Name: Implementando Grampo patch e ao vivo microscopia de fluorescência para monitorar propriedades funcionais de recentemente isolados PKD Epithelium (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Aprenda a técnica de grampo patch e microscopia de fluorescência para estudar canais iônicos e concentração de cálcio em epitélio cístico renal isolado de roedores. Este método permite analisar a função celular em doença renal policística.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores gostariam de agradecer Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) e Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc) para assistência técnica excelente, com experimentos de microscopia. Este estudo foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde concede R01 HL108880 (a AS), R01 DK095029 (para OPO) e K99 HL116603 (TSP), National Kidney Foundation IG1724 (TSP), American Heart Association 13GRNT16220002 (para OPO) e o Ben J. Lipps Research Fellowship da Sociedade Americana de Nefrologia (para DVI).

Os procedimentos experimentais descritos abaixo foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional no Medical College of Wisconsin e University of Health Science Center Texas em Houston e estavam de acordo com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. A Figura 1 demonstra os passos principais do processo de isolamento e processamento do tecido. Resumidamente, os rins de ratos SD ou PCK são utilizados para o isolamento manual das monocamadas epiteliais de recolha de condutas, quer a partir de túbulos ou cistos não-marcado saudáveis. Aqui nós estudados rins de 4-16 semanas de idade ratos PCK 10,13. 1. Isolamento de renais Cistos e Palhinha Conexão (CNT) / ductos coletores (CD) Segmentos <ol><li> Anestesiar animal experimental com isoflurano (5% de indução, de 1,5 a 2,5% de manutenção) / Medical Grade O 2 ou outro método aprovado. Os animais devem ser continuamente monitorado para garantir le adequadavel da anestesia. Reação taxa e toe pitada respiratório estável são utilizados para confirmar a anestesia adequada. </li><li> Execute laparotomia e liberar os rins com tampão fosfato salino (PBS) através da aorta abdominal 17. <ol><li> Prepare um cateter tubo de polietileno (PE50) e conectá-lo a uma bomba de seringa preenchida com PBS. Corte a pele e parede abdominal ao longo da linha alba, em seguida, fazer uma incisão abdominal transversa através do abdômen de lado a lado e deslocar os órgãos abdominais com cotonetes para obter o acesso à aorta descendente com ramificações mesentéricas e celíacas artérias. Umedeça os órgãos internos com solução salina quente durante procedimentos adicionais para impedir a sua secura. </li><li> Coloque uma ligadura (# 1) em torno das artérias mesentéricas e celíacas e outra ligadura (# 2) em torno da aorta sob o diafragma (não amarrar). Delicadamente separar a. abdominalis por Blunt dissecar os tecidos conectivos em torno dela com uma pinça fina e colocar duas ligaduras ~ 3mm abaixo da artéria renal esquerda (# 3) e acima da bifurcação artérias ilíacas (# 4). </li><li> Amarre ligadura # 4 e anexar uma braçadeira navio ao redor da aorta, entre a artéria renal esquerda e ligadura # 3. Faça uma incisão entre o grampo e ligadura # 4 a cateterização da aorta, use ligadura # 3 para fixar firmemente o cateter. </li><li> Solte a braçadeira e certifique-se que o pulso de sangue é visível no cateter para garantir a instalação adequada. Comece a perfusão a um caudal de 6 ml / min, o laço ligaduras # 1 e # 2, e cortar a veia renal esquerda. Continue lavando por 1-2 min até que os órgãos estão completamente empalideceu. </li><li> Corte vasos sanguíneos renais, uretra e que cercam tecidos conjuntivos e adiposas com uma tesoura para recolher os rins. Em seguida, faça uma pequena lágrima em cápsula renal e descasque os rins a decapsulate-los. Colocar os rins em PBS gelado. Eutanásia é confirmada através de uma toracotomia. </li></ol></li><li> Prepare 5 x 5 mm chips de vidro de cobertura revestidas com poli-L-lisina. Corte uma tampa glass com um lápis e diamante lugar aproximadamente 20 ul de solução esterilizada por filtração de poli-L-lisina em cada chip de vidro de 0,01%. Prepare salina e duas pinças de relojoeiro para dissecção. </li><li> Cortar os rins com uma lâmina de barbear ao longo do plano frontal em fatias de ~ 1-2 mm de espessura. Coloque uma das fatias sob um microscópio estereoscópico. Isolamento de tecidos deve ser feito em solução salina gelada. </li><li> Localize cistos sob microscópio estereoscópico como cavidades em forma redonda (Figura 2A); suas paredes contêm frequentemente proeminente rede de vasos sanguíneos proliferaram. Utilizando uma pinça de ponta fina dissecar a camada epitelial interno de um quisto tão fino quanto possível para obter uma área de monocamada. Una-o a um chip de vidro cobertos com poli-L-lisina. Pegajosa superfície Poli-L-Lisina permite ao pesquisador posicionar firmemente a camada interna cisto no vidro. Exponha o cisto com o lado apical para fornecer acesso para as pipetas (Figura 2B). </li><li> Use PCK ou SD rato criançafatias centrais ney contendo papila para o isolamento de não dilatados