a encapsulação de uma linhagem celular catabólica termogênica e suas aplicações in vitro e potencialmente in vivo. Para iniciar este procedimento, prepare uma suspensão celular de alginato de sódio e transfira-a para uma seringa de cinco mililitros. O próximo passo é utilizar um dispositivo de encapsulação para produzir microesferas de alginato.

As microesferas são então revestidas com uma solução de poli-L-lisina poli-iônica, e o núcleo de alginato é posteriormente removido para formar uma membrana semipermeável ao redor de uma suspensão celular. O passo final consiste em co-cultivar as células encapsuladas com outras linhagens celulares ou injetá-las nos tecidos adiposos de camundongos. Em última análise, a análise imunológica do sangue mostra maior atividade lipolítica em adipócitos co-cultivados com microcápsulas contendo adipócitos deficientes em aldeído desidrogenase.

Embora a imuno-histoquímica mostre o transplante bem-sucedido de células encapsuladas nos tecidos adiposos de camundongos, este método pode fornecer informações sobre a termogênese e o tecido apus. Também pode ser aplicado a outros modelos animais existentes para fornecer um sistema experimental de baixo custo para testar subconjuntos celulares in vivo. Para descobertas biomédicas, todos os procedimentos devem ser realizados em uma cabine de segurança biológica de nível dois com fluxo laminar.

Para começar, remova o meio antigo do frasco de cultura celular e lave os pré-adipócitos com 10 mililitros de PBS. Remova o PBS e ressuspenda as células em dois mililitros de tripsina 0,25% EDTA. Retire uma alíquota de 10 microlitros da suspensão celular e conte as células utilizando um hemocitômetro.

De acordo com as instruções do fabricante, adicione DMEM às células remanescentes para obter a quantidade ideal de células e centrifugue a 480 × g, em temperatura ambiente, durante cinco minutos. Após determinar a quantidade de células necessária seguindo as orientações no texto do protocolo, suspendemos o pellet celular em um volume apropriado de uma solução a 2% de alginato de sódio. Transfira a solução de células em alginato de sódio para uma seringa de cinco mililitros.

Remova todas as bolhas de ar na solução e inverta a seringa para criar um bolsão de ar de um mililitro. Para se preparar para a encapsulação, coloque um béquer pequeno contendo 144 mililitros de uma solução de cloreto de cálcio 100 milimolar. Sob o bico da agulha do dispositivo de encapsulação, fixe o eletrodo ao encapsulado com a ponta aproximadamente 2,5 centímetros acima da superfície da solução de cloreto de cálcio.

Coloque a seringa contendo a solução celular de alginato de sódio firmemente na bomba de seringa. Fixe o tubo de borracha na abertura da seringa. Empurre o êmbolo até que a solução celular de alginato de sódio preencha metade do tubo.

Ajuste a voltagem para 5,4 quilovolts e defina o diâmetro como 12,06 milímetros na bomba de seringa. Ajuste a velocidade para três mililitros por hora. Inicie a bomba, ligue o encapsulador e mantenha a voltagem em 5,4 quilovolts.

Feche a janela da cabine e evite qualquer vibração desnecessária até que a formação das microesferas de alginato esteja completa. Após toda a solução ter passado pela agulha, deixe as microesferas esféricas de alginato solidificarem na solução de cloreto de cálcio por mais 20 minutos antes do revestimento com polilisina policatiônica ou PLL. Uma vez que as microesferas esféricas de alginato de sódio tenham solidificado, remova o béquer contendo as microesferas do dispositivo de encapsulação.

Transfira as microesferas para um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Remova a solução de cloreto de cálcio do pellet de microesferas. Lave as microesferas adicionando 30 mililitros de uma solução de cloreto de sódio a 0,9% e agitando suavemente o tubo manualmente.

Deixe as microesferas sedimentarem por gravidade. Em seguida, utilize uma pipeta de 25 mililitros para remover a solução de cloreto de sódio dessa maneira. Lave as microesferas um total de três vezes.

Em seguida, adicione a solução de PLL 0,05% às microesferas. Utilize 10 mililitros de solução de PLL para cada um mililitro de solução de alginato de sódio. Vortexe a 1000 rotações por minuto durante 10 minutos, o que geralmente é suficiente para o revestimento com PLL.

Após confirmar a formação do revestimento de PLL, remova a solução de PLL e lave as cápsulas três vezes com uma solução de cloreto de sódio a 0,9%, conforme mostrado anteriormente, para remover primeiro o núcleo alternativo das microesferas revestidas com PLL. Adicione 30 mililitros de uma solução de citrato de sódio 50 milimolar ao tubo de 50 mililitros. Aguarde cinco minutos ou até que todo o alginato de sódio esteja dissolvido. Lave as cápsulas três vezes com solução de cloreto de sódio a 0,9% conforme demonstrado previamente.

Após a terceira lavagem com 20 mililitros de meio de cultura transferidos para o tubo, transfira todas as cápsulas contendo as células para um frasco de cultura celular e manipule as células encapsuladas em condições padrão de cultura celular. As células hospedeiras para este procedimento devem ser cultivadas em placas de 24 poços até atingirem confluência. Utilize o meio de crescimento para fibroblastos preparado conforme descrito no protocolo complementar.

Texto para o cultivo de pré-adipócitos. Transfira as microcápsulas para a placa de 24 poços contendo células hospedeiras confluentes, adicione microcápsulas para obter uma monocamada em cada poço e induza a diferenciação de pré-adipócitos com o meio de diferenciação. Incube por 48 horas.

Após 48 horas, troque o meio para diferenciação.Médio. Dois, substitua o meio por diferenciação.Médio.Fresco. Dois. A cada 48 horas, as proteínas das células serão analisadas por western blot.

Cada etapa da produção de microesferas pode ser observada ao microscópio. Uma microesfera de alginato é mostrada com ampliação de 20 x. Antes do revestimento com PLL, após a codificação com PLL e após a dissolução do núcleo de ginnet, em um estudo quantitativo, a expressão da lipase de triglicerídeos do tecido adiposo ou A TGL foi comparada entre três adipócitos T três L um co-cultivados com microcápsulas contendo adipócitos acelulares do tipo selvagem ou deficientes em aldeído desidrogenase um A um.

A maior expressão de A TGL em adipócitos co-cultivados com um L DH um A um deficiente em microcápsulas contendo dipócitos indica maior atividade lipolítica. Em um estudo in vivo, células encapsuladas marcadas com GFP foram injetadas no depósito de gordura intra-abdominal de camundongos. Oitenta dias depois, o tecido adiposo injetado apresentou aglomerados descoloridos de células encapsuladas.

Uma seção incluída em parafina do depósito de gordura intra-abdominal corada com hematoxilina, eosina e eosina mostra aglomerados de microcápsulas implantadas contendo células encapsuladas e adipócitos do hospedeiro. A mesma seção analisada sob luz fluorescente revela células transplantadas marcadas com GFP no interior de cápsulas redondas intactas. A expressão de GFP também é um indicador da viabilidade celular após seu desenvolvimento.

Essa técnica de encapsulação abriu caminho para pesquisadores na área de doenças metabólicas explorarem possíveis tratamentos para obesidade, resistência à insulina na diabetes tipo dois, inflamação, câncer e organismos modelo.