CNT / CCDsegments 18-21. NOTA: tecidos papilares são mais duráveis ​​do córtex e segurando faixas tubulares papilar, com uma pinça e rasgando ao longo eixo radial a fatia pode ser clivada em setores finas. Túbulos individuais são visíveis e podem ser puxado para fora para ser colocado em chips de vidro capa. </li><li> Identificar os segmentos CNT / CCD por bifurcações, maior transparência do que túbulos proximais e células proeminentemente visíveis grandes (Figura 2C). Coloque o chip de vidro com tampa túbulos anexados sob um microscópio equipado com micromanipuladores adequadas para micropipetas condução. Usando micropipetas afiadas túbulos split-abertos e anexar suas bordas ao vidro para tornar a superfície apical acessível (Figura 2D). </li></ol> Eletrofisiologia 2. Single Canal patch-clamp <ol><li> Encha a câmara de patch-clamp com solução de banho e transfira o chip tampa de vidrocom tecidos isolados para a câmara. Certifique-se de que as micropipetas de patch-clamp têm resistência de 10/07 mohms para medições confiáveis ​​sobre células-anexado (celulares). </li><li> Para as medições ligado de células, definir a relação de ganho do amplificador de 20x e de baixo passar as correntes em 300 Hz por um filtro de oito pólos Bessel. Para a monitorização canais ENaC, usar uma solução de banho, em mM: NaCl 150, CaCl2 1, MgCl2 2, 10 HEPES (pH 7,4); pipeta: 140 LiCl, 2 de MgCl2 e 10 HEPES (pH 7,4). </li><li> Realizar um experimento patch-clamp convencional em um modo ligado à célula 10. Seleccionar uma célula na monocamada epitelial e aproximar a pipeta para a membrana apical. Formar uma vedação de alta resistência entre uma pipeta e membrana celular através da aplicação de sucção suave. Uma vez que um selo gigaohm resistente de alta é formado, um protocolo livre de gap em um potencial de realização deve ser iniciado para a atividade de monitoramento do canal de interesse. </li><li> Loja gap-livres únicos dados atuais do canal de gigaSelos Ohm para análise posterior. Analisar os eventos de canal utilizando um pacote de software geralmente fornecidos com configurações de patch-clamp 18. Calcular a actividade de canal como npo em que N se refere ao número de canais activos na amostra e P é o probabilidade média aberta dos canais. NOTA: Use cistos isolados ou túbulos em experimentos de patch-clamp para não mais de 30 min. </li></ol> 3. Raciometrico epifluorescência Medidas de intracelular concentração de cálcio nas células epiteliais <ol><li> Use 5 mM Fura-02:00 dissolvido em DMSO. Solução estoque alíquota em 500 mL tubos cônicos individuais (cerca de 10 mL). Proteger da luz e armazenar no congelador a -20 ° C por até seis meses. </li><li> Incubar cistos isolados e túbulos dividir-aberto para 30-40 min no PSS (em mM: NaCl 145, KCl 4,5, 2 MgCl2, CaCl2 2 e 10 HEPES a pH 7,35) contendo 5 mM Fura-02:00 corante e 0.05% de ácido plurónico para ajudar a dispersar os ésteres de acetoximetilo. Para que, no lugar dos tecidos 3,5 cm de placa de carregamento cocktail contendo, proteger da luz e incubar num agitador lento à temperatura ambiente. </li><li> Mudar Fura-2 AM contendo meios para limpar PSS após incubação e colocar o tecido sob um microscópio para executar mais imagiologia de epifluorescência. </li><li> Ligue câmara CCD e fonte de luz estável (sistema de monocromador) equipado com roda de filtro (cada posição do filtro pode ser associado com o seu próprio nível de atenuação, seleccionado cada vez que o filtro é chamado). </li><li> Encontre o tecido no campo brilhante. Mudar para detecção do sinal de fluorescência e ajustar a intensidade da fonte de luz usando filtros de densidade neutra e potência da lâmpada para evitar a saturação do sinal. </li><li> Monitorar Fura-2 AM de fluorescência na amostra de tecido com excitação a 340/380 nm raciométrica com uma frequência de 0,125 Hz ou superior. Use um / NA 1.3 ou similar lente objetiva de 40 × para resolu adequadação imagem. </li><li> Para o processamento e cálculos imagem importar a seqüência de imagens. Certifique-se de dividir os canais e usar um modo hyperstack em tons de cinza. Seleccione várias regiões de interesse (células únicas quisto ou áreas seleccionadas de tecido cístico) e o cálculo dos valores de intensidade para cada um dos canais (340 e 380 nm) para o software de análise de dados preferido; valores de intensidade fundo subtrair de cada ponto de dados. </li><li> Para cada ponto de tempo de calcular a relação entre as intensidades de Fura-2 AM 340 a 380 canais. Gráfico de dispersão / linha mudanças em tempo ponto de Ca 2+ transitória para cada região e calcular valores médios / SE. </li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Descrevemos aqui aplicações da técnica de patch-clamp convencional e imagiologia de epifluorescência cálcio para monocamadas epiteliais císticas derivados de um modelo murino de ARPKD genética. O protocolo consiste em três etapas, das quais a maior atenção deve ser dada ao isolamento dos cistos (passo 1.5 da seção de protocolos) e aos estudos eletrofisiológicos. Estes procedimentos fundamentais requerem treinamento extenso e paciência, eo leitor não deve ser frustrado ao mesmo tempo. Primeir...

Canais de iões desempenhar um papel importante em muitas funções fisiológicas, incluindo crescimento e diferenciação celular. Doenças policística dominante autossómica recessiva e nos rins (ADPKD e ARPKD, respectivamente) são doenças genéticas caracterizadas pelo desenvolvimento de quistos renais cheios de fluido da origem nas células epiteliais tubulares. ADPKD é causada por mutações de genes PKD1 ou PKD2 codificam polycystins 1 e 2, proteínas de membrana envolvidas na regulação da proliferação e diferenciação celular. PKD2, por si só ou como um complexo com PKD1, também funcionar como um catião de Ca2 + -permeable canal 1. As mutações do gene que codifica PKHD1 fibrocystin (uma proteína do tipo receptor-associado cílios envolvidos na tubulogenesis e / ou manutenção da polaridade do epitélio) são o impulso genética da ARPKD 2. Crescimento do cisto é um fenômeno complexo, acompanhado de proliferação perturbado 3,4, angiogênese 5, desdiferenciação e perda de polardade de células tubulares 6-8. Reabsorção defeituoso e secreção aumentada no epitélio cístico contribuir para o acúmulo de líquido no lúmen e cisto expansão 9,10. Fluxo-dependente prejudicada [Ca2 +] i sinalização também tem sido associada a cistogénese durante PKD 11-15. Aqui, nós descrevemos um método adequado para medições de patch-clamp da actividade do canal único e níveis intracelulares de Ca 2+ em monocamadas epiteliais císticas isolados de ratos PCK. Este método foi aplicado com sucesso por nós para caracterizar de actividade do canal de Na + epitelial (ENaC) e 10 [Ca 2+] i induzidas por processos dependentes de Ca 2+ e TRPV4 -permeable purinérgico cascata de sinalização 13. Nestes estudos utilizou-se ratos PCK, um modelo de ARPKD causada por uma mutação espontânea no gene PKHD1. A cepa PCK foi originally derivada a partir de ratos 16 ratos SD, assim, são utilizados como um controlo apropriado para comparação com a estirpe PCK Sprague-Dawley (SD). Como resultado, ambos os segmentos dos néfrons de ratos SD e dutos não dilatado coleta isolados de ratos mesmas PCK pode servir como dois grupos de comparação diferentes para fazer experimentos sobre epitélio cística.

<table><tbody><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-14185</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8</td><td>AAT Bioquest</td><td>21091</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Ácido plurônico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-68&nbsp;</td><td>solução</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Boekel Scientific</td><td>260350</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de luz</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>Lambda XL</td><td>com obturador/filtro integrado</td></tr><tr><td>Filtros de densidade neutra</td><td>Nikon</td><td></td><td>ND4, ND8</td></tr><tr><td>Objective</td><td>Nikon</td><td>SFluo&nbsp;</td><td>40/1.3 DIC WD 0.22&nbsp; &nbsp; óleo</td></tr><tr><td>Câmera</td><td>Andor Technologies</td><td>Zyla sCMOS</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Nikon&nbsp; (invertido)</td><td>Nikon</td><td>Nikon Eclipse TE2000-S</td><td></td></tr><tr><td>Tampa de Vidro</td><td>Thermo Scientific</td><td>6661B52</td><td></td></tr><tr><td>Lápis de diamante</td><td>Fisher Scientific</td><td>22268912</td><td></td></tr><tr><td>Software de aquisição de imagem</td><td>Nikon</td><td>Nikon NIS-Elements&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Software de análise de imagem</td><td>O</td> plugin <td>ImageJ http://imagej.nih.gov/</td> <td>ND Utility permite importar imagens no formato nativo da Nikon Instruments .nd2</td></tr><tr><td>Câmara de gravação/perfusão</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Patch Clamp amplificador</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Sistema</td> <td>de Aquisição de DadosDispositivos Moleculares</td><td>Digidata 1440A</td><td>Axônio Digidata&reg; Sistema</td></tr><tr><td>de filtro passa-baixo</td><td>Warner Instruments</td><td>LPF-8</td><td>8 pólos Bessel</td></tr><tr><td>Borosilicato capilares de vidro Extrator</td><td></td> de micropipeta <td>Sutter</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Instrument Co</td><td>P-97</td><td>Extrator de micropipeta tipo flamejante / marrom</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>Japão</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td> <td>motorizadoSutter Instrument Co</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>Mesa de isolamento de microvibração</td><td>TMC</td><td></td><td>equipada com gaiola de Faraday</td></tr><tr><td>Sistema de perfusão de válvula multicanal</td><td>AutoMake Scientific</td><td>Valve Bank II</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de gravação/perfusão</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>Software</td>Mesa cirúrgica controlada por temperatura <td>pClamp 10 . 2</td><td></td>da <td>Molecular Devices</td></tr><tr><td></td><td>Núcleo</td><td></td> MCW <td>para roedores</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio binocular</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de perfusão baseado em bomba de seringa</td> Tubo de polietileno <td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Anestesia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>isofluorana</td><td><a href="http://www.vetequip.com/">http://www.vetequip.com/</a</td><td>>911103</td><td></td></tr><tr><td>Outros reagentes básicos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

implementando grampo patch e ao vivo microscopia de fluorescência para monitorar propriedades funcionais de recentemente isolados pkd epithelium

Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

Iniciação cisto e expansão durante a doença renal policística é um processo complexo, caracterizado por anormalidades na proliferação celular tubular, acúmulo de líquido luminal e formação de matriz extracelular. Atividade de canais iônicos e sinalização intracelular de cálcio são parâmetros fisiológicos fundamentais que determinam funções do epitélio tubular. Foi desenvolvido um método adequado para observação em tempo real da actividade de canais de iões com a técnica de patch-clamp e registo de Ca2 + intracelular em monocamadas epiteliais nível isolados de fresco a partir de quistos renais. PCK ratos, um modelo genético de doença renal policística autossômica recessiva (DRPAR), foram usados ​​aqui para ex vivo análise de canais iônicos e fluxo de cálcio. Aqui descrito é um procedimento detalhado passo-a-passo projetado para isolar monocamadas cística e túbulos não dilatado de PCK ou ratos normais Sprague Dawley (SD), e monitorar a atividade de canal único e de Ca 2+ intracelular dinâmica.Este método não exige processamento enzimático e permite a análise de uma configuração nativa isolada de fresco de monocamada epitelial. Além disso, esta técnica é muito sensível a alterações de cálcio intracelular e gera imagens de alta resolução para medições precisas. Finalmente, isolado epitélio cística pode ser ainda utilizado para a coloração com anticorpos ou corantes, preparação de culturas primárias e purificação por vários ensaios bioquímicos.

Potencial envolvimento ENaC em cistogénese tem sido demonstrada em vários estudos que observadas factor de crescimento epidérmico interrompido (FEG) de sinalização na progressão de PKD 22-25 e a reabsorção de sódio anormal na ARPKD modelos murinos e de culturas de tecidos 26-28. Por exemplo, Veizis et al. Mostraram que a absorção sensíveis ao amiloride Na + é diminuída em células CD a partir do modelo não-ortólogas rato BPK de ARPKD 29. Nós demonstramos recentemente q...

Canais de iões expressas em epitélio tubular renal, desempenha um papel significativo na patologia da doença poliquística do rim. Aqui nós descrevemos protocolos experimentais utilizados para a realização de análises e medições de nível de cálcio intracelular de patch-clamp no epitélio cístico recentemente isoladas de rins de roedores.

Implementando Grampo patch e ao vivo microscopia de fluorescência para monitorar propriedades funcionais de recentemente isolados PKD Epithelium

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

O objetivo geral deste procedimento é registrar a atividade de canais individuais e medir as alterações na concentração intracelular de cálcio em monocamadas císticas isoladas recentemente de modelos roedores da doença renal policística. Isso é realizado primeiramente lavando os rins PCK rec por meio da aorta abdominal, a fim de remover o sangue dos tecidos renais. O segundo passo consiste em isolar a monocamada epitelial dos cistos.Em seguida, o monolayer isolado pode ser usado para gravações convencionais de clamp de patch de canais iônicos nas membranas apicais de células epiteliais. O tecido isolado também pode ser usado para carregamento com corantes de cálcio. Para quantificar as alterações na concentração intracelular de cálcio nas células epiteliais.Esses parâmetros medidos no ambiente nativo dos cistos podem ser comparados aos túbulos saudáveis para estudar o processo de agênese cística. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite estudar a atividade dos canais chi e o fluxo de cálcio nos cistos renais. Essa análise fornece dados fisiologicamente irrelevantes obtidos a partir de tecidos recém-isolados.Com esta abordagem, podemos monitorar a atividade de canais individuais em epitélios recém-isolados. É um método exclusivo porque pode ser usado para caracterizar com precisão o comportamento de canais de ferro utilizando diferentes modificações da técnica de patch. Somos capazes de testar a resposta do canal a várias drogas em túbulos císticos e saudáveis.A monocamada de cistos recém-isolada pode ser utilizada para a imagem de cálcio intracelular. Esta técnica permite a triagem farmacológica e estudos funcionais da homeostase de cálcio intracelular em células císticas, que são meios importantes para descobrir novos tratamentos para a prevenção da doença renal policística. O cuidado com o sangue residual mostrará a abordagem cirúrgica utilizada para remover o sangue dos rins.Primeiro serão mostrados os procedimentos de isolamento do rim e dos cistos. Inicie este procedimento realizando uma laparotomia e lavando os rins com PBS através da aorta abdominal de uma rata anestesiada. Para isso, conecte um cateter de tubo de polietileno a uma bomba de seringa preenchida com PBS.Corte a pele e a parede abdominal ao longo da linha média abdominal e desloque os órgãos abdominais com cotonetes para obter acesso à aorta descendente com as artérias mesentérica e celíaca ramificadas. Em seguida, coloque a primeira ligadura ao redor das artérias mesentérica e celíaca e a segunda ligadura ao redor da aorta, abaixo do diafragma.Separar suavemente a aorta ADOS por dissecação romba, separando os tecidos conjuntivos ao seu redor com pinça. Em seguida, posicionar o terceiro laço cerca de três milímetros abaixo da artéria renal esquerda e o quarto laço acima da bifurcação das artérias ilíacas. Amarre o quarto laço e fixe um grampo vascular ao redor da aorta entre a artéria renal esquerda e o terceiro laço.Faça uma incisão entre o grampo e a quarta ligadura para cateterizar a aorta. Em seguida, use a terceira ligadura para fixar firmemente o cateter. Agora, solte o grampo.Certifique-se de que o pulso sanguíneo é visível no cateter para garantir a instalação adequada. Em seguida, inicie a perfusão e amarre a primeira e a segunda ligaduras. Depois disso, corte rapidamente a veia renal esquerda para aliviar a pressão.Continue a lavagem por um a dois minutos até que os órgãos fiquem completamente esbranquiçados. Em seguida, corte os vasos sanguíneos renais, a uretra e os tecidos conjuntivos e adiposos ao redor. Para remover os rins, faça um pequeno corte na cápsula renal e retire os rins para encapsulá-los.Em seguida, coloque os rins em PBS gelado. A seguir, prepare lâminas de vidro quadradas de cinco por cinco milímetros e de 25 por 25 milímetros recobertas com poli-L-lisina.Corte os rins com uma lâmina de barbear ao longo do plano frontal em fatias de um a dois milímetros de espessura. Em seguida, coloque uma das fatias sob um microscópio estereoscópico. Localize os cistos, que aparecem como cavidades arredondadas, utilizando pinças de ponta fina.Disseque a camada epitelial interna de um cisto o mais fina possível para obter uma área de monocamada. Em seguida, fixe-a em uma lamínula de vidro revestida com polilisina e posicione o cisto com o lado apical voltado para cima. Para permitir o acesso das pipetas para realização de eletrofisiologia, preencha a câmara do clamp de patch com solução de banho. Em seguida, transfira a lamínula de vidro com os tecidos isolados para a câmara.Selecione uma célula no monocamada epitelial e aproxime uma pipeta de patch de uma membrana típica. Em seguida, realize um experimento convencional de patch clamp no modo acoplado à célula. Neste procedimento, coloque os cistos isolados e túbulos divididos abertos em uma placa de três centímetros e meio contendo PSS, adicione flu de cinco micromolar, oito HD e ácido 0,05% ônico para ajudar a dispersar os acetatos de metila.Em seguida, proteja a amostra da luz e incube em agitador lento à temperatura ambiente por 30 a 40 minutos. Após a incubação, lave o meio de incubação com PSS limpo. Em seguida, posicione o tecido sob um microscópio confocal para realizar a imagem de fluorescência.Ligue o software de aquisição confocal. Em seguida, ligue o laser de argônio para 488 nanômetros de excitação e ajuste a emissão para 520 sobre 25 nanômetros. Depois, localize o tecido em campo claro posteriormente.Monitore a fluorescência do flu oh oito H na amostra de tecido com uma frequência de 0,25 hertz ou superior. Aplique TP ou outros moduladores farmacológicos para induzir um aumento na concentração de cálcio intracelular. São mostrados aqui traços de corrente representativos da atividade do canal de sódio epitelial medidos em gramicidas em células ligadas de cistos recém-isolados de ratos PCK de 16 semanas de idade após o tratamento com benzoil e água de beber por 12 semanas.As linhas tracejadas indicam respectivamente o estado atual com C e op n denotando os estados fechado e aberto. Este gráfico resume a atividade observada do canal de sódio epitelial, na qual a benzoil, um inibidor seletivo do canal de sódio epitelial, reduziu significativamente a atividade do canal de sódio epitelial. Este vídeo mostra o monocamada cística carregada com flu oh oito H antes e depois da aplicação de 10 micromolar de a TP. O aumento na intensidade do sinal fluorescente verde pode ser observado quando a concentração intracelular de cálcio aumenta em resposta à a TP. Este gráfico resume o efeito da a TP sobre os níveis de cálcio na célula.O monolayer de ratos PCK com aplicação de um TP causa um aumento rápido no nível de cálcio intracelular, que retorna ao nível basal em dois ou três minutos. Esta técnica oferece uma oportunidade única para monitorar alterações no fluxo de cálcio e na atividade do canal de ferro nos rins císticos. Além de caracterizar a atividade do canal de sódio celular e a entrada de cálcio em ratos PCK, esta abordagem pode ser utilizada para analisar outros canais de ferro em múltiplos modelos de A-R e A-D-P-K-D.

implementing-patch-clamp-live-fluorescence-microscopy-to-monitor

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Vamos demonstrar como estudar o efeito de uma única mutação de ponto na função de um canal iônico.

Mutagênese e Análise Funcional de canais iônicos Heterologously Expresso em células de mamíferos

Neste vídeo, demonstramos a visualização da translocação da PKC em células vivas usando PKCs fluorescente etiquetado.

Live-imagem de translocação da PKC em células Sf9 e em neurônios sensoriais Aplysia

Este vídeo descreve um método para obter imagens e registrar simultaneamente a atividade elétrica de fatias cerebrais transgênicas que contêm proteínas fluorescentes específicas de neurônios. O procedimento envolve a manutenção da fatia do cérebro em uma câmara de perfusão com líquido cefalorraquidiano artificial aerado, usando uma fonte de luz para excitar células marcadas com fluorescência e registrando os sinais elétricos com uma sonda multicanal e um grampo de remendo.

Monitoramento óptico e eletrofisiológico simultâneo de células neuronais em fatias cerebrais

Neste vídeo, culturas de células renais embrionárias que expressam proteínas de canal iônico dependentes de luz fundidas com um repórter fluorescente demonstram o efeito da luz no movimento iônico. O patch clamp de célula inteira é usado para monitorar o movimento de íons.

Eletrofisiologia Optogenética Registro de Células com Canais Iônicos Dependentes de Luz

Descrito aqui é um procedimento para a obtenção de longos trechos de gravação atual de um canal iônico com a técnica de patch-clamp anexado à célula. Este método permite observar, em tempo real, o padrão de open-close conformações dos canais que estão na base do sinal biológico. Estes dados informar sobre as propriedades dos canais nas membranas biológicas não perturbadas.

Um canal de gravação de patch-clamp anexado-Cell

Alterações nos níveis de cálcio intracelular nos podócitos são um dos meios mais importantes para controlar a função de filtração dos glomérulos. Aqui, explicamos uma abordagem de alto rendimento que permite a detecção do manuseio de cálcio em tempo real e da atividade de canais iônicos únicos nos podócitos dos glomérulos recém-isolados.

Single-channel Análise e cálcio Criação de imagem do Podócitos do recentemente isolados glomérulos

Um método para estimulação da atividade elétrica de culturas de células in vitro com luz visível é descrito.

Controle óptico de células vivas atividade elétrica por conjugados Polymers

Este artigo descreve como a seletividade iônica da channelrodopsina é determinada com registros eletrofisiológicos de patch-clamp de células inteiras usando células HEK293. Aqui, o procedimento experimental para investigar a seletividade de cloreto de uma channelrodopsina seletiva de ânions é demonstrado. No entanto, o procedimento é transferível para outras canalrodopsinas de seletividade distinta.

Full-cell Patch-clamp Gravações para determinação eletrofisiológica de Ion Selectivity em Channelrhodopsins

Apresentamos um protocolo que combina o isolamento celular e a gravação de grampos-grampos de células inteiras para medir as propriedades elétricas das células epiteliais dissociadas primárias dos epidídimos da cauda do rato. Este protocolo permite a investigação das propriedades funcionais das células epiteliais primárias epidídmicas para elucidar ainda mais o papel fisiológico do epidídimo.

Gravação de grampos-grampo de células inteiras de células epiteliais primárias isoladas do epidídimo

Este protocolo descreve como conduzir experimentos de grampos-grampos guiados por imagem usando um sistema desenvolvido recentemente para equipamentos de eletrofisiologia padrão in vitro .

Aplicação de correia de patch automatizada com guia de imagem para estudo de neurônios em fatias de cérebro

O objetivo deste protocolo é isolar regiões de marca-passo intactas da pelve renal do rato usando seção de vibratome. Essas seções podem então ser usadas para imagens in situ Ca2+ para elucidar propriedades transitórias ca2+ de células marcapassos e outras células intersticiais em fatias de vibratome.

Isolando e Imagens Ao Vivo, Regiões de Marcapasso Intacta da Pelve Renal do Rato por Vibratome Sectioning

Aprenda a técnica de grampo patch e microscopia de fluorescência para estudar canais iônicos e concentração de cálcio em epitélio cístico renal isolado de roedores. Este método permite analisar a função celular em doença renal policística.

Implementando Grampo patch e ao vivo microscopia de fluorescência para monitorar propriedades funcionais de recentemente isolados PKD Epithelium (Vídeo) | JoVE Journal

Implementando Grampo patch e ao vivo microscopia de fluorescência para monitorar propriedades funcionais de recentemente isolados PKD Epithelium

Explorar mais vídeos